羧甲基茯苓多糖对肠道病毒71型的抗病毒活性及其机制研究

为研究羧甲基茯苓多糖(CMP)对肠道病毒71型(EV71)的抗病毒活性,并探讨其作用机制,采用CCK-8法检测CMP对人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)增殖的影响;采用致细胞病变效应(CPE)法观察CMP对EV71感染引起的CPE的抑制作用;采用致半数细胞病理改变的病毒感染剂量(TCID50)法检测CMP对EV71感染性病毒颗粒的抑制水平;采用RT-qPCR法检测EV71结构蛋白VP1的表达;采用Western blotting法分析VP1、P62、LC3、Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果表明:不同质量浓度(0、250、500、1000μg/mL)CMP对RD细胞无明显的细胞毒性;与对照组相比,CMP在无毒性浓度范围内可有效抑制EV71的复制,且能够呈剂量依赖性地降低病毒感染引起的细胞病变效应;CMP可呈剂量依赖性地降低EV71病毒结构蛋白VP1的表达和子代感染性病毒颗粒的产生;CMP可下调EV71病毒感染的RD细胞中的LC3-Ⅱ、cleaved Caspase-3的表达。

上海市长宁区儿童家长肠道病毒71型灭活疫苗接种意愿及影响因素分析

目的 了解上海市长宁区托幼机构儿童家长为孩子接种肠道病毒71型灭活疫苗(EV71疫苗)的意愿并分析影响因素,为推广EV71疫苗接种提出建议。方法 采用随机抽样的方式抽取长宁区托幼机构就读的儿童,向儿童家长发放问卷进行调查。结果 有75.40%的家长愿意为孩子接种EV71疫苗。Logistic回归分析,不认为EV71会产生强烈副作用、疫苗犹豫量表得分越高、主动获取知识得分越低的家长更愿意为孩子接种EV71疫苗。结论 家长为儿童接种EV71疫苗的意愿受到对EV71疫苗副作用的认知、疫苗犹豫和主动获取知识情况的影响,应对家长开展相关健康教育,以提升接种率。

6-35月龄儿童接种肠道病毒71型灭活疫苗的手足口病保护效果和不良反应观察究

总结肠道病毒71型灭活疫苗(EV71)在用于6-35月龄儿童手足口病预防时的效果以及安全性;方法 对在我院接种和不接种肠道病毒71型灭活疫苗的6-35月龄儿童进行随访观察,统计接种和不接种肠道病毒71型灭活疫苗的儿童在1年内手足口病发生率和疫苗接种后的不良反应发生情况;结果 接种组和不接种组儿童的手足口病发生率分别分别为2.78%和10.24%(P<0.05),EV71灭活疫苗的VE为95%CI=73.85(61.50-83.65),接种组144名儿童的接种不良反应发生率为4.17%,轻度不良反应4例、中度不良反应2例;结论 肠道病毒71型灭活疫苗对6-35月龄儿童手足口病具有较好的防护效果,且安全性也较好,适宜儿童接种应用。

