先天性巨结肠症SEMA3C/3D基因突变抑制肠神经嵴细胞的分化和成熟

目的观察先天性巨结肠症(hirschsprung disease,HSCR)患者携带的SEMA3C/3D基因错义突变编码蛋白对原代培养的肠神经嵴细胞(enteric neural crest cell,ENCC)分化、成熟和迁移的影响。方法分别用野生型(wild type,WT)和突变型SEMA3C/3D质粒瞬时转染HEK293T细胞获取上清液,用含0.5 nmol/ml相应蛋白的上清液处理ENCC 72 h,分别用神经元、胶质细胞和未成熟神经元特异性标志物(Peripherin、GFAP、MASH1)多重免疫荧光染色法检测处理后细胞的分化倾向和分化后神经元的成熟速度,用Transwell迁移实验检测细胞迁移能力的变化。结果与WT相比,突变型SEMA3C(S329G、V337M)处理组的ENCC分化为神经元和成熟神经元的能力均下降(WT,S329G,V337M组的Peripherin/GFAP比值分别为0.95±0.34,0.53±0.35,0.28±0.07;Peripherin/MASH1比值分别为1.14±0.17,0.95±0.38,0.60±0.19),其中以V337M突变型SEMA3C处理组的下降最为明显(P<0.01),而野生型和突变型SEMA3C/3D对神经球的迁移均没有明显影响。结论突变型SEMA3C可以抑制ENCC分化为神经元/成熟神经元,从而影响肠神经系统的正常发育,这可能为HSCR的发病机制研究提供新的线索。

小鼠胚胎肠神经嵴干细胞的分离培养及鉴定

目的建立分离培养及鉴定小鼠肠神经嵴干细胞(gut neural crest stem cells,GNCSCs)的方法,为临床应用奠定基础。方法分离胚鼠肠管,消化后接种于添加N2、B27和碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基,贴壁培养;连续传代后用血清促进GNCSCs分化;最后用免疫细胞化学方法染色鉴定。结果分离培养的细胞聚集生长,形成的克隆球可以传代;克隆球p75染色阳性;分化后的细胞分别表达肠神经元、神经胶质细胞和平滑肌细胞特异性抗原。结论分离培养的克隆球具有自我更新和多向分化的能力,表达肠神经嵴干细胞的特异性抗原p75,是肠神经嵴干细胞。

成体小鼠肠神经嵴干细胞体外分离、培养及鉴定

目的利用简化无血清培养基和连续传代法,从成体小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞(GNCSCs),观察细胞体外培养过程中增殖、分化的特点.用p75,GFAP,Peripherin,α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系.方法将新生1,5d的小鼠肠管制成单细胞悬液,接种于无血清DMEM/F12完全培养基中贴壁培养,连续传代培养并观察克隆球的形成过程.将克隆球接种于含血清的DMEM/F12完全培养基中,观察其分化现象.用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达.结果成体小鼠肠管中有少数细胞在无血清培养基中存活且增殖形成克隆球.免疫染色表明克隆球是GNCSCs并且在血清诱导下可分化为神经元、神经胶质细胞、平滑肌细胞.结论成体肠管中存在具有自我更新和多向分化能力的GNCSCs,在体外GNCSCs可分化为肠神经系统所必须的细胞类型.

骨形态发生蛋白2对体外培养肠神经嵴干细胞的调控作用

目的研究体外培养肠神经嵴干细胞(enteric neural crest stem cells,ENCSCs)的方法,以及骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)对ENCSCs增殖、迁移的作用,揭示BMP信号通路在先天性巨结肠发生、发展中的作用。方法 1机械分离法和酶消化法从SD大鼠的胎鼠肠道组织获取ENCSCs,免疫荧光法鉴定干细胞特性和多向分化能力;2光镜计数法检测不同浓度BMP2,以及BMP2与胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)对ENCSCs增殖(成球率)的影响;3肠片三维立体培养观察BMP2及GDNF对ENCSCs迁移的影响。结果1成功从胎鼠肠道组织分离提取ENCSCs,于培养第8天可见神经球形成,并可反复传代培养;2将获得的ENCSCs反复传代后,采用免疫荧光检测其具有干细胞特性(P75+/Nestin+)和多向分化能力[可以分化为成熟神经元(TUJ1+)、神经胶质细胞(GFAP+)和平滑肌细胞(αSMA+)],证实其为干细胞;3与对照组比较,BMP2可明显促进ENCSCs的增殖及迁移能力(P<0.05),GDNF可以增强其生物学效应(P<0.05)。结论 1成功获得ENCSCs,并证实其具干细胞干性和多向分化能力;2BMP2对ENCSCs的迁移、增殖具有明显的促进作用。

肠神经嵴干细胞移植治疗巨结肠的研究现状

先天性巨结肠（Hirschsprung＇s disease，HD）是小儿常见疾病，发病率高达1／2000—1／5000，最显著病理生理变化是病变肠管神经发育异常或确缺如，导致局部肠管痉挛和狭窄，肠蠕动丧失和内括约肌松弛反射消失，随着近端肠管的蠕动，不断推挤肠内容物向前，引起狭窄段近端肠管扩大，

