2009年西安地区手足口病病原血清型分析及肠道病毒71型基因特征

目的了解西安地区2009年手足口病的肠道病毒血清型;评价IgM抗体检测在肠道病毒71(EV71)感染早期诊断中的意义;分析西安地区EV71 VP1基因特征。方法分别在西安市城区医院和郊县医院采集的标本共185份,RT-PCR法检测标本中的病毒核酸;采集EV71核酸阳性的急性期病例血液标本,ELISA法检测血清中IgM抗体;细胞培养分离EV71,扩增其VP1区,测序并与EV71各血清型代表株序列比对,进行进化分析。结果在185份标本中,156份检出肠道病毒核酸(84.32%),其中72.4%为EV71,17.3%为柯萨奇A16(CA16);63份EV71核酸阳性的急性期病例血清标本中,45份EV71 IgM抗体阳性(71.43%);分离到的12株EV71均为C4亚型。结论 2009年西安地区手足口病病原以EV71为主,且主要是C4亚型;ELISA方法可用于EV71感染的早期诊断。

2018—2020年黔东南少数民族自治州肠道病毒A71型基因特征分析

目的对2018—2020年黔东南州手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)进行鉴定分析,并对肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)VP1编码区进行基因特征分析。方法2018—2020年黔东南州共采集HFMD病例标本2789份,首先,采用荧光定量RT-PCR初筛肠道病毒核酸,阳性病例标本采用人类横纹肌肉瘤(human rhabdomyosarcoma,RD)细胞进行病毒分离,对分离到的病毒株提取病毒核酸,经RT-PCR方法扩增VP1编码区核苷酸序列并进行序列测定。使用MEGA 11.0软件构建遗传进化树进行基因特征分析。结果2789份HFMD标本中检出EV-A71核酸阳性标本为328份,阳性率为11.8%。从部分EV-71阳性患者的咽拭子及肛拭子中,分离培养获得7株病毒株,其中6株来自于轻症病例,另1株为重症病例,均属于EV-A71基因型C4a基因亚型,分成2个不同的簇。7株EV-A71 VP1序列之间核苷酸和氨基酸同源性分别为89.8%~99.9%和98.0%~99.7%;与BrCr原型参考株间的核苷酸和氨基酸同源性分别为77.1%~78.8%和94.8%~96.6%;并在VP1有18处氨基酸位点发生变异。结论2018—2020年黔东南州EV-A71分离株属于C4a基因亚型,多处氨基酸位点存在变异,可导致多条传播链循环。

肠道病毒71型、柯萨奇病毒A组16型相关手足口病临床特征分析

目的分析肠道病毒71型(EV71)、柯萨奇病毒A组16型(CA16)相关手足口病(HFMD)的临床特征。方法回顾性分析209例EV71及CA16相关HFMD患儿临床资料,并进行比较。结果普通型HFMD患儿中,EV71感染患儿平均月龄偏大,体温高,呕吐及臀部出疹率高(P<0.05);CA16感染患儿男性偏多,发热天数长,心率快,AST、CRP显著升高(P<0.05)。重症HFMD患儿中,EV71所致病例多于CA16所致者(P<0.05),且嗜睡、肌震颤、易惊等临床表现的发生率高,易并发脑膜脑炎、脑干脑炎(P<0.05),实验室指标WBC、血糖(GLU)水平升高(P<0.05);CA16感染患儿男性较多,流涎、腹泻、口腔溃疡发生率高(P<0.05),实验室指标AST、CK、CRP水平显著升高(P<0.05)。结论 EV71及CA16相关HFMD临床特征有所不同,根据临床表现结合实验室指标WBC、GLU、AST及CRP等,有助于区分EV71或CA16感染。

肠道病毒71型感染前后宿主细胞蛋白质组的二维液相色谱分离和比较

以肠道病毒71型及其宿主细胞为研究主体,建立了一种二维液相色谱分离和分析比较病毒感染前后细胞蛋白表达谱的方法.该方法以高效液相色谱(HPLC)为技术平台,对细胞裂解物先后进行一维色谱聚焦分离和二维反相色谱分离.利用ProteoVue软件将二维色谱数据转换成模拟胶图,再利用DeltaVue软件对感染前后的宿主蛋白表达谱进行比较和分析,找出差异蛋白.二维液相色谱分离法能够根据蛋白的等电点和疏水性建立精确的细胞蛋白表达图谱,每0.2个pH为一个收集区段,在pH8.5～3.9的范围内可见蛋白条带约1 200条.该方法良好的重现性、自动化以及结果分析的简易化,使之在细胞表达谱差异显示中的应用潜力巨大,并且为研究病毒与宿主相互作用提供了新的方法和思路.

