金黄色葡萄球菌类肠毒素K对T淋巴细胞活化特点及抗肿瘤活性研究

目的:探究金黄色葡萄球菌类肠毒素K(SElK)对T淋巴细胞活化的影响,分析其体内外抗肿瘤活性,为进一步研究SElK生物学活性提供理论基础与技术保障,促进SElK在临床肿瘤治疗中的应用。方法:流式细胞术检测SElK刺激小鼠脾CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞增殖及对脾淋巴细胞凋亡的影响;qPCR检测经SElK刺激48 h后小鼠脾淋巴细胞中IFN-γ、颗粒酶A和B基因表达,以及SElK刺激后人外周血单核细胞(PBMCs)中具有特异性TCR Vβ的T淋巴细胞增殖谱变化;MTT法检测SElK激活的人PBMCs对人乳腺癌肿瘤BT474细胞及人肺癌A431细胞增殖的影响;成功制备小鼠肿瘤模型后,尾静脉注射SElK,实验结束时处死小鼠,分离肿瘤组织,检测肿瘤抑制效果。结果:SElK刺激后可显著提高小鼠脾CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞百分比,有效降低脾淋巴细胞凋亡率,显著提高小鼠脾淋巴细胞IFN-γ、颗粒酶A和B基因表达,显著激活携带TCR Vβ5、17和20的人T淋巴细胞,尤其是携带TCR Vβ5的人T淋巴细胞;SElK在体内外均表现出明显的抗肿瘤活性。结论:SElK可通过活化T淋巴细胞促进细胞因子分泌,进而发挥其抗肿瘤活性。

槲皮素对产肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪肠上皮细胞凋亡和焦亡信号通路的影响

本试验旨在研究槲皮素(Que)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪肠上皮细胞损伤、炎症反应、凋亡和焦亡信号通路的影响。试验以猪肠上皮细胞IPEC-1为研究对象,分为4组:对照组、Que组、ETEC K88组、Que+ETEC K88组。用0或10μmol/L Que处理细胞24 h后,再用磷酸盐缓冲液(PBS)或50倍细胞数的ETEC K88刺激细胞2 h,收集样品测定细胞活力、细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性、细胞中炎性因子含量、细胞凋亡和焦亡信号通路相关基因的mRNA表达水平。结果显示:1)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞活力的下降和细胞上清液中LDH活性的上升(P<0.05)。2)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞中炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量的上升(P<0.05)。3)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞凋亡信号通路相关基因凋亡相关因子配体(FasL)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(Caspase-9)、B细胞淋巴瘤-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达水平的上升和B细胞淋巴瘤-xL(Bcl-xL)的mRNA表达水平的下降(P<0.05)。4)Que显著缓解了ETEC K88诱导的细胞焦亡信号通路相关基因含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)、IL-18、消皮素D(GSDMD)和NLR家族CARD结构域4(NLRC4)的mRNA表达水平的上升(P<0.05)。综上所述,Que可抑制ETEC K88刺激导致的IPEC-1细胞凋亡和焦亡信号通路的激活,缓解细胞损伤。

