牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C含量的两种发光检测方法比较

目的 比较均相光激化学发光检测法(AlphaLISA)和磁微粒化学发光检测法(MP-CLIA)在检测牛奶模拟样本中金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)含量的敏感性和精确性。方法 以山羊抗SEC多克隆抗体偶联受体微球、生物素标记的SEC单克隆抗体和链霉亲和素偶联的供体微球,构建AlphaLISA检测体系;以山羊抗SEC多克隆抗体偶联碱性磷酸酶、生物素标记的SEC单克隆抗体和链霉亲和素偶联磁珠,构建MP-CLIA检测体系。结果 AlphaLISA检测牛奶模拟样本中SEC含量的灵敏度为4.04 ng/L,变异系数(CV)为1.98%~9.82%;MP-CLIA的灵敏度为108.19 ng/L,CV为4.63%~20.40%。结论 与MP-CLIA相比,AlphaLISA检测牛奶模拟样本中SEC含量的敏感性和精确性更高。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的纯化与活性研究

目的:研究金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)的活性与病情的关系,进一步探索其在金黄色葡萄球菌感染中的作用机制。方法:选取2021年1月—2022年12月东莞市滨海湾中心医院收治的肠道感染患者30例作为研究对象。使用传统的培养方法从粪便样本中分离出金黄色葡萄球菌。使用离心技术获得细菌培养物,进一步纯化金黄色葡萄球菌SEC2。结果:金黄色葡萄球菌SEC2在经过一系列纯化步骤后,获得了高纯度的样品。从发酵液到超滤浓缩再到硫酸铵盐析、离子交换以及分子筛层析的过程中,目的蛋白质的含量逐渐减少,但蛋白质的纯度逐步提高。结论:金黄色葡萄球菌SEC2是金黄色葡萄球菌感染中的病原因子。通过成功纯化高纯度的SEC2样品,证实其具有明确的质量和结构特征,进一步证实了SEC2在金黄色葡萄球菌感染中的重要性。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2的基因克隆、表达及其生物学活性

利用PCR技术从金黄色葡萄球菌的基因组DNA中克隆SEC2全长基因,PCR产物与pGEM-T载体连接,经测序证实后进行亚克隆,构建其表达载体pET-28a-SEC2,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达成熟重组蛋白(rSEC2),纯化rSEC2蛋白并对其生物学活性进行研究. 结果表明:成功克隆了SEC2全长基因,测序证实该基因共717 bp,编码239个氨基酸,与GenBank中收录的SEC2成熟蛋白质序列完全一致,SEC2基因登录GenBank(Accession number:AY450554);构建了SEC2的表达载体pET-28a-SEC2,并在大肠杆菌BL21(DE3)中得到高效可溶性表达,可溶性的rSEC2经Ni2+亲和层析纯化达到电泳纯,纯化的rSEC2蛋白经蛋白质印迹检测,并能有效刺激人外周血单个核细胞的增殖,被rSEC2刺激的外周血单个核细胞在体外对肿瘤细胞的生长有显著的抑制作用.

一种快速分离纯化金葡萄球菌肠毒素C_2的方法

目的建立一种简单快捷的方法,用来从金黄色葡萄球菌的发酵液(以下简称金葡液)中纯化分离肠毒素C2(staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)。方法金葡液首先经超滤浓缩,之后再分别经阳离子交换层析和阴离子交换层析进行选择性分离SEC2,用SDS-PAGE电泳、HPLC法检测纯度及相对分子质量,飞行质谱测定精确分子质量,对其进行N-端氨基酸序列分析。结果分离得到的SEC2电泳纯及色谱分析纯度均达到质量分数98%以上,经各项理化指标检测均与文献一致,在等电点上表现出微不均匀性,等电点pI为7.49和6.74,该蛋白的分子质量为27.58 ku,N-端氨基酸序列分析与文献报道的SEC2序列一致(ESQPDPTPDELHKSS),最大吸收波长为277.5 nm。结论用该方法得到的SEC2纯度高,回收率质量分数高达50%,适宜于大批量制备SEC2。