柯萨奇病毒A组6型与肠道病毒71型感染所致的手足口病临床特点比较

目的探讨柯萨奇病毒A组6型（CA6）和肠道病毒71型（EV71）感染所致手足口病（HFMD）的临床特点。方法回顾性分析2013年9月至2014年8月在重庆医科大学附属儿童医院住院的HFMD患儿的临床资料,纳入病原学确诊为EV71和CA6感染的病例,分为EV71组和CA6组,分析两组的临床特点、流行特征和预后。结果共确诊HFMD住院患儿887例,其中EV71组438例（49.4%）,CA6组43例（4.8%）。1EV71组和CA6组平均年龄分别为（17.6±8.7）和（27.2±18.2）月龄,差异有统计学意义（P〈0.001）。2两组流行时间不同,CA6组以1~3月所占比例最大,EV71组主要集中于4~7月。3发热、神经系统受累症状（呕吐、惊跳及肢体抖动）在CA6组发生率明显低于EV71组（P均〈0.05）,且意识障碍仅见于EV71组。4CA6和EV71组主要表现为手足疱疹、口腔疱疹和臀部皮疹,CA6组还更表现为躯干、四肢和口周皮疹。CA6组疱疹比例（23/43,53.5%）明显高于EV71组（49/438,11.2%）（P〈0.001）。5CA6组均痊愈,并完成随访;EV71组428例（97.7%）痊愈,1例（0.2%）死亡,347/437例（79.4%）完成随访。CA6组后期脱甲和脱屑的发生率均较EV71组明显增高（P均〈0.001）。CA6组均无后遗症;EV71组肢体瘫痪8/437例（1.8%）,癫1/437例（0.2%）。结论EV71和CA6感染所致的HFMD好发于不同季节,与EV71感染相比,CA6感染患儿年龄偏小,皮疹广泛,形态多样,脱甲及脱屑发生率高,神经系统受累较轻,预后较好。

合肥市0-14岁人群柯萨奇病毒A组16型和肠道病毒71型的感染状况调查

采用ELISA法检测0-14岁人群柯萨奇病毒A组16型（CoxA16）及肠道病毒71型（EV71）抗体水平。在入选的1000例儿童中,EV71 IgM总阳性率19．9%,EV71 IgG总阳性率47.7%,CoxA16 IgM总阳性率22．8%,CoxA16 IgG总阳性率51．3%；EV71 IgM总阳性率与CoxA16 IgM总阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=2．794,P〉0．05）；EV71 IgG总阳性率与CoxA16 IgG总阳性率比较,差异无统计学意义（χ^2=2．793,P〉0．05）。各年龄组比较,新生儿组IgG抗体阳性率较高,其EV71 IgG抗体阳性率41．5%,CoxA16 IgG抗体阳性率49．5%；婴儿组IgG抗体阳性率最低,EV71 IgG、CoxA16 IgG抗体阳性率分别为38．0%,43．5%；除新生儿组外,随年龄增加,人群EV71、CoxA16 IgG逐渐增高,组间差异有统计学意义（χ^2=27．04、19．98, P 〈0．01）；在 IgM 方面,人群EV71、CoxA16 IgM 随年龄逐渐升高,组间差异有统计学意义（χ^2=41．12、37．13,P〈0．01）。两种HFMD病原体的IgM、IgG抗体性别间差异无统计学意义（χ^2=0．51、1．77、0．36、2．12,P〉0．05）。

柯萨奇病毒A组16型与肠道病毒71型致手足口病临床特点比较

手足口病是由多种肠道病毒引起的常见感染性疾病,其中肠道病毒71型(EV-A71)和萨奇病毒A组16型(CV-A16)是最常报道的病毒类型[1]。手足口病易发生在5岁以下儿童,大多数患儿表现出自限性疾病症状,典型症状包括发热、手脚皮疹、口腔内水疱。研究显示,一小部分手足口病可迅速发展,导致致命的神经系统和全身并发症,特别是在EV-A71相关的患儿中[2]。EV-A71型、CV-A16型手足口病患儿临床表现不同,疾病预后也不尽相同[3]。为了比较EV-A71型、CV-A16型手足口病患儿临床特征,本研究选取30例CV-A16型手足口病患儿和45例EV-A71型手足口病患儿,以观察2组不同病毒导致手足口病临床特征和血清学特征。

