人肠道病毒D68型在儿童急性呼吸道感染中的临床特征与分子生物学特征分析

目的了解人肠病毒D68(EV-D68)在儿童急性呼吸道感染(acute respiratory tract infection,ARTI)中的临床特征及分子流行病学特征。方法采集2014年3月至2016年3月年深圳市妇幼保健院住院及门诊年龄1月至14岁符合急性呼吸道感染(ARTI)患儿共13 472份咽拭子分泌物,使用EV通用核酸试剂盒进行肠道病毒检测,EV病毒通用核酸阳性标本通过RT-PCR扩增并测序分型。结果在13 472份鼻咽部拭子标本中,EV阳性病例1 222例,阳性率为9.10%,EV-D68感染患儿7例,阳性率0.05%,其VP1扩增序列分离的5株D68均与进化簇1病毒序列具有高同源性,2例与进化簇2有高同源性。结论 EV-D68可能是急性呼吸道感染的一种新的主要病原体,感染高峰季节可能在秋冬季节,以急性下呼吸道感染(acute lower respiratory tract infections,ALRTI)为主要表现。

肠道病毒68型的研究进展

2014年,在美国暴发了肠道病毒68型(enterovirus D68,EV-D68)感染相关的急性呼吸道疾病,引起全球对EV-D68的广泛关注。EV-D68属于小RNA病毒科肠道病毒属,然而其某些生物学特性和流行规律却与典型肠道病毒不同。EV-D68可通过呼吸道传播,重症患者可表现与脊髓灰质炎相似的神经系统症状,且有一定的死亡率。该病原在世界多个国家和地区的流行为世界公共卫生安全提出了挑战。现对EV-D68流行概况、分子流行病学、血清中和抗体、交叉保护等方面的研究进展作一综述。

肠道病毒EV-D68的研究进展

肠道病毒D68(EV-D68)是一种酸敏感的肠道病毒,可在人体呼吸道中复制并引起呼吸道感染疾病。1962年EV-D68首次于在美国加州分离,至今出现多个亚型和分支。EV-D68自发现原型株以来经历了重大的遗传变化。主要变异区域包括1类衣壳蛋白(VP1)、5’非转译区(five prime untranslated region,5’UTR)和一些非结构蛋白。目前EV-D68在世界各地均有流行,人群的血清阳性率提示其感染率较高。对于EV-D68感染的相关受体及引起神经系统疾病、急性弛缓性脊髓炎(Acute flaccid myelitis,AFM)等严重症状的机理,都有待通过进一步的研究和建立完善监测网络来给出答案。

肠道病毒D组68型假病毒的构建

目的制备携带萤火虫荧光素酶报告基因的肠道病毒D组68型(enterovirus D68,EV-D68)假病毒。方法分别构建携带绿色荧光蛋白报告基因的EV-D68表达子和携带萤光虫荧光素酶报告基因的EV-D68复制子,共转染HEK-293T细胞后收获EV-D68假病毒;实时逆转录聚合酶链反应(reverse transcription PCR,RT-PCR)及蛋白质印迹法(Western blotting)鉴定EV-D68假病毒;实时荧光定量PCR检测假病毒滴度,荧光强度定量检测假病毒感染活性。结果成功构建EV-D68表达子和复制子;成功制备EV-D68假病毒,RT-PCR和Western blotting结果表明其具有萤火虫荧光素酶报告基因和与活病毒相同的衣壳蛋白,拷贝数为(4~8)×10^6 copies/mL,荧光强度与假病毒感染剂量呈正相关,证明其具有感染活性。结论成功构建了EV-D68假病毒。

