牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定

用RT＿PCR扩增肠激酶轻链(EKLC,EnterokinaseLightChain)的cDNA,并克隆至酵母分泌型表达质粒pPICZαA中.将重组质粒pPICZαA/EKLC转化至表达宿主pichiapastorisGS115,经甲醇诱导,目标蛋白EKLC表达并分泌至酵母培养基中.采用Zn＿Sepharose亲和层析一步纯化,从每升培养液可获得1.6mgEKLC,其纯度达90%以上.酶反应动力学结果表明,EKLC对小分子底物Gly＿Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿β＿naphthylamide的Km为(753±42)mol/L,kcat为(31.5±3.8)s-1.对硫氧化还原蛋白-脑钠素融合蛋白(Trx＿hBNP)的酶解作用显示,当酶与底物重量比大于1∶100时,经37℃保温5h后,超过75%的融合蛋白被裂解.上述结果表明,EKLC能够特异识别并水解Asp＿Asp＿Asp＿Asp＿Lys＿肽键,是一种能将融合蛋白中目标蛋白与载体蛋白裂解释放的有效工具酶.

重组鼠源性肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达

目的:制备能在原核表达系统中表达并特异性识别(Asp)4-Lys序列的鼠源性肠激酶,为推广应用重组肠激酶提供技术平台。方法:采用RT-PCR从C57BL/6J小鼠的十二指肠肠系膜黏膜组织中钓取肠激酶轻链的cDNA,将其克隆入pET32a原核表达载体中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达,然后以镍亲和层析法对表达产物进行纯化。结果:所钓取的肠激酶轻链编码序列与GenBank中的序列一致,比较发现其编码的氨基酸序列在小鼠与人、牛之间的同源性大于75%。利用pET32a/BL21(DE3)表达系统成功地在大肠杆菌中表达了重组鼠源性肠激酶轻链,表达量约占大肠杆菌BL21(DE3)总蛋白的30%,但多以包涵体的形式存在。经镍亲和层析法纯化的重组肠激酶多以聚体形式存在。结论:鼠源性肠激酶轻链在原核细胞中多以包涵体形式表达,天然构象重组肠激酶的获得还需对表达系统进行优化。

牛肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

为克隆表达牛肠激酶(enterokinase)轻链(EKL)编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售北方黄牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCmT载体中,经过特异性限制性内切酶酶切分析片段正确后,进行全序列分析。结果表明,克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致,得到了编码正确的牛肠激酶轻链基因全序列。随后,将目的基因片段插入pET39b中,构建了融合型表达载体pET39b EKL,转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达。所获得的pET39b EKL经过酶切鉴定和测序,证实其插入方向、读码框架正确,所表达重组蛋白经SDS PAGE分析,相对分子量为65kDa,表达量达28%,通过镍亲和层析纯化得到融合蛋白DsbA rEKL的单一条带。该粗酶经脱盐后在适宜的缓冲体系中21℃温育过夜,显示出较高的自催化切割活性,为进一步进行重组牛肠激酶活性的研究及应用奠定了基础。

具有自激活切割活性肠激酶轻链基因设计、表达及活性研究

目的获得Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列+牛EKL的cDNA序列,实现EKL基因在大肠杆菌中的融合表达和自切割。方法用Trizol法从牛十二指肠组织中提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增其cDNA片段,将此片段克隆于表达载体pGEX-2T,并在其前引入肠激酶(EK)识别序列。结果所表达蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子质量约为61 000,经GST-Sepharose亲和色谱柱纯化后得到单一蛋白,SDS-PAGE显示单一条带,用微量EK引发自切割,切断GST标签蛋白和Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列,采用对氨基苯甲脒-Sepharose亲和色谱获得了轻链EK的单体。结论成功地克隆、表达了牛EK轻链基因,采用自激活、切割获得了EK单体,每1 L培养基获得EK5 mg,为进一步进行重组牛EK活性的研究及应用奠定了基础。

变性剂对重组牛肠激酶活性的影响

肠激酶(EK,EC 3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-萘胺为底物,采用荧光跟踪法研究了变性剂盐酸胍、硫脲、尿素对重组牛肠激酶(rEK)活力的影响及抑制动力学.结果表明:盐酸胍、硫脲、尿素均对该酶的活性有较强的抑制作用,它们对该酶的半抑制浓度(IC50)分别为0.025,0.080和0.750 mol/L.研究的3种变性剂对该酶的抑制均显示可逆抑制机理;抑制类型也均为竞争性类型,测定它们对酶的抑制常数KI分别为0.015,0.060和0.553 mol/L.