金葡菌肠毒素C2的单克隆抗体制备、鉴定及初步应用

目的：制备抗金葡菌肠毒素C2（SEC2）的单克隆抗体（MeAb），并建立SEC2检测方法。方法：以金葡菌培养液中纯化的SEC2为抗原，免疫BALB／c小鼠，制备单克隆抗体；并对单克隆抗体的特性进行鉴定；利用纯化后的抗体建立了夹心ELISA定量检测SEC2方法，并进行了验证和初步应用。结果：筛选出4株稳定分泌抗SEC2抗体的杂交瘤细胞株，其免疫球蛋白亚类均为IgG1，除两株单抗的SEC2识别位点相同外，其余单抗均特异性识别SEC2的不同结合位点。建立的夹心ELISA定量检测法，特异性、灵敏度、重复性均较好，检测SEC2范围为0．5—20ng,／ml，回收率在97．8％-101％，变异系数为2％-5％。结论：本研究制备的抗SEC2的单克隆抗体，可用于建立了SEC2定量检测方法，为控制金葡素制品质量和金葡菌肠毒素研究提供了较实用的方法。

PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的研究

目的建立一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素C的快速敏感PCR方法。方法根据金黄色葡萄球菌肠毒素C基因编码序列,设计1对PCR引物来特异性扩增靶基因片段,片段长度为600 bp,通过对1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株和5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株进行检测来评价该方法的特异性;对金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株做一系列10倍稀释后进行PCR检测,并对其进行敏感性分析,对PCR扩增产物进行电泳和测序鉴定。结果1株金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应呈阳性,5株非金黄色葡萄球菌产肠毒素C菌株PCR扩增反应为阴性;通过基因测序证实了PCR产物的特异性;PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素C基因的检测下限为1.5×102cfu/ml。结论本研究建立了一个快速、特异、敏感的金黄色葡萄球菌肠毒素C基因PCR检测方法。

PCR法检测食源性金葡菌肠毒素C基因

目的建立快速检测葡萄球菌肠毒素C基因（staphylococcal enterotoxin C，SEC）PCR方法。方法根据SEC基因的序列，设计特异性PCR引物，建立扩增体系，琼脂糖凝胶电泳检测扩增的靶基因片段。通过分析产SEC菌株和对照菌株PCR产物，评价方法的特异性；通过对产SEC金黄色葡萄球菌定量样本系列稀释后进行PCR检测，分析方法的敏感性；并运用该方法分析实验室既往检出的30株金黄色葡萄球菌SEC基因的携带情况。结果建立了金黄色葡萄球菌SEC基因PCR快速检测方法，该法PCR扩增产物长度为490bp，未见假阳性结果，特异度良好；灵敏度较高，反应体系中有32cfu的产SEC金黄色葡萄球菌即可检出；30株本地分离的金黄色葡萄球菌SEC基因携带率20％。结论PCR法可以快速、敏感地检测SEC基因，是金黄色葡萄球菌食物中毒诊断可以利用的有效工具。

金黄色葡萄球菌肠毒素C_2对兔骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化的实验研究

目的观察不同浓度金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)对体外兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的诱导分化作用。方法以梯度密度离心法获得rBMSCs并通过激光共聚焦对细胞进行形态学鉴定后传代培养,分别应用1、10、100、500μM SEC2处理细胞,检测各组细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞的增殖情况;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测骨桥蛋白和胶原蛋白的基因表达。结果 rBMSCs在应用SEC2诱导时,随着浓度的增加,rBMSCs的增殖逐渐被抑制,其中100μM SEC2共培养细胞增殖情况明显高于对照组(P<0.01);应用100μM SEC2诱导rBMSCs 16d后,成骨诱导检测茜素红染色可见矿化和钙沉积;同时进行RT-PCR检测,随着培养时间的延长,骨桥蛋白(Osteopontin)和胶原蛋白-1(Collagen I)有明显上调趋势,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 SEC2能够使rBMSCs成骨分化,分化的效果与肠毒素剂量及诱导时间相关。