延伸护理对肠道病毒71型手足口病患儿遵医行为及其家长对疾病认知度的影响

目的:探讨延续护理对肠道病毒71型手足口病患儿遵医行为及其家长对疾病认知度的影响。方法:对2021年6月至2023年6月聊城市人民医院收治的80例肠道病毒71型手足口病患儿进行回顾性研究。将进行常规护理的患儿设为对照组,共30例患儿。将进行延伸护理的患儿设为试验组,共30例患儿。评估两组患儿遵医行为(个人卫生、饮食调理、口腔卫生、消毒隔离及皮肤保护)、患儿家长对疾病认知度(疾病发生、疾病发展、疾病治疗、疾病护理及疾病预后)及患儿生活质量(身体健康、心理健康、社会交往、睡眠质量及饮食能力)。结果:试验组患儿个人卫生评分(8.64±1.54)分、饮食调理评分(8.69±1.66)分、口腔卫生评分(7.84±2.74)分、消毒隔离评分(8.64±1.25)分及皮肤保护评分(8.89±1.21)分高于对照组患儿个人卫生评分(6.51±1.28)分、饮食调理评分(6.47±1.32)分、口腔卫生评分(5.98±2.34)分、消毒隔离评分(7.26±1.11)分及皮肤保护评分(7.68±1.55)分(P<0.05)。试验组患儿家长对疾病发生认知度评分(8.65±1.88)分、对疾病发展认知度评分(9.14±0.57)分、对疾病治疗认知度评分(8.68±1.55)分、对疾病护理认知度评分(9.01±0.97)分及对疾病预后认知度评分(8.67±1.65)分高于对照组患儿家长对疾病发生认知度评分(7.21±1.65)分、对疾病发展认知度评分(6.58±0.43)分、对疾病治疗认知度评分(6.87±1.25)分、对疾病护理认知度评分(7.04±0.6)分及对疾病预后认知度评分(6.84±1.24)分(P<0.05)。试验组患儿身体健康评分(83.65±10.37)分、心理健康评分(82.28±10.56)分、社会交往评分(83.61±10.09)分、睡眠质量评分(89.97±9.32)分及饮食能力评分(89.91±9.42)分高于对照组患儿身体健康评分(75.68±10.25)分、心理健康评分(76.42±10.15)分、社会交往评分(74.28±9.92)分、睡眠质量评分(83.12±9.65)分及饮食能力评分(83.07±8.76)分(P<0.05)。结论:延续护理应用于肠道病毒71型手足口病患儿护理中,可提高其遵医行为,改善其家长对疾病的认知度,提高其生活质量,改善其预后,值得临床应用及推广。

儿童清咽解热口服液体外抗肠道病毒71型作用

目的 研究儿童清咽解热口服液体外抗肠道病毒71型(EV71)的作用。方法 以盐酸胍为阳性对照,在Vero-E6细胞水平上,采用CellTiter-GloTM测定受试样品的细胞毒性,采用间接免疫荧光法测定肠道病毒蛋白表达水平,评价儿童清咽解热口服液对EV71的抗病毒作用。结果 儿童清咽解热口服液对Vero-E6细胞的半数毒性浓度为127.2mg/ml,抑制EV71病毒复制的半数有效浓度为3.193mg/ml,选择指数为39.8。结论 在Vero-E6细胞水平上,儿童清咽解热口服液对EV71具有明显的抗病毒作用。

直肠滴入中药对CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病的疗效

目的观察直肠滴入中药对CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病的疗效。方法选取2019年8月—2022年8月贵州水矿控股集团有限公司总医院CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病患儿85例,按照随机数表法分为观察组(42例)和对照组(43例),其中对照组患儿给予利巴韦林治疗,观察组患儿给予直肠滴入中药治疗。对比两组患儿治疗前后口腔疱疹、发热、皮疹等症状的评分,治疗前后患儿炎症因子、免疫指标水平及两组患儿治疗后不良反应发生率。结果治疗前,两组患儿的口腔疱疹、发热、皮疹评分差异无统计学意义(P>0.05),治疗后,两组患儿的口腔疱疹、发热、皮疹评分均降低,并且治疗后观察组患儿的以上症状评分低于对照组(P<0.05);治疗后,两组患儿白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α均降低,并且治疗后观察组患儿的以上降低幅度大于对照组(P<0.05);治疗后,两组患儿CD4^(+)、CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平均升高,CD8^(+)水平降低,并且治疗后观察组患儿的变化幅度大于对照组(P<0.05);观察组患儿不良反应发生率为4.76%,对照组患儿不良反应发生率为18.60%,观察组不良反应发生率低于对照组(P<0.05)。结论给予CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病患儿直肠滴入中药治疗,能减轻患儿临床症状及炎性反应,改善免疫功能,且不良反应少,值得借鉴。

灰树花水溶物对EV71病毒的抑制作用

【目的】探讨灰树花水溶物(GFWE)的化学成分及其对EV71病毒的抑制作用,为促进灰树花综合利用、提高其经济附加值,以及开发预防和治疗EV71病毒感染的功能性食品提供依据。【方法】采用色谱法测定了GFWE的主要化学成分组成、多糖组成和分子质量。基于体外细胞培养采用CCK-8法确定了GFWE的安全上样量;以EV71病毒感染Vero细胞为模型,探究GFWE对EV71病毒的抑制率及对Vero细胞形态的影响,并采用荧光定量PCR检测了EV71病毒衣壳蛋白(VP1)编码基因mRNA的表达水平,初步评价了GFWE对EV71病毒的抑制作用。【结果】GFWE主要由低分子质量多糖、氨基酸、肽及其衍生物组成。GFWE富含的13种氨基酸中包含7种必需氨基酸;其多糖由葡萄糖、半乳糖、盐酸氨基葡萄糖和古罗糖醛酸4种单糖组成,物质的量比为0.907∶0.038∶0.029∶0.026,重均分子质量分别为15.67、10.10、6.60 ku和<1.00 ku。GFWE表现出较高的抗EV71病毒活性,100、200μg·mL^(-1) GFWE对EV71病毒的抑制率分别为91.32%、91.83%,25~400μg·mL^(-1) GFWE能显著降低EV71 VP1 mRNA的表达水平。【结论】GFWE主要由低分子质量多糖、氨基酸、肽及其衍生物组成,具有较高的抗EV71病毒活性,能够抑制感染EV71病毒的Vero细胞中VP1的合成。

