基于荧光生物传感技术检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B

目的利用纳米金粒子(gold nanoparticles,AuNPs)荧光猝灭性能和核酸适配体的高亲和力,构建一种简便、灵敏的纳米金“Turn-on”型荧光生物传感方法检测牛奶中金黄色葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxins B,SEB)的方法。方法以AuNPs作为荧光体的能量受体(猝灭剂),荧光素-单链DNA(fluorescein-ssDNA,FAM-ssDNA)作为荧光能量供体,冷冻法制备AuNPs-SEB适配体复合物,基于AuNPsSEB适配体复合物/SEB/FAM-ssDNA的竞争性结合,构建纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测方法。对缓冲体系pH和反应时间等条件进行优化,以牛奶为代表对方法检测性能进行验证。结果在优化好的实验条件(pH 7.5、反应时间15 min和反应温度25℃)下,在10^(-1)~10^(4)ng/mL范围内,荧光强度与SEB质量浓度之间呈现良好的线性关系,其相关系数为0.995,检出限为0.062 ng/mL。应用于牛奶样品中SEB的测定,方法回收率为91.2%~108.0%,相对标准偏差在2.6%~5.2%范围之间。结论该纳米金“Turn-on”型荧光生物传感检测技术具有简便、灵敏和准确等优点,可为食品中污染物的检测提供一种可行的新方法。

不同剂量胸腺肽-α1在肠毒素B与脂多糖复合诱导小鼠脓毒症模型中的免疫干预作用研究

目的 模拟革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌混合感染,建立金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)和脂多糖(LPS)复合诱导的小鼠脓毒症模型,观察血清炎症因子及组织蛋白表达水平的变化,探讨不同剂量胸腺肽-α1(Tα1)对脓毒症的免疫干预作用.方法 选择SPF级健康雄性BALb/c小鼠 90 只,按随机数字表法将小鼠分为对照组、Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组,每组 30 只.采用向小鼠腹腔注射 300 μg/kg SEB和1000 μg/kg LPS的方法复制小鼠复合感染脓毒症模型.于腹腔注射SEB2h后,给所有小鼠腹腔注射LPS 1000 μg/kg的同时Tα1 小剂量组小鼠腹部皮下注射Tα1100 μg/kg,Tα1 大剂量组小鼠腹部皮下注射Tα12000 μg/kg,对照组给予等量磷酸盐缓冲液(PBS).观察并记录各组小鼠制模后 6h的体征表现.于制模后2、4、6 h取血分离血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组小鼠血清白细胞介素(IL-6,IL-10)、γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平;处死动物后留取脾脏组织,光镜下观察脾脏组织的病理学改变,采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)测定脾脏组织核转录因子-κB p65(NF-κB p65)的蛋白表达水平.结果 给药后 6 h,Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组小鼠精神活动、进食、寒战、呼吸、竖毛、大便等体征评分均较对照组明显降低[精神活动(分):1.20±0.42、1.10±0.31 比 2.70±0.48,进食(分):1.50±0.53、1.40±0.52比 2.60±0.70,寒战(分):1.20±0.42、1.30±0.48 比 2.30±0.48,呼吸(分):1.20±0.42、1.30±0.48 比 2.40±0.70,竖毛(分):1.40±0.52、1.20±0.42 比 2.60±0.52,大便(分):1.40±0.52、1.40±0.52 比 2.40±0.52,均P<0.05].随时间延长,各组IL-6、IL-10 逐渐降低,IL-10/IL-6 比值呈先降低后升高的趋势,IFN-γ呈先升高后降低的趋势;对照组TNF-α持续降低,脾脏组织NF-κB p65 的蛋白表达水平持续升高;Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组TNF-α呈先降低后升高趋势,脾脏组织NF-κB p65 的蛋白表达水平呈先升高后降低趋势.给药后 2h,Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组IL-6、IFN-γ、NF-κB p65 的蛋白表达水平均明显高于对照组[IL-6(μg/L):2439.63±3.46、2442.38±22.53 比 2281.47±27.97,IFN-γ(μg/L):47.37±4.69、50.16±7.50 比 40.24±8.64,NF-κB p65/β-actin:0.160±0.009、0.155±0.009 比 0.108±0.005,均P<0.05],IL-10、IL-10/IL-6 比值均明显低于对照组[IL-10(μg/L):82.30±17.00、70.89±8.25 比 214.71±110.43,IL-10/IL-6:0.034±0.007、0.029±0.003比 0.094±0.048,均P<0.05];给药后 2h起Tα1 小剂量组和Tα1 大剂量组TNF-α较对照组明显降低(μg/L:774.84±136.97、1068.88±279.99 比 2712.68±718.06),持续到给药后 6h(均P<0.05).病理学观察显示,肺组织光镜下可见对照组部分肺泡壁破坏、有肺间质出血现象,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组可见肺间质血管充血扩张,未见肺间质出血;肝组织光镜下可见对照组肝细胞水肿,颜色变淡,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组病变较轻;肾组织光镜下可见对照组肾间质血管充血,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组病变较轻;心肌组织光镜下对照组偶见血管扩张充血,Tα1 小剂量组及Tα1 大剂量组形态学表现基本正常.结论 Tα1 有利于改善SEB与LPS复合介导的脓毒症小鼠预后,增强脓毒症小鼠的免疫应答,但持续时间有限,提示Tα1 在混合感染的研究中应关注使用时机和疗程;Tα1 在SEB与LPS复合介导的脓毒症小鼠中的有效剂量范围较大,合适的应用剂量有待进一步研究.