原儿茶酸对肠毒素大肠杆菌K88诱导的猪小肠上皮细胞程序性坏死和Toll样受体4信号通路的影响

本试验旨在研究原儿茶酸(PCA)对肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)诱导的猪小肠上皮细胞(IPEC-1细胞)程序性坏死和Toll样受体4(TLR4)信号通路的影响。试验采用2×2因子设计,分为4个组:对照组、PCA组(40μmol/L PCA作用24 h)、ETEC K88组(50倍细胞数ETEC K88作用2 h)和PCA+ETEC K88(40μmol/L PCA作用24 h+50倍细胞数ETEC K88作用2 h)组,每组3个重复。结果显示:1)与对照组相比,ETEC K88组细胞活力显著降低(P<0.05),细胞上清液乳酸脱氢酶(LDH)活性显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组细胞活力显著升高(P<0.05),细胞上清液LDH活性显著降低(P<0.05)。2)与对照组相比,ETEC K88刺激导致细胞形态损伤,超微结构破坏,表现为细胞膜破裂,细胞核皱缩,染色质外溢,线粒体出现肿胀并且空泡化;ETEC K88组细胞坏死率显著升高(P<0.05)。与ETEC K88组相比,添加PCA能够保护细胞形态,PCA+ETEC K88组细胞坏死率显著降低(P<0.05)。3)与对照组相比,ETEC K88组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、TLR4、脂多糖结合蛋白(LBP)、髓样分化蛋白2(MD2)、白细胞介素受体相关激酶1(IRAK1)、肿瘤坏死因子受体相关因子6(TRAF6)和髓样分化因子88(MyD 88)的mRNA相对表达显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组TNF-α、TLR4、LBP、MD2、IRAK1、TRAF6和MyD88的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。4)与对照组相比,ETEC K88组肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)、Fas相关死亡结构域(FADD)、混合系列蛋白激酶样结构域(MLKL)、高迁移率蛋白1(HMGB1)、动力相关蛋白1(Drp1)和磷酸甘油酸变位酶5(PGAM5)的mRNA相对表达量显著升高(P<0.05);与ETEC K88组相比,PCA+ETEC K88组TNFR1、FADD、HMGB1、Drp1和PGAM5的mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)。由此可见,PCA可能通过抑制细胞程序性坏死和TLR4信号通路的激活,缓解ETEC K88诱导的IPEC-1细胞的炎症反应和损伤。

葡萄球菌分离株肠毒素sek基因的分布及其蛋白的表达纯化

目的:了解国内葡萄球菌分离株携带肠毒素sek基因的分布情况,获得纯化的重组SEK蛋白并初步了解其生物学活性。方法:应用PCR方法检测葡萄球菌属122株分离株sek分布,克隆了葡萄球菌PTJ-2分离株的sek成熟肽基因,构建了重组质粒pGEX-6P-sek、pET28-sek重组表达载体,经GST亲和层析、镍螯合层析,制备纯化的重组蛋白GST-SEK、P28-SEK。通过Western blot检测重组蛋白的免疫原性及其诱导小鼠脾淋巴细胞凋亡的能力。结果:122株葡萄球菌属分离株sek基因的检出率为23%(28/122);PTJ-2分离株与已报道sek基因的同源性在97.62%以上。获得2种具有良好免疫原性,表达量占菌体蛋白的24%、17%的可溶性重组蛋白。结论:除已报道的金黄色葡萄球菌外,国内非致病性葡萄球菌分离株也可携带sek基因。PTJ-2国内分离株SEK蛋白与已报道同型肠毒素存在3个氨基酸变异。重组的SEK蛋白可诱导小鼠脾淋巴细胞凋亡。

鸡源金黄色葡萄球菌分离菌株新型肠毒素基因K的检测

金黄色葡萄球菌能够产生多种肠毒素,它们被认为是引起葡萄球菌食物中毒最主要的原因.本文主要针对从鸡源分离的金黄色葡萄球菌菌株肠毒素基因K进行检测.利用金黄色葡萄球菌的16S rRNA基因引物对30株分离株进行鉴定;采用肠毒素基因K的上下游引物分别对30株分离菌株DNA进行PCR扩增.结果表明30株分离株中含肠毒素基因K的菌株达到17株,检测率占56.7%.通过本研究可以看出鸡源金黄色葡萄球菌分离菌株中肠毒素基因K的分布状况,揭示了新型肠毒素基因K在分离菌株中的高检出率.

金黄色葡萄球菌类肠毒素K与GFP融合蛋白工程菌的构建及其表达蛋白生物学活性分析

目的构建携带金黄色葡萄球菌类肠毒素K(staphylococcal enterotoxin-likeK,SElK)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合基因的工程菌,并对SElK-GFP融合蛋白进行初步生物学活性分析。方法利用PCR和OverlapPCR克隆获得SElK-GFP融合基因,并插入pET28a表达载体中,通过菌落PCR,质粒双酶切及测序验证后,将构建成功的pET28a-SElK-GFP质粒转化到E.coliBL21菌株中进行诱导表达,通过Ni+亲和磁珠试剂盒纯化获得SElK-GFP融合蛋白;并利用MTT法检测SElK-GFP刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;ELISA法检测SElK-GFP尾静脉注射后小鼠血清中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平。结果成功构建能够表达SElK-GFP融合蛋白的工程菌,纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白可观测到明显的绿色荧光,融合蛋白生物学活性分析表明,SElK-GFP能够呈剂量依赖性地显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;同时ELISA检测发现SElK-GFP可显著增加小鼠血清中细胞因子IL-2及IFN-γ的分泌水平。结论成功克隆、表达及纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白,其不仅保留了SElK的超抗原活性,同时兼具GFP绿色荧光的可视性,为深入研究SElK生物学活性提供有利工具。