EV71感染致不同临床类型手足口病患儿肠道菌群分析

目的分析EV71感染后不同临床类型的手足口病患儿肠道菌群的丰度、种群结构、群落变化,以探讨EV71感染引起轻症与重症手足口病患儿肠道菌群差异。方法筛选经咽拭子核酸检测EV71阳性的手足口病确诊患儿,根据疾病的严重程度分为重型组S和轻型组M,同时纳入健康体检儿童为对照组N,采集患者发病3天内的大便标本,提取粪便基因组DNA,经16S rDNA测序并进行生物信息分析。结果拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门是儿童肠道微生物群落中最丰富的菌群,拟杆菌门相对丰度在正常儿童中均值为47.72%,手足口病患儿中轻症为55.62%,重症为61.17%,呈逐渐上升的趋势;而厚壁菌门和变形菌门的相对丰度则是随着疾病严重程度的加重,逐渐下降,差异无统计学意义。Alpha多样性分析结果显示三组间ace指数差异有统计学意义,S组的物种多样性较M、N组明显降低。结论EV71感染导致手足口病重症可能与患者肠道菌群多样性降低有关。

湖北肠道病毒EV71型流行株VP1基因以及蛋白结构特征分析

目的全面研究和了解2011年湖北省肠道病毒71型的VP1基因及蛋白结构特征，分析EV71型病毒在湖北省的基因型别，探讨该型病毒在全省的地理分布特征。方法对2011年湖北省8个区市的20株EV71流行株进行VP1区全长基因序列测定，并对核苷酸序列进行同源性比较及系统进化分析，并对VP1蛋白序列的亲水性、柔韧性等二级和三级结构进行分析。结果2011年湖北省EV71型流行株的基因亚型为C4a亚型，其VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性较高，分别为96．5％～98．7％和98．3％～100％。VP1蛋白特征分析发现该区主要免疫表位均没有发生变异且存在较多亲水性区域。二级结构以无规则卷曲为主，其次为8片层。蛋白质同源建模未发现不同毒株间VP1蛋白三级结构差别。结论2011年湖北省Ev71型流行株与我国其它地区的毒株有较高同源性，且存在一定的地理区域聚集性特征和遗传多样性特点。同时综合多种方法预测EV71VP1的二级结构和三级结构，为进一步研究开发相关药品和防治EV71感染提供理论基础。

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

目的构建肠道病毒71(enterovrius 71,EV71)的感染性克隆,为研究EV71毒力基因及新型疫苗设计等建立一个技术平台。方法用RT-PCR方法扩增出EV71FJ08149株全基因组,通过TA克隆组装进TOPO-XL-PCR载体中,获得全长cDNA克隆pFJ08149T5和pFJ08149T25。应用T7聚合酶系统在体外将线性化后全长cDNA克隆转录出RNA并转染RD细胞。通过间接免疫荧光试验、RT-PCR、序列测定及免疫电镜等对拯救病毒进行鉴定。结果 RNA转染后72h观察到典型的肠道病毒致细胞病变,拯救病毒经RT-PCR、间接免疫荧光和免疫电镜检测鉴定为EV71型,表明已成功构建了EV71感染性克隆。结论本研究成功构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,为深入研究EV71的致病机制等提供了有利的工具。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。