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因的克隆和在大肠杆菌中高效表达

利用PCR方法从金黄色葡萄球菌TSTw基因组DNA中扩增出约 70 0bp的DNA片段 ,将之克隆到pGEM 7Zf(+)载体上并转化大肠杆菌DH5α菌株。重组质粒的测序结果表明克隆到了seb基因 ,它含有 717bp(不包括N端81bp的信号肽编码区 ) ,其核苷酸序列与文献报道完全一致。将其连接于表达载体 7ZTS上 ,转化到大肠杆菌JM10 9(DE3)内。表达的SEB占总蛋白 33.5 %。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的 :金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一 ,针对进出口食品卫生监测的需要 ,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法 :利用聚合酶链反应技术 (PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交 ,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对 ,来判断阴阳性结果。结果 :本方法检出率高 ,每克样品中有 4个金黄色葡萄球菌即可检出 ,2 4小时即可报告结果。结论 :PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确 ,检测周期短 ,既可提高检出率 ,又可节省检测时间。

霍乱弧菌肠毒素B亚单位基因在大肠杆菌和双歧杆菌的表达

目的构建霍乱弧菌肠毒素B亚单位(Cholera toxin B subunit,CTB)基因的大肠杆菌表达重组质粒,并观察其在大肠杆菌和双歧杆菌中的表达。方法从pBI121质粒PCR扩增获得CTB基因片断,克隆到大肠杆菌载体pGEX-4T-1上,构建重组质粒,然后转化大肠杆菌DH5α和双歧杆菌。转化菌经IPTG诱导,然后用SDS-PAGE和Western blot方法鉴定表达的重组蛋白。结果构建了重组质粒pGEX-4T-CTB,CTB基因片段分子量约为376bp;在大肠杆菌中表达出35kD的霍乱弧菌B亚单位融合蛋白,经SDS-PAGE分析,相对分子量与文献相符,表达的蛋白约占细菌总蛋白的10%;在双岐杆菌中也能得到正确表达,表达量较大肠杆菌低,占细菌总蛋白约5%。Western blotting结果确认了该条带为CTB基因的产物。结论构建的重组质粒pGEX-4T-CTB能够在大肠杆菌及双歧杆菌中获得表达。