新生大鼠肠神经嵴干细胞的体外培养和鉴定

目的探索体外分离培养新生大鼠肠神经嵴干细胞(ENCSCs)的方法,观察肠神经嵴干细胞神经球(NLBs)的原代及分化情况。方法取新生SD大鼠,无菌环境下解剖分离从小肠至直肠的肠管,胰酶消化成单细胞悬液后,接种于培养瓶行原代培养,并传代;传到第3代时,加入分化培养基进行分化培养。观察ENCSCs原代培养及分化培养的情况,免疫荧光染色观察NLBs巢蛋白(nestin)的表达以及分化后ENCSCs Hu D蛋白、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达情况。结果 ENCSCs原代培养第1天,可见细胞贴壁成长,第2天,贴壁细胞减少,出现大量悬浮的细胞团,第4天,悬浮细胞团增大,形成体积稍小的NLBs,7 d后,大量NLBs漂浮于培养液中。未分化的NLBs行免疫荧光染色可见nestin阳性表达;NLBs分化后贴壁的细胞可见Hu D、GFAP阳性表达。结论新生大鼠肠道可提取出ENCSCs,培育出ENCSCs神经球,并能够分化成神经元和神经胶质细胞。

AMPKα1抑制β-catenin/TCF-4信号阻碍巨结肠乳鼠肠神经嵴衍生细胞迁移和线粒体裂解

目的研究AMPKα 1在先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease, HD)肠神经嵴衍生细胞线粒体裂解与迁移中调控作用。方法建立HD乳鼠模型,Western blot检测结肠组织中S100、NSE,AMPKα 1的蛋白表达水平。分离培养肠神经嵴细胞,AMPKα 1过表达质粒转染肠神经嵴细胞,RTqPCR检测结肠组织中AMPKα 1的mRNA水平,Western blot检测细胞中AMPKα 1,Drp1、Fis1、Mfn1、Mfn2、β-catenin和TCF-4表达。Transwell法检测细胞的迁移,透射电镜观察线粒体形状变化,荧光素酶报告实验检测β-catenin/TCF-4的激活情况。结果HD组织中S100、NSE,AMPKα 1蛋白表达水平降低,AMPKα 1过表达抑制细胞的迁移、增加线粒体的体积、抑制Drp1和Fis1的表达和β-catenin/TCF-4的活性(P<0.05)。结论 AMPKα 1抑制β-catenin/TCF-4信号并阻碍先天性巨结肠乳鼠模型肠神经嵴衍生细胞迁移和线粒体裂解。

比较胚胎和新生小鼠肠神经嵴干细胞体外增殖分化的实验研究

目的联合应用简化无血清培养基和连续传代法，从胚胎14～17d、新生1d、新生5d小鼠肠管分离培养肠神经嵴干细胞（gut neural crest stem cells，GNCSCs），观察其体外培养过程中增殖、分化的特点，用p75、GFAP、Peripherin、α-Actin作为特异性标志来鉴定GNCSCs及其分化的细胞系，比较胚胎和新生小鼠GNCSCs在生长速度、分化细胞的种类及数量上的差异。方法取3组小鼠的肠管，分离制成单细胞悬液，接种于DMEM／F12完全培养基贴壁培养，在连续传代培养中观察克隆球的形成；将克隆球接种于含血清培养基，观察其分化现象；用免疫细胞化学和免疫荧光法检测克隆球及其分化细胞系特异性标志物的表达。结果部分胚胎和新生小鼠肠管细胞在无血清培养基中连续传代培养形成克隆球。在血清刺激下克隆球可分化为多种形态的细胞。克隆球和分化细胞系的免疫染色均为阳性。结论胚胎和新生鼠肠管内存在具有自我更新能力的GNCSCs，且均可分化为神经元、神经胶质细胞和平滑肌三类细胞。新生鼠较胎鼠GNCSCs生长速度慢，分化的神经元数量减少，神经胶质细胞数量增加，平滑肌细胞无显著变化。

基因调控网络与先天性巨结肠发生的相关研究进展

先天性巨结肠是一种复杂的人类多基因遗传病,在消化道畸形患儿中常见,主要病理表现为肌间神经丛及黏膜下神经丛中的神经节细胞缺失。根据受累肠段的范围不同,先天性巨结肠可分为短段型、长段型和全结肠型3种。肠神经嵴细胞增殖、分化、迁移障碍是目前已知的最主要的致病原因。上述神经嵴细胞各发育阶段分别涉及以性别决定区盒基因10、酪氨酸激酶受体原癌基因、内皮素受体B、Ⅵ型胶原蛋白α链等基因为核心的复杂的基因表达调控网络。近年来,以增强子为主的基因组调控元件在基因表达调控网络中的作用逐渐受到重视,将成为未来研究的重要方向。

先天性巨结肠肠道微环境异常及其临床转化潜能

细胞移植是根治先天性巨结肠的潜在策略,但目前遭遇多种瓶颈,迫切需要"追根溯源"提高再认识水平。除神经节缺失、外源性神经纤维代偿性肥大增粗之外,先天性巨结肠还存在多种肠道微环境的异常。本综述拟从先天性巨结肠存在的多种肠道微环境异常着手,探寻其中"蕴含"具有神经再生潜能的施万前体细胞以及肠道微环境代谢产物短链脂肪酸、胶质细胞源性神经营养因子等,这些多效功能因子能够激发神经再生/保护效应,提高先天性巨结肠的临床转化潜能。