3D聚合酶突变对肠道病毒A组71型复制影响的研究

目的研究3D聚合酶(3D polymerase,3D^(pol))突变对肠道病毒A组71型(Enterovirus A71,EV-A71)复制的影响。方法扩增EV-A71病毒基因组并克隆至TOPO-XL2-PCR载体;应用体外点突变方法在病毒3D^(pol)区引入N16S和I256V突变;采用T7聚合酶转录病毒基因组RNA并转染RD细胞,获得N16S和I256V病毒突变株。观察亲本病毒与突变病毒株的增殖特征以及病毒RNA含量。结果RNA转染RD细胞后可获得具有感染性的病毒。体外增殖试验显示,正常培养条件下(36.5℃)3株病毒增殖趋势一致,感染细胞72 h后病毒滴度和RNA拷贝数均达到峰值且组间差异无统计学意义。温度敏感性试验显示,与正常培养条件比较,病毒在高温(39.5℃)的滴度和RNA拷贝数均大幅下降,并且高温对N16S和I256V突变株的增殖抑制较亲本株更为显著。结论成功构建EV-A71感染性克隆并获得病毒突变株,3D^(pol)的N16S和I256V突变在高温条件下可能进一步降低病毒复制能力。

人肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的现况研究

手足口病最早由新西兰学者Seddon于1957年报道，1958年加拿大学者Robinson等在手足口病患者的咽拭子及粪便中分离出CA16病毒，CA16病毒第一次被认为是手足口病的病原。1959年英国学者Atsop从患者疱疹液中又分离出CA16病毒，CA16病毒是引起手足口病的病原体进一步被证实，手足口病因患者的临床特点被命名。1969年肠道病毒71在美国1名脑炎患者的脑脊液、粪便中被分离出，1992年EV71型血清型被确定。

肠道病毒71型3C蛋白表达后细胞蛋白质组差异分析

目的利用蛋白质组学技术研究肠道病毒71型(EV71)编码3C蛋白对宿主细胞蛋白表达的影响。方法在293T细胞中瞬时过表达EV71 3C蛋白,应用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)检测3C表达后293T细胞中蛋白的差异。选取表达水平有明显变化的蛋白用Western blot进行验证。结果在293T细胞中过表达3C蛋白后,可引起5个蛋白表达水平发生明显改变,其中4个蛋白表达上调,1个蛋白(HSPA4)表达下调。Western blot验证表明过表达3C可降低HSPA4的表达,HeLa细胞中HSPA4表达为对照的46.8%±10.1%(P<0.05)。结论过表达EV713C蛋白可引起细胞内蛋白表达差异。

荧光RT-PCR同步检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型方法的建立及应用

目的建立快速、灵敏、特异的肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的荧光PCR检测及分型方法。方法针对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的特异性保守基因vp1基因分别设计一对引物和对应的探针,对荧光RT-PCR反应体系进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,并对临床样品进行检测分析。结果该方法对肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的检测有高度特异性,与甲肝、腮腺炎、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应,检测灵敏度可达10拷贝/μl;43例患儿肛拭子标本中肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型检测率分别为37.21%(16/43)和13.95%(6/43)。结论荧光RT-PCR法分型检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型的方法具有快速、便捷、特异、灵敏等特点,适用于肠道病毒的早期诊断。

肠道病毒A组71型在人脐静脉血管内皮细胞中的增殖及对细胞骨架的影响

目的研究肠道病毒A组71型(Enterovirus group A type 71,EV-A71)在人脐静脉血管内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中的增殖及对细胞骨架造成的影响,初步探讨其与病毒血症发生的关系。方法采用qRT-PCR技术及免疫荧光技术检测EV-A71在HUVECs中的复制和增殖,用免疫荧光双染色技术观察三种细胞骨架在EV-A71感染后的变化。结果 EV-A71能够有效感染HUVECs,且感染后24 h在细胞内复制达到高峰。病毒感染后微丝骨架完全解聚,微管骨架排列方式发生改变,而中间纤维结构模糊不清;同时检测到微管及中间纤维与病毒抗原共存。结论 EV-A71可以感染HUVECs并在其内有效复制增殖,同时诱导HUVECs三种细胞骨架发生改变,提示细胞骨架可能参与EV-A71感染HUVECs的过程。