K88ac^(+)产肠毒素大肠杆菌eltAB基因缺失对其生物学特性影响的研究

为研究热敏肠毒素(LT)对K88ac+产肠毒素大肠杆菌(K88ac^(+)ETEC)致病能力的影响,本研究利用λ-Red同源重组系统构建了eltAB基因缺失株C83902ΔeltAB,同时将重组质粒pBR322-eltAB电转化至C83902ΔeltAB菌株中获得回补株C83902ΔeltAB/pLT。比较3株菌的生长特性,结果显示相同的条件下,野生株、缺失株和回补株的生长速度无差异;采用ELISA方法检测3株菌感染仔猪肠道上皮细胞IPEC-J2后细胞内的环磷酸腺苷(cAMP)浓度,结果显示与缺失株相比,野生株和回补株感染后细胞内的cAMP浓度均极显著上升(P<0.01)。体外对IPECJ2细胞的黏附试验结果显示,缺失株的黏附能力较野生株极显著下降(P<0.01);而回补株的黏附能力得到恢复。采用RT-qPCR检测3种菌株感染IPEC-J2后炎性因子和紧密连接蛋白基因的转录水平,结果显示缺失株感染IPEC-J2细胞后,炎性因子TNF-α和IL-8的mRNA转录水平均极显著下降(P<0.01),而3株菌感染的细胞中紧密连接蛋白编码基因Claudin-1、Occludin和ZO-1的mRNA转录水平均无变化。以上结果表明,LT毒素能够促进K88acETEC菌株对IPEC-J2细胞的黏附和诱导其炎性细胞因子的分泌,但并不能破坏肠道细胞屏障的完整性。本研究为进一步阐明K88acETEC的致病机制提供了重要的参考依据,同时为防治K88acETEC的感染提供了新的策略。

饲用凝结芽孢杆菌对感染产肠毒素大肠杆菌K88断奶仔猪生长性能和肠道健康的影响

本文旨在研究饲用凝结芽孢杆菌对感染产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88断奶仔猪生长性能和肠道菌群、形态及细胞因子表达的影响。试验选用32头25日龄断奶的健康“杜×长×大”商品公猪,按照初始体重一致原则分成4个组,每组8个重复,单笼饲养。ETEC K88感染前7 d,2个组饲喂基础饲粮(BD组),另外2个组饲喂在基础饲粮中添加1.0×10^(7) CFU/g凝结芽孢杆菌的饲粮(PD组)。第8天起,开展2×2双因素试验,4个组设计如下:1)NCH+BD组,口服生理盐水、饲喂基础饲粮;2)NCH+PD组,口服生理盐水、饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮;3)CH+BD组,口服ETEC K88、饲喂基础饲粮;4)CH+PD组,口服ETEC K88、饲喂添加凝结芽孢杆菌饲粮。试验猪口服5 mL ETEC K88(活菌数1.0×10^(9) CFU/mL)或5 mL 0.9%生理盐水,持续3 d。试验用凝结芽孢杆菌是经体外牛津杯法确定的1株对ETEC K88具有良好抑菌效果的菌株,添加量1.0×10^(7) CFU/g。试验第11天,取仔猪空肠、回肠、盲肠及食糜样本,测定肠道菌群、形态及细胞因子表达量。结果表明:1)ETEC K88感染处理显著降低断奶仔猪平均日增重和平均日采食量、空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量、空肠和回肠绒毛高度以及空肠黏膜白细胞介素-10(IL-10)mRNA表达量(P<0.05);同时,显著提高断奶仔猪料重比和腹泻指数、空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量、空肠和回肠隐窝深度以及空肠黏膜白细胞介素-6(IL-6)mRNA表达量(P<0.05)。2)饲用凝结芽孢杆菌处理显著提高断奶仔猪平均日增重和平均日采食量、空肠和盲肠食糜中乳酸杆菌数量、空肠和回肠绒毛高度以及空肠黏膜IL-10 mRNA表达量(P<0.05);同时,显著降低断奶仔猪料重比和腹泻指数、空肠和盲肠食糜中大肠杆菌数量、空肠和回肠隐窝深度以及空肠黏膜IL-6 mRNA表达量(P<0.05)。3)除腹泻指数外,ETEC K88感染处理与饲用凝结芽孢杆菌处理之间对其他指标均无显著互作效应(P>0.05)。结果提示,无论是否ETEC K88感染处理,饲用凝结芽孢杆菌均可通过平衡肠道菌群、维持肠道正常形态和缓解肠道炎症反应,改善断奶仔猪生长性能。