重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的培养条件研究

对重组肠激酶在甲醇酵母中高效表达的发酵条件进行了优化 ,并在 Bioflo 发酵罐中实现了高密度培养和高效表达 .结果表明 :温度 3 0℃ ,培养基 p H6.0 ,当酵母密度达到 2 0 0 A6 0 0 nm以上时 ,加入无水甲醇 ,控制甲醇的流加体积 ,使其终体积分数为 1 .0 %～ 3 .0 % ,继续诱导培养 72 h左右 ,酵母菌密度可达到 1 5 0 g/L,重组肠激酶总活性可达 5 8k

牛肠激酶轻链基因的构建与原核表达

肠激酶作为一种丝氨酸蛋白酶,能够识别顺序-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,水解赖氨酸C端的肽键.根据NCBI中牛肠激酶基因序列(L19663)设计18条引物,通过重叠延伸拼接PCR技术(SOE-PCR)扩增两端带有酶切位点的牛肠激酶轻链基因.构建表达载体pET32a-EK,表达载体转化E.coli BL21(DE3),利用IPTG诱导表达嵌合蛋白,并用离子交换柱层析纯化肠激酶,获得了高纯度的重组肠激酶轻链蛋白,为大规模生产打下了基础.

利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备rhIL-11

本研究探讨利用肠激酶加工融合蛋白的方法制备重组人白细胞介素11(rhIL-11)的工艺条件与参数。融合表达载体pET32a/IL-11在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)pLysS中诱导表达,裂解上清以Ni-NTA亲和纯化,通过DsbA-EKL-(His)8的自催化切割完成单体活性肠激酶催化亚基的释放,继而对Trx-IL-11行使酶促切割作用制备rhIL-11。结果表明:亲和纯化得重组融合蛋白Trx-IL-11 11.25 mg/g湿菌,产品纯度达89.2%,回收率为91.8%。酶切体系经Ni-NTA resin充分吸附后,目标产品单体rhIL-11纯度大于95%。结论:利用肠激酶加工融合蛋白以制备rhIL-11的方法简单可行,分离纯化效果好,能够满足工业生产的需要。

牛肠激酶次特异性识别序列分析

在酶切融合蛋白时 ,除正常切割和非特异性切割以外 ,发现了牛肠激酶的一个可能的次特异性识别序列。分析了其产生的原因以及在基因工程研究中的意义。

重组肠激酶在大肠杆菌中的发酵与纯化

对重组肠激酶在大肠杆菌中的高密度发酵表达条件、纯化方法及其生物活性测定进行了研究。结果表明:在E.coli表达系统中,控制温度为37℃,培养基pH 7.4,当A600为8.0时,加入0.3mmol/LIPTG进行诱导,温度降低至30℃,连续诱导3 h,蛋白表达量达25%。经SDS-PAGE测定,纯化的重组肠激酶纯度达80%以上,并能高效切开融合蛋白。

重组牛肠激酶轻链基因在毕赤酵母中的表达与纯化

目的:构建重组牛肠激酶轻链的基因工程菌,并进行表达和纯化,以获得高纯度和高活性的重组牛肠激酶轻链蛋白。方法:以GenBank公共数据库中的牛肠激酶轻链基因序列(AccessionNo.NM174439)设计引物,利用RT-PCR合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆进pPIC9K载体,同时在基因N端插进6个组氨酸标签,转化毕赤酵母GS115,进行筛选和诱导表达。产物经镍离子螯和层析和Q-SepharoseFF柱纯化,并酶切融合蛋白检测其活性。结果:培养液中重组牛肠激酶轻链蛋白表达量为3.0mg/L。对含有肠激酶酶切位点的IL-11/MBP融合蛋白进行酶切,结果表明,酶解率可达到90%以上。结论:表达并获得了高纯度的重组肠激酶轻链蛋白,为大规模生产打下了基础。