肠道病毒71型与柯萨奇病毒A组16型所致手足口病的临床特征与精细护理

目的：探讨肠道病毒71型（EV71）与柯萨奇病毒 A 组16型（CA16）所致的手足口病临床特征及护理方式。方法：回顾性选取2013年1月-2014年1月于我院儿科就诊的、经过使用 RT - PCR 进行肠道病毒检测可知肠道病毒71型（EV71）与柯萨奇病毒 A 组16型（CA16）患儿各50例为研究对象，之后对两组患者的临床特征以及生命特征进行统计分析，并进行精心细致护理。结果：肠道病毒71型（EV71）组患儿表现出呕吐、肢体抖动、抽搐、肺炎以及呼吸衰竭的比例明显高于柯萨奇病毒 A 组16型（CA16）患儿，各组统计结果比较差异有统计学意义（P 〈0．05）；而在生命特征方面，EV71患儿的体温、最高血压以及心率都明显高于 CA16患儿，差异有统计学意义（P 〈0．05）。经过针对性护理干预后，两组患儿的病情明显改善。结论：肠道病毒71型（EV71）患儿较柯萨奇病毒 A 组16型（CA16）在临床特征以及生命特征方面的临床表现更为明显，因此，应加强临床观察，尽早判断患儿感染病原体，及时针对性地进行治疗和护理。

ELISA法检测血清IgM抗体诊断手足口病急性期患儿EV-A71感染效能的Meta分析

目的 定量评价酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法检测血清肠道病毒A组71血清型(Enterovirus A71,EV-A71)IgM抗体的诊断效能。方法 根据研究目的,制定检索策略,系统地检索PubMed、Web of Science、Embase、中国知网、万方数据库等中外文数据库,提取纳入研究文献的相关数据,以手足口病(hand, foot and mouth disease,HFMD)患儿急性期呼吸道或肠道标本EV-A71核酸检测结果为“参考标准”,采用Meta分析定量地评价ELISA法检测血清特异性IgM抗体诊断HFMD患儿EV-A71感染的效能。结果 基于随机效应模型评估29篇原始研究,ELISA法诊断HFMD患儿EV-A71感染效能的合并灵敏度为87%(95%CI:82%~90%),合并特异度为82%(95%CI:78%~87%),合并阳性预测值为79%(95%CI:69%~87%),合并阴性预测值为90%(95%CI:86%~93%),合并曲线下面积为0.93±0.01;Meta回归发现,EV-A71 Ig M抗体检测试剂使用EV-A71 VP1蛋白较使用EV-A71灭活病毒纯化颗粒为抗原,会降低血清IgM抗体ELISA法诊断HFMD患儿EV-A71感染的灵敏度,但会提高特异度。结论 ELISA法检测血清EV-A71 IgM的诊断特异度和灵敏度可接受,可适用于临床EV-A71诊断,特别是在医疗资源贫乏地区。

ELISA、CF及中和试验检测肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型

目的对比ELISA、CF及中和试验检测肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Cox A16)的效果。方法选择2016年4月至2017年7月于我院就诊的144例疑似手足口病患儿为研究对象,确诊为手足口病的72例患儿为观察组,为手足口病症状非手足口病的72例患儿为对照组,所有研究对象均符合本研究纳入标准。所有研究对象均经ELISA、CF及中和试验进行检测,观察不同检测方法中EV71及Cox A16阳性表达情况,并分组对比。结果 ELISA、CF及中和试验单独检测和联合检测在EV71及Cox A16感染检测中的灵敏性为91. 09%、88. 12%、90. 10%、98. 02%,特异性为89. 15%、86.75%、87. 95%、97. 59%,ELISA、CF及中和试验在EV71及Cox A16感染检测中的灵敏性及特异性对比,差异无统计学意义(P> 0. 05); ELISA、CF及中和试验单独检测灵敏性及特异性小于联合检测,差异有统计学意义(P <0. 05)。ELISA、CF及中和试验检测阳性表达符合结果对比,差异无统计学意义(P> 0. 05); ELISA、CF及中和试验单独检测结果小于联合检测,差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 ELISA、CF及中和试验在肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型中的检测效果无明显差异,但联合检测可进一步提高检测灵敏性、特异性,在辅助进行手足口病临床诊断中具有重要的应用价值,可降低漏诊、误诊风险。