ARRDC3在D68型肠道病毒感染A549细胞中的功能研究

目的探索含a-Arrestin结构域蛋白3(a-Arrestin-domain-containing-3,ARRDC3)在肠道病毒D组68型(enterovirus D species,EV-D68)感染A549中的表达以及对A549细胞株生物学行为的影响。方法对EV-D68感染宿主细胞前后的样本进行全转录组高通量测序分析,通过生物信息学分析筛选出差异表达基因ARRDC3;RT-qPCR和Western blot验证ARRDC3的表达水平;设计实验分组4组,对照组(未感染EV-D68的A549细胞)、感染组(感染EV-D68的A549细胞)、敲低ARRDC3感染组(感染EV-D68的A549细胞转染ARRDC3-SiRNA-干扰片段)、敲低对照感染组(感染EV-D68的A549细胞转染NC-SiRNA-干扰片段),通过流式细胞术、CCK-8、Transwell实验检测ARRDC3在EV-D68感染模型中对A549细胞周期、增殖、迁移的影响。结果从测序结果中共筛选出差异表达2倍以上的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)239个,其中上调基因135个,下调基因104个,ARRDC3是差异表达基因之一。EV-D68感染A549后,通过RT-qPCR和Western blot结果发现ARRDC3的表达水平显著增加(P<0.05)。细胞周期明显缩短,抑制细胞迁移。进一步通过转染成功干扰ARRDC3表达载体,沉默ARRDC3可以增强EV-D68感染A549细胞,沉默ARRDC3细胞周期DNA合成期延长(P<0.05),虽然对宿主细胞增殖无显著影响,但沉默ARRDC3可引起细胞迁移能力增强(P<0.05)。结论ARRDC3在EV-D68感染A549后表达明显上调,通过阻滞宿主细胞DNA合成期,抑制宿主细胞迁移等作用来发挥对宿主细胞的影响。

肠道病毒D68型和C96型的研究进展

肠道病毒(EV)是全球最常见的致病性病毒之一,可以引起手足口病、急性弛缓性麻痹、急性无力脊髓炎等多系统多种急慢性疾病,同时具有种类多、变异快的特点,其中有型别曾在美国、欧洲等世界多个地区引起过大规模暴发性流行。近年来,EVD68和EVC96的检出率在我国逐年升高,其中EVD68曾于2014年在美国大规模流行。虽然目前两者尚未在我国大规模暴发,但随着检出率的不断增长及EV的不断重组进化,其对公众健康具有极大的威胁。因此,未来需加快对EVC96及EVD68等新EV防治诊疗手段的研发。

EV-D68 VP1蛋白的生物信息学分析和候选疫苗表位肽段预测及筛选

目的:通过对人肠道病毒D68型(EV-D68)衣壳蛋白VP1理化性质、结构功能和B细胞表位分析,获取候选疫苗肽段用于后期疫苗研制。方法:应用Bioedit软件、Netphos和ExPASy等在线工具分析EV-D68 VP1蛋白氨基酸序列。结果:EV-D68 VP1蛋白是等电点为8.73、相对分子量34.0 kD的亲水性蛋白质,具有35个可能的磷酸化位点,无信号肽和跨膜区,二级结构中不规则卷区有最高比例,α-螺旋和β-折叠散落在蛋白中;预测VP1蛋白具有多个可能的B细胞表位。结论:本研究分析了EV-D68 VP1的基本理化性质,结构功能和可能的B细胞表位,筛选了B细胞表位肽段,为EV-D68的进一步研究和疫苗的制备奠定基础。

北京市EV-D68型肠道病毒引起的急性呼吸道感染

目的 了解北京地区呼吸道感染病例中EV-D68型肠道病毒感染情况,发现北京地区EV-D68型肠道病毒的流行规律,为呼吸道传染病预防控制策略的制定提供依据.方法 从监测哨点医院采集呼吸道感染病例的咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等标本,利用实时荧光PCR方法,筛查肠道病毒,利用EV-D68型肠道病毒特异性引物对肠道病毒核酸检测阳性标本进行RT-PCR扩增和测序.测序结果在NCBI中进行BLAST,分析肠道病毒血清型,并进行进化分析.结果 从2015-2016年6月份的10 494例呼吸道感染病例病原学标本中,检测到330例肠道病毒核酸阳性标本,其中两例为EV-D68型特异性引物扩增阳性,经测序证实其为EV-D68血清型.对VP1区的序列进化分析结果表明,两株EV-D68肠道病毒均属于3个已知的进化分支中的亚系1.结论 北京地区存在EV-D68型肠道病毒的流行,并可引起呼吸道感染,流行的EV-D68均属于亚系1,与国际上主要流行的亚系一致.本研究结果为阐明EV-D68病毒的流行特点提供了数据参考.