重组牛肠激酶轻链基因在大肠杆菌中的表达与纯化

肠激酶(Enterokinase,EK,EC3.4.21.9)是一种以异源二聚体形式存在于哺乳动物十二指肠内的丝氨酸蛋白酶,通过在位点(Asp)4-Lys的羧基端进行高效特异酶切,将胰蛋白酶原激活为胰蛋白酶。以GenBank公共数据库中牛肠激酶轻链基因序列(Acces-sion No.NM174439)设计引物,利用RT-PCR方法合成牛肠激酶轻链基因片段,并克隆进pET39b载体中DsbA片段的C’端,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得DsbA/牛肠激酶轻链融合蛋白。经镍离子螯合层析纯化,每升培养液中可得到2.7-3.0mg重组牛肠激酶。对含有肠激酶酶切位点的IL-11/MBP融合蛋白进行酶切,结果表明,酶解率可达到95%以上,为重组牛肠激酶的大规模生产打下了基础。

牛肠激酶催化亚基cDNA的克隆及融合表达载体的构建

肠激酶(Enterokinase,EK)是目前生物制药领域纯化重组蛋白产品时用于切割融合蛋白的首选工具酶之一.为克隆表达牛肠激酶催化亚基(EKL)编码的基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化,从市售肉牛十二指肠组织中提取总RNA,以RT PCR方法扩增其cDNA片段,将此片段克隆于pUCm T载体中进行全序列分析.结果表明克隆的cDNA与GenBank上的序列相比完全一致.随后,将目的基因片段插入pET32a融合型表达载体中.经测序证实其重组DNA5'端多克隆位点与重组片段的接口处核苷酸顺序准确无误,所表达重组蛋白经SDS PAGE分析,相对分子质量为50kD,表达量达38%,为进一步进行Enterokinase催化亚基蛋白表达及活性研究奠定了基础.

人肠激酶轻链基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

研究目的:克隆表达人肠激酶轻链编码基因,以期应用于融合蛋白的切割与纯化.方法:从人的全基因组中扩增出编码人肠激酶轻链的5个外显子基因片段,经过酶切、连接后得到正确编码的人肠激酶轻链完整基因序列;随后,将目的基因片段插入原核表达载体pBV220中,构建成融合型表达载体pBV-EKL,转化大肠杆菌BL21(DE3),调节温度至42℃诱导重组蛋白表达;通过镍亲和层析纯化得到重组蛋白.结果:所表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对表观分子质量约为31 kDa,表达量占菌体总可溶蛋白量的46%;通过镍亲和层析纯化得到的重组蛋白经复性后显示出具有催化切割活性.结论:成功构建了能大量表达重组人肠激酶轻链的菌株,为进一步进行重组人肠激酶活性的研究及其在生产和医学方面的应用研究奠定了基础.

重组牛肠激酶轻链在大肠杆菌中的表达和纯化

密码子优化全基因合成了牛肠激酶轻链基因(sBEKLC),采用pET-39b(+)构建了融合表达载体,在大肠杆菌中进行了成功表达.37℃在含30 mg/L卡那霉素的LB培养基中培养,当细胞密度(D600)达到0.5时,降低温度到28℃,加入终浓度为0.1 mM的异丙基硫代-βD-硫代半乳糖苷诱导外源蛋白表达,继续培养6 h后收集菌体,融合蛋白(DsbA-sBEKLC)产量达到151.2mg/L,相当于80.6 mg/L sBEKLC.使用渗透冲击技术从细胞周质中提取sBEKLC,经过亲和层析可从每升发酵液中得到6.8 mg sBEKLC,经检测sBEKLC具有生物活性.