饲粮添加迷迭香酸对产肠毒素大肠杆菌K88攻毒断奶仔猪结肠菌群组成、屏障功能及炎症反应的影响

本研究旨在探究饲粮添加迷迭香酸(RA)对产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)攻毒断奶仔猪结肠菌群组成、屏障功能及炎症反应的影响。选取18头体重为(6.91±1.02) kg的健康21日龄断奶仔猪,随机分为对照组(CON组)、攻毒组(K88组)和迷迭香酸组(RA组),每组6头仔猪。CON组和K88组每天饲喂基础饲粮,RA组每天饲喂含RA的试验饲粮(在基础饲粮基础上添加500 mg/kg RA)。试验第19~20天,K88组、RA组仔猪每天灌喂4 mL浓度为109CFU/mL的ETEC K88重悬液攻毒,对照组仔猪则每天灌喂同等剂量的无菌生理盐水。所有仔猪在试验第22天屠宰取样。结果显示:1)与CON组相比,K88组断奶仔猪腹泻指数显著增加(P<0.05);与K88组相比,RA组断奶仔猪腹泻率极显著降低(P<0.01)。2)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠隐窝深度和黏膜厚度极显著降低(P<0.01)。3)与CON组相比,K88组断奶仔猪结肠菌群Chao1和ACE指数显著降低(P<0.05)。4)在门水平上,与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠菌群中拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度极显著降低(P<0.01),变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度显著降低(P<0.05),放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度显著增加(P<0.05);在属水平上,与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠菌群中克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)的相对丰度极显著增加(P<0.01),布劳特氏菌属(Blautia)、粪球菌属3(Coprococcus_3)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)的相对丰度显著增加(P<0.05),而脱硫弧菌属(Desulffovibrio)、埃希氏菌-志贺氏菌属(Escherichia-Shigella)的相对丰度显著降低(P<0.05)。5)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠食糜中乙酸、丁酸和总短链脂肪酸含量均显著增加(P<0.05)。6)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠黏膜中闭锁蛋白(Occludin)、闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的mRNA相对表达量极显著增加(P<0.01)。7)与K88组相比,RA组断奶仔猪结肠黏膜中白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量极显著降低(P<0.01),IL-10含量极显著增加(P<0.01),并且结肠黏膜中Toll样受体(TLR)-2(P<0.01)、TLR-4(P<0.01)、TLR-5(P<0.05)、核因子-κB(NF-κB)(P<0.01)的mRNA相对表达量显著或极显著降低。综上可知,饲粮添加RA可以改善ETEC K88攻毒断奶仔猪的结肠形态结构,调节结肠菌群组成,提高结肠食糜中细菌代谢产物短链脂肪酸的含量,有利于维持结肠屏障功能,缓解ETEC K88攻毒引起的结肠炎症反应,缓解断奶仔猪腹泻,维持肠道健康。

非预增菌可视化快速检测食品中肠毒素大肠杆菌K88的研究

本研究运用肠毒素大肠杆菌K88(E.coli K88)特异的适配体结合纳米金和银增强技术,建立了E.coli K88一种可视化快速检测技术,实现约2 h检测E.coli K88达10 CFU/反应的灵敏度。通过人工模拟E.coli K88污染25 g蔬菜、牛奶或猪肉等食品原料,采用该可视化快速检测技术进行非预增菌直接检测,结果显示检测灵敏度达100 CFU/m L(或g),检测需时约2 h,在1.0×102~1.0×105CFU/m L(或g)的E.coli K88污染浓度范围内,样品A630nm吸光值与目标菌污染浓度对数值呈线性关系,相关系数R20.97以上。研究结果表明,E.coli K88可视化检测方法可用于食品样品E.coli K88污染非预增菌的快速、灵敏检测分析。