呼吸道感染肠道病毒D68型病例特征分析

目的了解浙江省绍兴市10例呼吸道感染肠道病毒D68(EV-D68)型病例特征,为制定EV-D68感染防制策略提供依据。方法收集2021—2022年绍兴市哨点医院就诊的急性呼吸道感染病例的基本情况和临床标本,采用实时荧光PCR和肠道病毒VP1区测序法检测EV-D68,描述性分析EV-D68阳性病例的流行病学和病原学特征。结果2021—2022年共检测急性呼吸道感染病例3009例,检出EV-D68阳性10例,阳性率为0.33%。其中,男性6例,女性4例;<18岁5例,18~60岁2例,>60岁3例;夏秋季高发,5—7月和9—10月各检出5例。临床症状以发热(10例)、咽痛(9例)和咳嗽(8例)为主;10例病例均恢复良好,无死亡报告。10份EV-D68阳性标本经序列比对均属于D3亚型。结论绍兴市EV-D68引起的呼吸道感染主要感染18岁以下儿童青少年,夏秋季高发,D3亚型为主要流行型别。

2018-2019年北京市呼吸道感染病例中肠道病毒D68型临床和流行特征研究

目的 分析北京市2018-2019年呼吸道感染病例中肠道病毒D68型(EV-D68)感染者的流行特征。方法 利用北京市呼吸道病原体监测系统,收集2018-2019年全市35家哨点医院就诊的急性呼吸道感染患者的临床标本及流行病学资料,利用实时荧光PCR方法筛查肠道病毒和EV-D68,对EV-D68阳性标本进行VP1区序列的扩增、测序及进化分析。结果 2018-2019年共收集急性呼吸道感染病例15 645例,检出肠道病毒阳性者467例(2.98%)。22例(0.14%)EV-D68阳性病例中,<18岁组11例,18~60岁组7例,>60岁组4例;夏季(6-8月)检出7例,秋季(9-11月)11例,冬季(12月至次年2月)3例,春季(3-5月)1例;8例被诊断为上呼吸道感染,14例为肺炎(其中2例为重症肺炎);主要临床症状为发热(18/22,81.8%)、咳嗽(15/22,68.2%)。14例EV-D68阳性经测序鉴定毒株属于亚型B3和新亚型D3,其中2018年有8例为B3亚型感染、1例为D3亚型感染,2019年5例均为D3亚型。结论 EV-D68引起的呼吸道感染在北京市持续存在,主要在夏秋季流行,B3和新亚型D3为主要流行亚型。