霍乱肠毒素B亚单位在转基因番茄中表达的研究

将霍乱肠毒素 B亚单位 (CT-B)基因及内质网引导序列 (SEKDEL)克隆到质粒 p RTL2和 p BI1 2 1中 ,分别构建植物双元表达载体 p BI-CTB和 p BI-CTBK,CT-B基因由 Ca3 5 S启动子控制表达 .采用叶盘法经根癌农杆菌介导转化番茄 (金丰 1号 ,Jinfeng1 ) ,各表达载体得到一批转基因植株 .经 PCR和 Southern blot分析表明 CT-B基因整合到了番茄基因组中 ;ELISA和 Western blot分析表明 p BI-CTB和 p BI-CTBK的转基因植株能够有效表达 CT-B多肽 ,分别占番茄叶片可溶性蛋白的 0 .0 5 5 %和 0 .0 84% .

夹心免疫PCR方法检测金葡菌肠毒素B

目的 建立双抗夹心免疫PCR的检测技术 ,用于检测极微量的抗原。方法 以亲和素作为连接分子 ,连接生物素化抗体和生物素化DNA ,应用于免疫PCR中检测极微量金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)。结果 双抗夹心免疫PCR的检测技术 ,检测SEB的灵敏度达 0 1ng/L ,与夹心ELISA方法比较灵敏度高 10 3 倍。结论 双抗夹心免疫PCR系统灵敏度高 ,可用于各种微量抗原的检测。

大肠杆菌耐热肠毒素b及其致动物腹泻的机理

介绍了大肠杆菌耐热肠毒素b(STb)的编码基因、理化性质、免疫学特征、分泌特征、毒性相关氨基酸残基、空间结构、膜受体以及STb致动物腹泻的机理。认为STb是一种十分重要的肠毒素,应进一步加强对STb及其致腹泻机理的研究。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。

热不稳定大肠杆菌肠毒素B亚单位免疫调节功能的实验研究

目的 :探讨大肠杆菌热不稳定肠毒素B亚单位 (LTB)的免疫调节功能及其可能的机制。方法 :用SephacrylS 10 0凝胶柱层析纯化LTB蛋白。选用BALB/c小鼠 ,以鸡溶菌酶 (HEL)为抗原 ,经鼻黏膜单独免疫 ,或以不同剂量的LTB为佐剂与HEL共免疫。用ELISA法检测血清和肠分泌液中HEL特异性抗体的水平。用3 H TdR掺入法 ,体外测定LTB蛋白对刀豆蛋白A(ConA)及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应的影响。结果 :HEL单独免疫组血清中仅有弱的抗HELIgG ,未检测到抗HELIgA ,且其肠分泌液中亦未见HEL特异性IgA抗体。但加用LTB佐剂的 3个组 ,其血清中抗HELIgG、IgA的水平及肠分泌液中抗HELIgA的水平均显著高于HEL单独免疫组 (P <0 .0 0 1)。体外实验显示 ,LTB可明显抑制ConA及同种异体抗原介导的淋巴细胞增殖反应。结论 :我们制备的LTB蛋白对免疫系统具有双向的调节功能 ,既可作为有效的黏膜佐剂 ,辅佐外来抗原刺激机体产生黏膜免疫应答 ,又具免疫抑制效应 ,有效地抑制淋巴细胞活化。LTB免疫调节功能的发挥 。

小肠结肠炎耶尔森菌耐热性肠毒素B基因(ystB)初步研究

目的研究小肠结肠炎耶尔森菌的耐热性肠毒素B基因(ystB)的分布特征。方法通过聚合酶链反应(PCR)、DNA探针杂交方法与序列分析检测致病性和非致病性小肠结肠炎耶尔森菌携带ystB基因的情况。结果98株非致病性小肠结肠炎耶尔森菌中52株携带ystB基因,占53.06%。全部48株致病性小肠结肠炎耶尔森菌均不携带该基因。结论ystB基因仅存在于部分生物1A型非致病性小肠结肠炎耶尔森菌,而不存在于致病性菌株中。