金黄色葡萄球菌新型肠毒素SEK原核表达、纯化及溶液构象分析

金黄色葡萄球菌K型肠毒素(Staphylococcus aureus enterotoxin K,SEK)由金黄色葡萄球菌肠毒素基因簇编码,流行病学显示,编码SEK蛋白的sek基因在食品源金黄色葡萄球菌菌株中具有较高的检出率,说明SEK也可能是一种重要的食品中毒潜在致病因子。本研究将截去N端信号肽的SEK蛋白编码基因与原核表达载体pET-28a(+)连接,构建重组表达质粒pET-28a(+)-ΔNspsek;通过对sek基因在不同原核表达宿主菌中的表达及表达条件优化分析,确立SEK蛋白的最优表达条件;利用镍亲合层析纯化含组氨酸(His)标签的SEK融合蛋白,将凝血酶切除His标签后的SEK蛋白进行聚合状态及热稳定分析、荧光发射谱和圆二色谱分析。结果表明,重组蛋白SEK表达成功,热处理导致蛋白部分降解;荧光光谱揭示SEK蛋白在278 nm和295 nm波长处具有相同的最大色氨酸发射峰;344 nm波长处表明SEK蛋白处于紧密折叠的天然状态;圆二色谱分析表明,ΔNspSEK重组蛋白富含β-折叠(23.6%)、β-转角(28%)以及α-螺旋(29.1%)等二级结构。为深入研究SEK蛋白的结构与功能提供基础,也对改进食品加工工艺和提高食品安全具有指导意义。

干酪乳杆菌对产肠毒素大肠杆菌粘附Caco-2细胞抑制作用的研究

为研究干酪乳杆菌(L.casei)对人结肠癌Caco-2细胞的粘附特点及抑制产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)粘附Caco-2细胞的能力,本研究将不同浓度的L.casei和ETEC K88与分化完全的Caco-2细胞共培养2 h和4 h后,采用平板计数法和革兰染色法计算每个细胞上粘附菌的个数,评价L.casei的粘附特点及其抑制ETEC K88对Caco-2细胞的粘附能力,并分析其影响因素。结果表明,L.casei与ETEC K88均可以粘附至Caco-2细胞表面,并且随菌液浓度的升高和培养时间的延长,粘附的数量显著增加(p<0.05)。L.casei浓度越高,抑制ETEC K88粘附至细胞表面的能力越强,并与菌液添加顺序有关,但培养时间对其影响不显著(p>0.05)。本研究为L.casei抑菌作用机制的研究提供了实验依据。

肠毒素大肠杆菌K88可视化快速检测方法的建立

本研究通过肠毒素大肠杆菌（E.coli）K88菌毛蛋白的适配体识别,结合纳米金标记和银增强信号放大技术,建立了一种快速、灵敏、特异的E.coli K88可视化快速检测方法。该检测方法是将能与E.coli K88特异性结合的生物素化的适配体1（aptamer 1）,与目标菌E.coli K88以及纳米金-巯基化适配体2轭合物（aptamer 2-Au NPs）在一定条件下孵育,形成三明治式的aptamer 1-E.coli K88-aptamer 2-Au NPs复合物,随后通过生物素与亲和素的结合将复合物固定到修饰了链霉亲和素的微孔板上,最后运用银增强显色将反应信号放大。通过对检测方法条件的优化,本方法可特异、定量地检测E.coli K88,在1.0×10^1-1.0×10^5 cfu/孔目标菌范围内,其定量拟合线性曲线决定系数R^2可达0.9903,且检测灵敏度达10 cfu/孔,而检测其它非目标菌株均为阴性。本方法为E.coli K88在临床样品中的可视化检测奠定了基础。