肠道病毒EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3的原核表达及其特异性分析

目的原核表达肠道病毒68型(enterovirus D68,EV—D68)表面结构蛋白VP2、VP3,分析其亲和力和结合力,得到具备高结合力的、可结合特异性记忆性B细胞的EV-D68病毒表面结构蛋白。方法采用PCR法扩增EV-D68病毒的VP2、VP3蛋白基因,插入原核表达载体pGEX-5X-1,构建重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,转化到工程菌Rosetta(DE3)pLy中,异丙基硫代半乳糖苷(i-sopropyl β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,表达的重组蛋白形成包涵体,经超声洗涤、透析复性;采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel immunosorbent,SDS-PAGE)电泳、westem-blot鉴定重组蛋白;竞争性酶联免疫吸附检测(eIlzyme linked immunosorbent assay,EusA)检测蛋白VP2、VP3的蛋白活性和亲和力;藻红蛋白荧光素(phycoeryth面,PE)标记VP2和VP3重组蛋白,结合CD19-APC、CD27-nTc抗体,流式细胞术检测VP2、VP3蛋白结合特异性记忆性B细胞的情况。结果成功构建出重组表达质粒pGEX-5X-1-VP2和pGEX-5X-1-VP3,通过双酶切鉴定及测序分析,确认表达载体构建正确,通过表达纯化,成功获得EV-D68的VP2、VP3蛋白,SDS-PAGE电泳灰度扫描显示,VP2蛋白的纯度可达80%,VP3蛋白的纯度可达75%;经westem-blot和EusA鉴定,均有抗原特异性;通过竞争EusA检测,VP2亲和力常数为2.7×10^7M^-1,为中等亲和力;VP3亲和力常数为3.25×10^6M^-1,为低亲和力;通过流式细胞术可以检测到病毒攻击小鼠后脾脏细胞中的特异性记忆性B细胞。结论成功原核表达,复性纯化得到EV-D68VP2、EV-D68VP3蛋白,两个蛋白均具有较强的抗原特异性,利用流式细胞仪能检测到特异性记忆性B细胞。最终获得了具有较强结合能力,可用于分选抗原特异性记忆性B细胞的EV-D68表面结构蛋白VP2、VP3,为研究VP2、VP3蛋白的中和抗原表位及其广谱中和抗体的分选检测打下了基础。

肠道病毒68型新型中和试验方法的建立及其初步应用

针对肠道病毒68型(EV-D68)建立一种新型快速、高效的中和试验方法,并初步评价其在EV-D68流行病学研究中的应用价值。以灭活EV-D68病毒免疫Balb/c小鼠,利用杂交瘤技术制备其单克隆抗体;筛选反应性好、特异性强的抗EV-D68单克隆抗体作为检测抗体,基于酶联免疫斑点检测技术(ELISPOT)建立EV-D68高效中和试验方法;进一步比较该方法与传统中和试验方法 Nt-CPE的一致性,并使用该方法对临床血清样本进行检测。共获得10株分泌抗EV-D68单克隆抗体的杂交瘤细胞株,选取一株性能最优的15C5进行生产纯化,鉴定其为IgG3亚型;以15C5为检测抗体,建立了快速检测EV-D68中和抗体的Nt-ELISPOT方法;与Nt-CPE方法比较,Nt-ELISPOT方法将检测时间由5~7d缩短至1d以内,并且两种方法检测结果一致性良好;应用所建立的Nt-ELISPOT方法对厦门地区146份人群血清样本进行检测,显示血清样本EV-D68中和抗体阳性率为98.6%(144/146),提示厦门地区可能存在过EV-D68的流行。本研究基于ELISPOT建立的新型EV-D68中和试验方法快速可靠,适合通量检测,可以应用于EV-D68中和抗体水平的血清学调查,为EV-D68感染的防控工作提供帮助。

重组抗黑猩猩腺病毒68型单克隆抗体制备及应用研究

目的制备1株抗黑猩猩腺病毒68型(chimpanzee adenovirus type 68,AdC68)六邻体(hexon,hex)蛋白重组单克隆抗体(单抗)。方法表达并纯化AdC68-hex蛋白,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA及细胞免疫染色法筛选得到1株分泌抗AdC68-hex蛋白单抗的杂交瘤细胞。抽提杂交瘤细胞RNA进行测序,获得单抗重链与轻链可变区序列,分别与小鼠重链与轻链恒定区序列拼接得到小鼠全长IgG1κ抗体重链与轻链,并构建至真核细胞高效表达质粒。将重链与轻链质粒共同转染至哺乳动物细胞表达并纯化得到抗AdC68-hex重组单抗。将抗体用于滴定AdC68、重组AdC68及AdC68重组疫苗,并开展方法学验证。结果表达制备的AdC68-hex蛋白能有效诱导小鼠的病毒产生抗AdC68-hex抗体。抗AdC68-hex重组单抗用于重组AdC68滴定具备良好的专属性、耐用性,在4.56~9.57 lg感染单位/ml范围内具备良好的线性、准确度和精密度。结论制备的重组抗AdC68-hex单抗适用于AdC68及AdC68重组疫苗载体相关的基因治疗药物及疫苗等的检测。