红细胞在葡萄球菌肠毒素B刺激人PBMC增殖中的辅佐作用

通过葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激人外周血淋巴细胞增殖,对完整红细胞及红细胞膜能否在提呈抗原中起辅佐作用进行了研究,并与单核细胞的辅佐作用进行了对比。结果显示,在SEB刺激去除单核细胞的人外周血淋巴细胞中,分别加入红细胞、红细胞膜碎片或单核细胞后,淋巴细胞增殖均有明显升高(P<0.01)。当同时加入红细胞和单核细胞时,淋巴细胞增殖的幅度略高于单独加入红细胞或单核细胞组。提示红细胞具有与单核细胞作用类似而机理不同的辅佐作用。

金黄色葡萄球菌肠毒素B的基因克隆与表达

目的克隆葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,表达并纯化基因重组SEB,并对其进行活性研究。方法采用PCR技术从金黄色葡萄球菌染色体DNA上扩增得到SEB基因,克隆到原核表达载体pET22b(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,全自动测序仪测序。IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,用HiTrapTMchelating HP柱纯化重组表达的SEB,通过ELISA实验检验重组SEB的抗原性。用脂多糖和放线菌素D致敏小鼠模型检测重组SEB的毒性。结果所克隆的SEB基因核苷酸序列与报道的序列完全相同。表达的SEB在SDS-PAGE图谱的位置与预期相符,得到了SDS-PAGE电泳纯的基因重组SEB。ELISA试验结果表明,纯化的重组SEB与抗野生型SEB单克隆抗体呈现明显的阳性免疫反应。小鼠致死性试验表明,重组SEB与野生型SEB具有相同的毒性。结论在大肠杆菌中成功克隆及表达了金黄色葡萄球菌肠毒素B,为进一步分析SEB分子中相关活性位点及研究SEB发病机制打下了基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素B对豚鼠哮喘模型Th1/Th2细胞因子的影响

目的研究金黄色葡萄球菌肠毒素B(Staphylococcal Enterotoxin B,SEB)对豚鼠支气管哮喘(简称哮喘)模型气道炎症及Th1/Th2细胞因子的影响。方法27只豚鼠随机分为对照组,模型组,SEB组各9只,用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型。末次激发豚鼠24-48 h内处理,支气管肺泡灌洗,直接记数总白细胞和嗜酸性粒细胞,观察肺组织病理改变,分装冻存支气管肺泡灌洗液做细胞因子检测。结果SEB组豚鼠肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量为(2.6±0.64)×106,显著低于模型组的(13.0±1.8)×106(P<0.01);肺组织哮喘炎症反应也轻于模型组;SEB组肺泡灌洗液中Th1细胞因子IFNγ-浓度(126.41±5.17)pg/mL,高于模型组(86.52±5.10)pg/mL(P<0.05);而Th2细胞因子IL-4浓度(50.02±2.79)pg/mL低于模型组(78.30±3.88)pg/mL(P<0.05)。结论SEB能减少哮喘豚鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞数量,可以通过调节Th1/Th2细胞因子的比值来减轻气道哮喘炎症反应。

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的分泌表达与性质鉴定

目的 较高效率分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位并鉴定其性质。方法 将编码成熟大肠杆菌不耐热肠毒素 (LTB)的基因引入pET2 2b(+)并转化E .coliBL2 1(DE3) ;重组工程菌在改良M9 CAA培养基内进行表达 ;对分泌表达的LTB进行纯化后进行神经节苷脂 (GM1)结合活性、免疫原性与黏膜免疫佐剂活性的鉴定。结果 LTB既能分泌表达至胞周质又能以包含体形式表达 ,两者都与pelB信号肽准确分离。纯化出的LTB具有正常的GM1结合活性、免疫原性及黏膜免疫佐剂活性。结论 pET2 2b(+)质粒的pelB信号肽可使LTB以较高效率分泌表达。