河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析

目的:了解2010年河南省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征。方法:筛选2010年河南省分离的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010),进行全基因组序列测定和基因进化特性分析。结果:EV71/Henan/DC/2010与其他EV71病毒株相比,编码区无核苷酸的缺失或插入,5’UTR区和3’UTR区长度和序列有一定差异。核苷酸同源性比较显示,EV71/Henan/DC/2010与2008年北京暴发流行株同源性最高(99.2%),与安徽阜阳暴发流行株和河南省暴发流行株均具有很高的同源性(98.1%和99.1%);与EV71各亚型代表株的比较结果显示,除VP3区以外,EV71/Henan/DC/2010各区均与C4亚型代表株同源性最高;氨基酸同源性比较结果显示,EV71/Henan/DC/2010大多数核苷酸变异属无义突变,相应氨基酸并未随之发生改变。根据VP1区基因序列构建遗传进化分析树显示,EV71/Henan/DC/2010与C4亚型同属一个分支。结论:EV71/Henan/DC/2010与2008年北京EV71流行株亲缘关系最为接近,同属于C4亚型。与我省及我国既往流行毒株相比,未发生大的变异。

肠道病毒71型(EV71)对ICR小鼠的感染

目的研究肠道病毒71型经不同途径感染不同日龄ICR小鼠后的感染状况,了解肠道病毒71型的感染特点,为了解EV71小鼠感染机制和模型制备提供实验信息和技术支撑。方法分别通过口腔途径、颅腔途径、肌肉途径及腹腔途径感染1日龄、7日龄及3~4周龄SPF级ICR小鼠,定期安乐动物,采集各器官组织进行病原学诊断,确定EV71病毒感染情况;同时建立一步RT-PCR、病毒分离、IFA及IEA等方法。结果经腹腔途径感染成年鼠出现竖毛、弓背、消瘦症状,其他各途径感染小鼠感染后未见竖毛、弓背、觅食减少、体重减轻、精神呆滞及神经系统症状。颅腔注射3~4周龄ICR小鼠能在脑组织检测到病毒RNA,腹腔注射和肌肉注射1日龄乳鼠能在肌肉组织和肠道检测到病毒RNA,其中,肌肉组织病毒分离可检测到活病毒。本研究同时建立了分子生物学、血清学方法,为今后研究其它适合EV71的动物模型奠定了基础。结论临床分离的EV71毒株通过口腔接种、颅腔、肌肉、腹腔注射途径感染1日龄、7日龄及3~4周龄SPF级ICR小鼠的疾病程度和病毒检出不同,ICR乳鼠及成年鼠可作为该病毒感染机制、病毒体内分布等基础研究,但用作EV71动物模型应用,感染程度尚不十分理想。

肠道病毒71型3C蛋白酶原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

目的原核表达肠道病毒71型3C蛋白酶(enterovirus 713C protease,EV71-3Cpro)并制备其特异性多克隆抗体。方法首先依据密码子优化原则合成EV71-3Cpro基因,将其克隆到pET-28a表达载体NdeⅠ和XhoⅠ位点间构建重组质粒,再以冷CaCl 2法将其转化到大肠杆菌E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,优化原核表达条件。以HisTrap TM亲和层析柱进行分离纯化,以纯化的EV71-3Cpro作为抗原免疫大鼠,分离血清后以酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、蛋白质印迹法(western blotting,WB)鉴定多克隆抗体的效价及其特异性。结果ELISA和WB结果显示制备的大鼠抗EV71-3Cpro多克隆抗体效价达1∶1024000,且具有较好的特异性。结论抗EV71-3Cpro多克隆抗体的成功制备为EV71-3Cpro生物学功能的研究及其联合疫苗的开发奠定了实验基础。

我国肠道病毒71型(EV71)疫苗株生物信息学分析

目的 比较3个EV71疫苗株病毒的生物信息学特点,为疫苗的质控和探讨该病毒疫苗的免疫机制提供参考.方法 本研究利用DNAstar MegAlign、DNAMAN Alignment、ANtheProt等生物学软件,比较了我国已进入临床试验的3家EV71全病毒灭活疫苗毒株的基因组及氨基酸序列,并对英衣壳蛋白二级结构及可能存在的抗原表位进行了预测分析.结果 3个疫苗株病毒基因同源性为97％～99％；氨基酸同源性为98％～99％；二级结构一致率在95％以上；均存在35个潜在抗原表位区域.结论 3个疫苗株生物信息学分析结果存在高度的一致性,提示疫苗具有相似的抗原性和免疫原性.