金黄色葡萄球菌肠毒素C的原核表达、纯化及活性鉴定

目的:在大肠杆菌中表达金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC),并对其活性进行检测。方法:以金黄色葡萄球菌基因组为模板扩增SEC基因,经测序正确后插入原核表达载体pBV220中,转化大肠杆菌DH5α后温度热诱导重组SEC表达;表达产物经阳离子柱纯化后,用ELISA鉴定其抗原性;通过观测表达产物对鼠脾淋巴细胞的刺激增殖情况,检测其超抗原活性。结果:构建了SEC-pBV220原核表达载体,在大肠杆菌中可快速、高效表达SEC蛋白,表达产物具有超抗原活性。结论:实现了SEC的原核表达。

葡萄球菌肠毒素C基因的克隆表达及其生物学活性鉴定

为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法。此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性。结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础。

肠毒素C2第20和22位氨基酸对其超抗原活性的影响

目的:揭示突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性较野生型SEC2显著增强的潜在机制。方法:WST-1法检测突变蛋白SEC2(T20L/G22E)在体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性,进一步应用流式细胞术和荧光定量PCR技术分别检测CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖、特异性VβT淋巴细胞增殖以及相关细胞因子mRNA丰度变化。结果:与野生型SEC2相比,突变蛋白SEC2(T20L/G22E)能够在体外显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,但二者具有相似的特异性VβT淋巴细胞增殖谱,并且SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多携带有Vβ5.3、Vβ8.1及Vβ8.3的T淋巴细胞;进一步体内实验发现SEC2(T20L/G22E)能够较rSEC2激活更多外周血和脾脏中CD4+和CD8+T淋巴细胞增殖及相关细胞因子的表达。结论:突变蛋白SEC2(T20L/G22E)超抗原活性增强的机制可能是用亮氨酸和谷氨酸替代原来20和22位上的氨基酸后提高了SEC2(T20L/G22E)与特异性TCR-Vβ的亲和力,进一步激活更多的SEC2特异性T淋巴细胞,最终引起T淋巴细胞亚型的显著性增殖,同时诱导更多与抗肿瘤、增殖相关的细胞因子的表达。

葡萄球菌肠毒素C对胶质瘤的作用

目的：观察经葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxin C，SEC）活化的淋巴细胞对胶质瘤的体外杀伤作用，并观察SEC联合手术、放疗、化疗对胶质瘤的治疗效果及SEC诱导生成细胞因子作用。方法：常规分离并培养外周血淋巴细胞，其中加入不同浓度的SEC（2．5、5、10、20U／mL），将淋巴细胞和胶质瘤细胞（SHG-44、MGR2、MGR3、SF767、SF295、SKMG-1、T98G及UW28）混合培养，按MTT法测定淋巴细胞对瘤细胞的杀伤作用。37例胶质瘤患者，均经手术切除，结合放疗、化疗，随机分为对照组、处理A组（全身应用SEC）及处理B组（局部应用经SEC活化的淋巴细胞），结合颅脑CT片观察疗效。采用ELISA法测定SEC促淋巴细胞分泌IL-6、IL-12、TNF—α及IFN-γ作用。结果：经SEC活化的淋巴细胞对8株胶质瘤细胞均产生强大的杀伤作用，其中以10U／mL剂量组作用最明显。临床资料显示对照组有效率为40％，处理A组及处理B组有效率分别为50％及62．5％。经SEC活化的淋巴细胞在作用的第1天就分泌多种细胞因子，第3～5天达峰值。结论：SEC作为一种超抗原，体外实验证实被其活化的淋巴细胞对胶质瘤有明显的抗瘤活性，并能大量分泌IL-6、IL-12、TNF-α及IFN-γ等多种细胞因子。SEC与手术、放疗、化疗结合能明显提高临床疗效。