乳品中金黄色葡萄球菌肠毒素B免疫传感检测方法的研究

本文利用自制的金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)抗体构建了一种L-半胱氨酸和纳米金的双层自组装免疫传感器,采用循环伏安法及交流阻抗法对传感器进行表征与测定,并对各项相关条件进行优化,最终建立了SEB检测的标准曲线,线性范围分别在2～10 ng/mL和10～100 ng/mL,相关系数分别为0.9939和0.9926,检出限(S/N=3)为0.667 ng/mL,乳品检测回收率在84.3%～93.2%之间。该传感器特异性良好,稳定性好,可再生使用,可应用于乳品中SEB的快速检测。

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因在大肠杆菌中的克隆及表达

目的扩增金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)基因,构建其原核表达载体,并进行诱导、表达,为其应用研究奠定基础。方法根据GenBank中SEB的基因序列,设计一对分别含BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的特异性引物,以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切,并与做相应酶切的pET-28α(+)连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定及测序,用IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot印迹鉴定表达产物。结果成功扩增出SEB基因,基因大小为801bp,重组PET-28α(+)-SEB双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示SEB在正确读框中,序列比对分析显示其与相关报道核苷酸序列一致性达99%。经IPTG诱导后,pET-28α(+)-SEB/BL21在相应的相对分子质量(35×103)可见融合蛋白以包涵体形式表达,免疫印迹在相应分子量检测到目的蛋白。结论克隆了SEB基因,并成功在大肠杆菌BL21中以包涵体形式表达,为肠毒素B应用研究奠定了基础。

PCR技术检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因

目的:金黄色葡萄球菌B型肠毒素是污染食品引起食物中毒的主要原因之一,针对进出口食品卫生监测的需要,研究一种简便、快速、准确的实验方法。方法:利用聚合酶链反应技术(PCR)采用特异的模板探针引物进行杂交,最后通过电泳技术与阳性对照进行比对,来判断阴阳性结果。结果:本方法检出率高,每克样品中有有4个金黄色葡萄球菌即可检出, 24h即可报告结果。结论:PCR方法检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素B基因快速、准确,检测周期短,既可提高检出率,又可节省检测时间。

利用表面等离子体谐振技术检测金黄色葡萄球菌肠毒素B

本文研究了利用自行研制开发的表面等离子体谐振 (SPR - 2 0 0 0 )生化分析仪检测金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)与其羊单克隆抗体IgG的免疫吸附反应 ,并研究了用SPR技术检测生物大分子相互识别反应相关的一些问题。为了消除溶液间本体折射率差异的影响 ,我们采用牛血清白蛋白 (BSA)本体折射率补偿法 ,使通入流动系统的不同溶液获得基本一样的本体折射率 ,获得了很好的效果。在此基础上 ,SPR - 2 0 0 0生化分析仪初步实验已经能检测到的SEB最低浓度是 1μg/ml,相当于 3 5× 10 -8M。进一步的实验仍在进行中。

重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达条件的优化及其佐剂作用

目的优化重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的表达条件,并检测其黏膜佐剂作用。方法通过向LB培养基中添加葡萄糖(终浓度为0.5%)、低温培养诱导等方法诱导LTB的表达;采用阳离子交换法对目的蛋白进行纯化;以LTB作为佐剂进行免疫试验。结果可溶性重组大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)的表达量明显提高,纯化后蛋白含量达95%以上,经纯化的LTB作为三价流感裂解疫苗或gD抗原的佐剂免疫BALB/c小鼠,可提高小鼠血清及黏膜的抗体水平,且其效果与铝化剂及福氏佐剂相当或更高。结论优化了LTB的表达条件,且表达的LTB具有较强的黏膜免疫佐剂作用。