牛肠激酶基因工程菌的构建、高密度发酵、纯化及活性鉴定

肠激酶(enterokinase,EK)是一种专一识别DDDDK氨基酸序列、并水解K后肽键的丝氨酸蛋白水解酶.根据GenBank序列进行人工合成牛肠激酶轻链基因cDNA,测序正确后将其插入甲醇酵母分泌型载体pPICZαA,得到重组质粒pPICZαA/EKL,重组载体经线性化后转化Pichia pastorisSMD1168H,筛选得到重组牛肠激酶轻链工程菌.分别对重组酵母工程菌进行高密度发酵、rEKL(recombinant enterokinase light chain,rEKL)纯化、N端序列测定、生物学活性鉴定等研究工作.结果表明,发酵上清中rEKL含量高,纯化的rEKL专一性强、无其他杂酶活性、N端15个氨基酸序列与文献报道一致.

肠激酶在胆源性胰腺炎中的作用

在急性胰腺炎的各种病因中，胆石性者约占40～65%，是最常见的一种，且“共同通道”的存在率达67％，共同通道长度在0．5cm以上者达73％，因而，胆石与急性胰腺炎的关系密切。过去有关胆石性胰腺炎发病机理的三种学说：共同通道学说、肠胰返流学说及胰管梗阻学说等，均难以单独圆满解释胆石性胰腺炎的发生机理。国内外许多学者发现，胆石排出和胰胆合流异常。、与胆石性胰腺炎的关系密切，并认为是由于共同通道受阻后，胆管压升高超过胰管压，使胆汁返流入胰管，造成胰酶原的激活。但返流压力只是一个协同因素，而胆汁与胰液在共同通道中的混悬过程可能与胰酶原的激活有关，尤其胆汁中的肠激酶(也称肠肽酶)可能在急性胆石性胰腺炎的发病中有重要作用。

利用his-tag纯化和复性基因工程产物肠激酶

构建了融合表达肠激酶轻链（EKLC）的基因工程大肠杆菌，将该菌于37℃在含30mg／L卡那霉素的LB培养基中培养，当细胞密度（OD600）达到0．5～0．6时加入最终浓度为0．4mmol／L的IPTG并降温至26℃进行诱导表达，4h后目的蛋白质的表达量可达菌体总蛋白质的40％以上，但所表达的重组产物大多以包涵体形式存在于菌体中。利用产物N端携带6个组氨酸标签与金属螯合层析介质中镍离子的亲和性，应用镍离子金属螯和层析对样品包涵体进行了纯化和复性研究。实验结果表明，在变性条件下纯化的样品在柱上不经洗脱，直接用复性液洗涤6h，可以使EKLC在得到提纯的同时实现复性，得到了电泳纯度为96％的具有生物活性的EKLC，最高活性为712U。

效应物对牛肠激酶活性的影响

肠激酶(EK,EC3.4.21.9)是一种在基因工程产品中广泛应用的工具酶.以小分子荧光物质甘氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-β-萘胺(Gly-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys-β-naphthylamide,GD4K-β-naphthylamide)为底物,采用荧光跟踪法研究了不同氨基酸、几种常用有机溶剂、EDTA、DTT等对牛肠激酶(BEK)活力的影响.结果表明:L-赖氨酸(L-Lys)、丙酮、EDTA、DTT对该酶的活性有较强的抑制作用,IC50分别约为25,50,50和120mmol/L.进一步研究了L-Lys与丙酮对BEK活力的抑制机理以及抑制类型,结果表明:L-Lys对该酶的抑制机理为可逆抑制,其抑制类型为竞争型抑制类型,其抑制常数KI为12.02mmol/L.丙酮对BEK的抑制类型表现为不可逆抑制.

肠激酶特点及其基因工程的研究进展

肠激酶是从哺乳动物体内提取的一种丝氨酸蛋白酶,广泛应用于基因T程领域切割融合蛋白。文章对肠激酶的特点及其基因工程研究进展进行了综述。