干酪乳杆菌对细菌性肠炎NF-κB通路及其介导的炎性介质的影响

为分析干酪乳杆菌(L.casei)对产肠毒素大肠杆菌(ETEC)K88引起的细菌性肠炎NF-kB信号通路及炎性介质的影响,本研究将90只BALB/c小鼠随机分成肠炎组(ETEC K88灌胃)、干预组(ETEC K88+L.casei灌胃)及对照组。对临床症状进行观察,利用荧光定量PCR方法检测肠系膜淋巴结中NF-κB、IL-1β及TNF-αm RNA水平,western blot方法检测肠系膜淋巴结中NF-κB蛋白表达量,ELISA方法检测外周血NO、PGE2含量。结果显示:肠炎组NF-κB、IL-1β、TNF-α mRNA表达水平、NF-κB蛋白表达量及NO、PGE2含量较高,与对照组相比差异显著(p<0.05)。经L.casei干预后,人工感染ETEC的小鼠临床症状好转,NF-κB、IL-1β、TNF-αm RNA表达水平、NF-κB蛋白表达量及NO、PGE2含量均显著下降(p<0.05)。表明L.casei可以通过抑制NF-κB的活化,降低IL-1β、TNF-α mRNA的表达,减少NO、PGE2的分泌,抑制肠道炎症的进一步发生。为L.casei的抑菌机制的深入研究奠定了基础。

丁酸梭菌介导mTOR信号通路调控猪肠上皮细胞炎症反应的分子机制

本试验旨在研究丁酸梭菌(CB)介导雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调控产肠毒素大肠杆菌K88(ETEC K88)感染猪肠上皮细胞(IPEC-J2)炎症反应的分子机制。按试验步骤处理细胞,利用1×10^(3) cfu/mL的ETEC K88感染IPEC-J2以及400 nmol/L的mTOR抑制剂处理IPEC-J2,到达作用时间后,分别收集细胞及培养上清,然后按照猪肿瘤坏死因子(TNF-α)和猪白细胞介素-8(IL-8)检测试剂盒说明书进行细胞因子检测,以及使用荧光定量PCR(qPCR)法进行ZO-1、occludin和mTOR表达量的检测。结果表明:与ETEC组相比,抑制剂+ETEC组、CB+ETEC组和抑制剂+CB+ETEC组ZO-1和occludin的表达量均显著升高,或有升高趋势,ZO-1的表达量分别升高了86.59%、31.48%和133.98%,occludin的表达量分别升高了69.34%、18.63%和87.52%,而mTOR的表达量分别降低了40.81%、11.62%和52.43%。与CB+ETEC组相比,抑制剂+CB+ETEC组在mTOR活性被抑制后ZO-1和occludin的表达量极显著升高了77.97%和58.07%,而mTOR的表达量极显著降低了46.18%,CB与抑制剂协同逆转ETEC造成的紧密连接蛋白表达下降。综上所述,ETEC K88能够激活mTOR信号通路,而CB通过介导mTOR信号通路能够降低ETEC K88感染IPEC-J2引起的炎症反应,并提高紧密连接蛋白的表达量,从而减轻细胞损伤。

大肠杆菌K99噬菌体的分离鉴定及在小鼠上的防治效果

【背景】产肠毒素大肠杆菌K99是引起仔猪腹泻的主要致病菌之一,目前对该病的治疗主要依赖于抗生素,但大量抗生素的长期使用造成了病原菌耐药性的增强,亟待寻求一种新的产品来解决这一问题。【目的】以一株产肠毒素大肠杆菌K99为宿主菌,从畜禽粪水中分离噬菌体并对其基本生物学特性进行研究,同时在小鼠上检验噬菌体对小鼠大肠杆菌感染的防治效果。【方法】双层平板法分离筛选烈性噬菌体并观察噬菌斑形态;纯化后进行电镜观察、核酸类型鉴定;测定噬菌体热稳定性、p H稳定性、最佳感染复数及一步生长曲线;通过小鼠体内实验检测噬菌体对小鼠大肠杆菌感染的防治效果。【结果】从畜禽粪水中分离出1株产肠毒素大肠杆菌K99强裂解性噬菌体,命名为ФK99-1,经电镜观察及核酸类型鉴定,应属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)。噬菌体能耐受50°C左右的高温,在p H 3.0-10.0范围内效价稳定。最佳感染复数为0.000 01,暴发量为108 333 PFU/cell;运用噬菌体ФK99-1预防和治疗小鼠产肠毒素大肠杆菌K99感染,结果显示小鼠发病症状较阳性对照组明显减轻,小鼠血液内大肠杆菌K99含量也显著低于阳性对照组,通过病理切片观察显示脏器发病情况也较阳性对照组减轻。【结论】ФK99-1是一株在不同温度、不同酸碱性环境中有较强适应能力,且在小鼠大肠杆菌感染上表现出良好防治效果的裂解性肌尾科大肠杆菌噬菌体。