USP26负性调控RLR信号通路对肠道病毒71型复制的影响

目的研究泛素特异性蛋白酶26(ubiquitin-specific protease 26,USP26)通过调控RLR信号通路影响肠道病毒71型(EV71)感染的机制和功能,深入了解EV71感染及其逃逸免疫防御关系,为临床治疗EV71感染提供依据。方法利用RT-PCR和Western blot分别检测EV71感染横纹肌肉瘤细胞(RD)0、2、4、8、12、24 h后的USP26 mRNA、VP1 mRNA及其蛋白质的表达水平;在RD细胞中设置转染USP26-siRNA(实验组)和转染阴性对照siRNA(对照组),再用EV71感染RD细胞,收集感染8、12和24 h时的mRNA样本,RT-PCR检测VP1 mRNA的表达情况;收集感染8 h时的蛋白质样本,Western blot检测细胞中MDA5、p-IRF3、IRF3蛋白的表达水平并计算p-IRF3/IRF3的相对比值;利用空斑试验检测病毒滴度水平。结果Western blot和RT-PCR结果表明,EV71感染过程中USP26的表达上调(P<0.05);RD细胞转染后实验组EV71中VP1 mRNA的表达水平明显低于同一时间的对照组(P<0.05),感染8 h实验组中MDA5蛋白和p-IRF3蛋白的表达水平均显著高于对照组(P<0.05);两组IRF3总蛋白的表达水平差异无统计学意义;空斑试验中实验组EV71的病毒滴度显著低于对照组(P<0.05)。结论USP26可通过负性调控RLR信号通路参与抗病毒免疫反应,敲减USP26可抑制EV71在细胞中的复制。

新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究

目的研究建立新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制标准和评价体系,为EV71疫苗研发提供基础。方法根据创新型疫苗研发的要求,充分发挥技术优势,开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究。结果与结论建立EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品,统一不同企业疫苗的质控标准,规范疫苗的评价体系,为EV71疫苗的研发提供保障。

肠道病毒EV71型浙江分离株HZ08全基因组序列分析

目的了解浙江省流行的肠道病毒71型HZ08株的基因特征,研究肠道病毒71型的进化及变异状况。方法设计特异性引物,RT-PCR扩增HZ08株全基因,PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定和基因进化分析。结果 HZ08株的全基因组由7 405个核苷酸组成,编码2193个氨基酸。HZ08的5非编码区(UTR)、VP1、VP2、VP3、VP4、P2、P3、3非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的毒株序列较高,分别为96.2%~99.1%,92.6%~99.1%,92.7%~98.4%,88%~99.2%,93.8%~99.5%,89.4%~99.2%,91.4%~98.8%,87.8%~100%和91.1%~98.9%。HZ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%。根据VP1基因和全基因序列进行种系统发生分析显示HZ08株与中国陆和台湾的病毒进化关系较近,与国际标准株以及东南亚毒株进化关系统较远。其中HZ08株与国内流行株BJ08和Fuyang08的进化关系最近。HZ08株与C4亚型相关氨基酸序列一致,VP1的抗原性表位发生了变异。结论 HZ08病毒分离株为C4亚型,与Fuyang08和BJ08株进化途径相同,为肠道病毒71型的基因组功能学和疫苗学研究奠定基础。

上海市普陀区2013—2022年出生队列儿童肠道病毒71型疫苗接种情况分析

目的 分析上海市普陀区适龄儿童肠道病毒71型(EV71)疫苗接种情况。方法 通过上海市免疫规划信息系统收集2013年1月至2022年6月出生儿童EV71疫苗接种信息,应用Excel 2010进行数据整理、采用SPSS 27.0统计学软件进行统计分析。描述性分析出生队列儿童EV71疫苗接种率及其特征。结果 截至2022年底,上海市普陀区2013—2022年出生队列儿童EV71疫苗总全程接种率为44.35%,第2剂完成率为96.44%;常住儿童EV71疫苗第2剂完成率、接种及时率均高于流动儿童(P <0.05)。受种者中,首剂接种年龄在6月龄至2岁的儿童占84.18%;6月龄至1岁接种首剂疫苗的儿童较2~5岁的儿童第2剂及时接种率高(P <0.05)。结论 普陀区需进一步加强健康宣教工作,提高儿童家长防病意识和接种意识,从而提高适龄儿童EV71疫苗接种率。做好适龄儿童,尤其是流动儿童的预防接种管理工作,提高EV71疫苗全程接种率和接种及时率。