厦门市健康人群肠道病毒D68型血清流行病学调查

肠道病毒D68型(Enterovirus D68,EV-D68)是一种可引起急性呼吸道感染并诱发中枢神经系统疾病的小RNA病毒。开展相关血清流行病学调查,有助于了解病毒在人群中的感染水平,为制定有效防控策略提供科学依据。本研究为了解厦门市EV-D68的流行概况与流行病学特征,采用分层随机抽样的方式收集了2016年厦门市健康人群血清标本共515份,应用基于酶联免疫斑点检测技术的中和试验(Enzyme-linked immunospot assay)检测针对EV-D68流行株的血清中和抗体滴度。结果显示,血清样本中EV-D68中和抗体的总体阳性率为81.9%,中和抗体的总体几何平均滴度(Geometric Mean Titer,GMT)为248.0。<1岁组、1~3岁组、4~6岁组、7~19岁组、20~39岁组、40~59岁组和≥60岁组的EV-D68中和抗体阳性率分别为42.2%、49.3%、71.9%、94.2%、98.5%、100%和100%,各年龄组之间差异有统计学意义(P<0.0001);各年龄组的中和抗体GMT分别为1∶39.8、1∶80.6、1∶133.2、1∶283.7、1∶253.3、1∶308.1和1∶405.0;男、女性别之间EV-D68中和抗体的总体阳性率(P=0.6388)和总体GMT(P=0.3524)均无统计学差异;各年龄组不同性别之间的中和抗体阳性率和GMT差异均无统计学意义(P>0.05);地理位置上,市区与郊区的EV-D68中和抗体阳性率没有显著差异(P=0.0986),市中心的中和抗体GMT略低于郊区(P=0.0069)。本研究表明,厦门市健康人群中EV-D68中和抗体阳性率和GMT随年龄增长呈上升趋势,年龄是影响EV-D68感染和流行的关键因素;并且,该地各年龄人群中存在EV-D68既往感染,幼龄儿童的抗体保护水平低,需要加强对易感人群的防控措施,防止出现暴发流行。

肠道病毒D组68型的流行特征和基因型分布

肠道病毒D组68型(enterovirus D68,EV-D68)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒属,为无包膜单股正链病毒。EV-D68主要通过呼吸道传播,引起急性呼吸道感染,其诊断方法主要是通过聚合酶链式反应(PCR)对呼吸道标本进行核酸序列测定、病毒分离、血清学诊断。近年来全球不断有EV-D68相关疾病暴发,尚无有效的疫苗或抗病毒治疗方法,故需进一步监测EV-D68的流行趋势,为将来防控EV-D68引发的呼吸道感染暴发奠定基础。

人肠道病毒D68型5′UTR间隔区域对下游基因表达的影响

【背景】人肠道病毒D68型(EV-D68)属于小RNA病毒科肠道病毒属人肠道病毒D组,在2014年8月至2015年1月间,该病毒引起的感染在北美显著增多,我国也出现流行。相对于原始的Fermon毒株,流行株5′UTR区域几乎都存在一两处缺失,在起始密码子ATG前还存在两处ataaca重复序列,这两处位点的功能尚未见报道。【目的】探讨流行株5′UTR区域的缺失对下游基因表达的影响,以及ataaca重复序列的功能。【方法】通过序列比对分析现阶段流行株与原始毒株Fermon株5′UTR的差异以及保守区域,利用分子生物学方法缺失上述区域后,利用双荧光素酶报告系统分析5′UTR中上述区域对下游报告基因的影响。【结果】序列比对分析发现,目前流行的EV-D68毒株在对应于Fermon株基因组5′UTR的685-707区域发生了23个碱基的缺失,而部分毒株还在718-729区域发生了第二处缺失。荧光素酶结果显示,仅第一处缺失可以极大地提高下游基因的表达量,同时具有两处缺失则与野生型几乎相当,而仅缺失第二段序列则降低了下游基因的表达量。此外,还发现第一处缺失中的序列可能对下游基因表达起到了抑制作用,而靠近起始密码子的ataaca序列作用尚不明确。【结论】目前流行的EV-D68毒株在5′UTR区域大多出现了一两处缺失,第一处缺失极大地增强了下游报告基因的表达,而第二处缺失具有相反的功能,这一现象可能与起始密码子前的两处ataaca重复序列有关。