葡萄球菌肠毒素C2突变体的构建及其体外抗肿瘤活性分析

目的：利用基因定点突变的方法将葡萄球菌肠毒素C2（SEC2）的31位定点突变,以获得抑瘤效果增强的肠毒素。方法：利用基因定点突变的方法,将SEC2中31位的His用Asn替代,转入大肠杆菌中诱导表达,采用CM弱阳离子层析柱纯化蛋白,并用SDS-PAGE和Western印迹对其进行鉴定,通过MTS法检测其体外抗肿瘤活性。结果：构建了突变体蛋白SEC2（H31N）,并在大肠杆菌中实现了高效表达。体外实验表明,在相同浓度下,SEC2（H31N）对多种肿瘤细胞的抑制作用明显优于野生型SEC2,尤其在低浓度下此现象更为明显。对于5个受试细胞株,SEC2（H31N）的IC50均低于SEC2;SEC2（H31N）浓度分别为0.01~10、0.01和0.1 ng/mL时,对肿瘤细胞SMMC-7721、HepG2、A549的生长抑制率与SEC2相比均显著提高。结论：同野生型SEC2相比,突变体蛋白SEC2（H31N）对肿瘤生长的抑制作用得到了提高。

金黄色葡萄球菌肠毒素C2基因定点突变分析

目的利用金黄色葡萄球菌肠毒素C2(SEC2)基因His118定点突变,以获得超抗原性保持不变的减毒肠毒素。方法利用PCR介导的定点突变技术,对SEc2基因中的His118密码子进行定点突变,得到的带有突变基因的表达质粒在大肠埃希菌中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导其表达。采用镍离子金属整合(Ni-NTA)亲和层析和凝胶过滤层析纯化突变体蛋白,并测定突变体蛋白超抗原性及体外抑瘤效果。结果应用点突变试剂盒,PCR扩增得到SEc2突变体表达质粒pET-28a-SEC2(H118Y)在1mmol/LIPTG诱导下高效表达。突变体蛋白SEC(H118Y)在2～200 ng时刺激人体细胞增殖效果与SEC2基本一致,体现二者具有相同的超抗原性。SEC(H118Y)时,在2～200 ng与SEC2抑制大肠癌细胞Cx-1效果基本相同,而在500 ng时,SEC(H118Y)抑瘤效果明显优于与SEC2。结论SEC(H118Y)超抗原性和抑瘤活性没有因His118位点的突变而改变。

金黄色葡萄球菌肠毒素C及其突变体在抗肿瘤和骨科治疗中的应用进展

金黄色葡萄球菌肠毒素C(SEC)是一种由金黄色葡萄球菌产生的超抗原,具有强大的T细胞活化增殖能力,中国SEC生物制剂(金葡素注射液)应用于临床抗肿瘤及骨科疾病的治疗。但SEC作为一种天然肠毒素,具有一定的免疫毒性,可导致发热、呕吐、腹泻等不良反应,一定程度上限制了金葡素注射液的临床应用。为提高SEC的超抗原特性,减少毒性,现已开发出多种SEC突变体蛋白,未来可生产出更安全、高效、低毒性或无毒性的生物制剂,扩大SEC的临床应用范围,治疗更多疾病。

金黄色葡萄球菌肠毒素C3过表达慢病毒载体的构建及鉴定

目的：构建金黄色葡萄球菌肠毒素C3（SEC3）过表达慢病毒载体并体外检测其表达目的基因。方法：聚合酶链反应（PCR）扩增SEC3基因片段;用Age I酶切线性化GV365慢病毒载体,通过连接反应构建GV365-SEC3载体,运用PCR方法鉴定阳性克隆载体;转染293T细胞包装慢病毒,观察细胞荧光及Western blot检测慢病毒载体表达,HIV-1 p24 ELISA法测定慢病毒载体滴度。结果：获得目的基因,并成功构建GV365-SEC3慢病毒载体,通过PCR及DNA测序鉴定,证明GV365-SEC3质粒构建正确;转染293T细胞后可观察到大量荧光细胞,经蛋白电泳得到29 k D大小的蛋白条带,与目的基因蛋白相符合,ELISA检测病毒载体滴度为5×10~8TU/ml。结论：成功构建GV365-SEC3过表达慢病毒载体,为后期研究其体内外对抗肿瘤的作用与机制奠定基础。

金黄色葡萄球菌肠毒素C促进异基因骨髓移植小鼠早期T细胞重建

目的通过建立异基因骨髓移植(allogeneic bone marrow transplantation,allo-BMT)小鼠模型联合腹腔给药,探讨金黄色葡萄球菌肠毒素C(staphylococcal enterotoxin C,SEC)对allo-BMT小鼠的T细胞早期重建的影响。方法以BALB/C雄性小鼠为受鼠,C57BL/6雄性小鼠为供鼠,在移植前12 h对受鼠进行全身性照射的预处理,进行异基因骨髓内骨髓移植(intra-bone marrow bone marrow transplantation,IBM-BMT)后将其随机分为两组腹腔给药。实验组给予SEC 100μL/(g·d),对照组给予同剂量的生理盐水,每组10只。每天检测受鼠的体质量变化情况,并于移植2周后应用流式细胞仪检测两组外周血及脾脏T淋巴细胞重建情况,采用ELISA检测血浆IFN-γ、IL-2、TNF-α的分泌水平。结果实验组、对照组外周血CD8^+T细胞比例(12.63±1.33)%、(6.67±0.53)%,组间差异有统计学意义(P <0.01)。实验组脾脏和外周血的CD4^+T细胞比例分别为(1.798±0.110)%、(1.470±0.075)%,高于对照组(1.418±0.069)%、(1.112±0.064)%,差异有统计学意义(P <0.05)。实验组血浆中分泌的细胞因子IFN-γ、IL-2和TNF-α水平分别为(383.7±49.22)pg/mL、(17.49±1.434)pg/mL和(144.9±14.38)pg/mL,高于对照组(230.0±13.17)pg/mL、(12.38±0.759)pg/mL和(102.0±7.58)pg/mL,组间差异有统计学意义(P <0.05)。结论腹腔注射SEC能有效促进移植后T细胞早期重建。

四甲基偶氮唑蓝法测定肠毒素C活性初步研究

目的：探讨四甲基偶氮唑蓝（MTT）法替代升白实验测定肠毒素C（SEC）活性。方法：采用小鼠脾T淋巴细胞增殖试验，用MTT法对20批样品进行脾T淋巴细胞增殖活性测定，在酶联免疫仪上检测吸光度，与空白组比值作为生物活性标准指数。结论：MTT法可靠性、重复性好，易操作，适合替代升白实验作为高聚生的生物活性检测方法。

金黄葡萄球菌肠毒素C3基因的克隆及原核表达

目的克隆并原核表达金黄葡萄球菌肠毒素C3(SEC3)基因。方法以金黄葡萄球菌基因组DNA为模板,扩增SEC3基因中编码成熟蛋白的基因片段,克隆至pET-32a(+)表达载体,构建重组表达质粒SEC3-pET-32a,转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果经PCR扩增获得720bp的SEC3基因;重组表达质粒构建正确;表达产物的相对分子质量约为43000,为可溶性表达;纯化的重组蛋白具有良好的反应原性。结论已成功克隆并原核表达了SEC3基因,为单克隆抗体和诊断试剂的制备及SEC3抗毒素的研制提供了材料。

增强型金黄色葡萄球菌肠毒素C2突变体及其超抗原活性

金黄色葡萄球菌肠毒素C2(Staphylococcal enterotoxin C2,SEC2)作为一种超级抗原蛋白,极微量即可有效激活机体免疫系统,这一特性可应用于对肿瘤和感染性疾病的辅助治疗。为了增强SEC2的超抗原活性,应用over-lap PCR方法将SEC2中的102～106位GKVTG氨基酸残基分别突变为WWH、WWT和WWP,获得3种突变体ST-1、ST-2和ST-3。三种突变体刺激小鼠淋巴细胞增殖活性和肿瘤细胞生长抑制活性与野生型SEC2相比均有显著提高。ST-1和ST-3的致热活性与野生型SEC2相当,而ST-2的致热活性明显高于野生型SEC2。此外,三种突变体体外刺激淋巴细胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α的水平也显著提高,这可能是导致突变体具有较高肿瘤细胞生长抑制活性的原因。进一步实验发现,三种突变体刺激下,小鼠脾淋巴细胞mVβ8.2基因的转录水平较野生型SEC2显著增加,暗示突变体对TCR mVβ8.2分子亲和力的提高,可能是其超抗原活性增强的主要原因。