新型肠道病毒D68血清流行病学研究进展

新型肠道病毒D68(enterovirus D68,EV-D68)是小核糖核酸病毒科肠病毒属的D种,1962年在美国首次被检出,2014年EV-D68在美国引起暴发流行,此后多个国家相继报道EV-D68所致病例数增加.EV-D68与典型的肠道病毒不同,可通过呼吸道传播,容易引起人急性呼吸道感染.目前关于EV-D68的血清流行病学研究报道较少,本文就EV-D68的流行概况、中和抗体调查研究现况及血清学检测方法做一综述,为该病毒的后续研究提供参考.

肠道病毒D组68型流行情况研究进展

肠道病毒D组68型(enterovirus D68, EV-D68)是人肠道病毒D组中在人群中流行最广泛的病毒,且近年的流行趋势明显增强,病毒基因组也在快速进化。本文主要对EV-D68的分子流行病学、病毒进化和基因型地理分布等研究进展进行综述。

人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的表达及其结构初步研究

为了解人类肠道病毒68型3A蛋白可溶区的结构,本研究构建了EV-D68 3A蛋白可溶区的原核表达载体,在大肠杆菌中表达、纯化并对其结构进行了初步研究。首先,采用PCR的方法扩增EV-D68 3A（1~61）基因片段,克隆至原核表达载体pET-28a-His-SUMO中,转化进入BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达出His-SUMO-3A（1~61）融合蛋白。经Ni-NTA树脂亲和层析初步纯化后得到大量融合蛋白,利用ULP酶酶切去除His-SUMO标签,通过Ni-NTA树脂亲和层析、阴离子交换层析柱、分子筛层析等方法分离标签并进一步纯化目的蛋白。最后通过化学交联反应检测目的蛋白的多聚化状态。结果显示,利用pET28a-His-SUMO-3A（1~61）原核表达载体能够在大肠杆菌中成功表达出大量可溶性的融合蛋白;经过多步纯化方法得到了大量高纯度的目的蛋白,平均每升大肠杆菌可得到约5mg目的蛋白,纯度达95%以上;通过化学交联反应证明了该蛋白的多聚化存在形式。本研究成功建立了EV-D68 3A蛋白可溶区的表达和纯化系统,为进一步获得3A蛋白晶体、研究3A蛋白功能以及设计以3A为靶点的抗病毒药物奠定了基础。

人肠道病毒D68型微复制子的建立

建立人肠道病毒D68型（EV-D68）微复制子体系。利用增强绿色荧光蛋白（EGFP）或萤火虫荧光素酶（FLuc）报告基因替换病毒编码区,通过酶切连接,构建EV-D68 T7和PolⅠ系统微复制子体系,获得重组质粒pT7-miniEGFP、pT7-miniFLuc、pHH21-miniEGFP、pHH21-miniFLuc和pHH21-miniFLucΔpolyC。微复制子转染RD细胞,48h后荧光显微镜观察EGFP表达情况或用双报告系统检测荧光素酶表达水平。T7和PolⅠ系统微复制子均可表达报告基因,但PolⅠ系统荧光素酶表达水平是T7系统的5倍。并且病毒非编码区的PolyC区域对于病毒蛋白的表达起着重要的作用。本研究成功构建了EV-D68微复制子体系,为EV-D68非编码区功能研究提供工具。