重症手足口病180例病原学检测及肠道病毒71型基因特征分析

目的 探讨重症手足口病病原学特征,分析肠道病毒71型（EV71）基因型的特征。方法 重症手足口病患儿180例,采集发病一周内的咽拭子或肛拭子标本,应用实时反转录-聚合酶链反应方法检测标本中的肠道病毒。分别选取2014年及2015年各5例EV71检测阳性标本扩增基因的VP1区,测序并比对,构建进化树分析。结果 180份标本中肠道病毒核酸阳性153份,阳性率85.00%。153份阳性结果中EV71核酸阳性占50.3%（77/153）,柯萨奇病毒A组16型（CVA16）核酸阳性占19.6%（30/153）,其他肠道病毒核酸阳性占30.1%（46/153）。2014年及2015年以EV71为主,CVA16较少,两年间病毒型别构成比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。多元线性回归分析示,拟合回归方程：Y=2.095X1＋0.462X2-0.214,式中Y为重症病例数,X1为EV71病例数,X2为其他肠道病毒病例数。EV71数可反映99.7%重症病例变化。不同年龄间病毒型别构成比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。发病高峰集中在每年4~8月;发病以4岁以下儿童为主,占82.7%,尤其是1~3岁年龄段（57.8%）。EV71 VP1区与C4a基因型代表株核苷酸同源性为91.6%~92.5%,氨基酸同源性为97.5%~98.8%,亲缘进化分析显示EV71与C4a基因型代表株处于同一分支。结论 EV71是本地区重症手足口病患儿主要病原,且属于C4a基因亚型。

肠道病毒A组71型病毒参考品的建立及应用

目的建立肠道病毒A组71型(enterovirus A71,EV-A71)灭活疫苗病毒参考品,用于病毒滴度内部质控品及灭活效果验证实验室评价。方法建立1批病毒参考品,按照《中华人民共和国药典》对其进行检定,包括无菌、支原体及分子生物学鉴定检查等。对其滴度进行标定和储存稳定性研究,并进行病毒滴定和灭活效果验证方面的应用研究。结果建立的EV-A71病毒参考品无菌检查及支原体检查结果均符合规定。分子生物学鉴定结果显示参考品只含有单一的EV-A71 VP1特异性条带。EV-A71病毒参考品标定后的滴度平均值为7.000 lgCCID_(50)/ml(95%CI为6.917~7.083 lgCCID_(50)/ml),可接受范围为6.566~7.434 lgCCID_(50)/ml,变异系数(coefficient of variation,CV)为3.01%,于-60℃及以下存放12个月的CV为2.08%,稳定性良好。将参考品作为病毒滴定测定的内部质控品应用于日常监测50次试验,滴度趋势分析结果显示未出现超趋势现象(out of trend,OOT)且均在警戒限内;将参考品作为阳性对照应用于灭活效果验证,结果显示细胞感染法及免疫荧光法的检测结果较为一致。结论建立了EV-A71病毒感染性滴度检测用参考品(EV-A71病毒参考品),12个月内储存稳定性良好,可用于EV-A71灭活疫苗生产工艺中病毒滴度评价和控制,以及作为灭活效果验证中的阳性对照,从而为单价或多价肠道病毒灭活疫苗的研究提供理论依据。

肠道病毒71型特异性核酸适配体的SELEX筛选

目的筛选能够特异性结合肠道病毒71型(enterovirus A71,EV-A71)衣壳蛋白VP1的核酸适配体,可用于后续研发基于核酸适配体的EV-A71检测方法。方法利用大肠杆菌表达EV-A71病毒的衣壳蛋白VP1,利用指数富集的配体系统进化技术(systemematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)体外筛选EV-A71的特异性核酸适配体。结果通过SELEX筛选获得三条长度为75~76 bp的核酸适配体(V7、V11、V21),相较于结构相似的柯萨奇病毒A组16型(Coxsackie virus A16,CV-A16)衣壳蛋白VP1,均能高特异性地结合EV-A71衣壳蛋白VP1。结论通过SELEX技术成功筛选出针对EV-A71衣壳蛋白的核酸适配体,其与靶蛋白EV-A71 VP1的结合具有较好的特异性及较高的亲和性,为构建相关的EV-A71病毒检测方法奠定了实验基础。

手足口病相关肠道病毒感染血清IgM抗体交叉反应及动态变化

目的分析手足口病相关肠道病毒间IgM抗体交叉反应及动态产生过程,评价抗体捕获法检测肠道病毒71型(EV71)及柯萨奇病毒A组16型(CA16)感染的早期诊断价值。方法收集广州市妇女儿童医疗中心319名手足口病患者及疑似患者咽拭子319份、血标本565份。荧光定量PCR检测咽拭子标本,血清中和试验检测配对血清,结合两法结果为判断标准,将手足口病患者分为EV71、CA16及其他肠道病毒感染组;以捕获ELISA法检测不同发病时间EV71-IgM抗体及CA16-IgM抗体。结果发病第一天均能检测出EV71-IgM抗体及CA16-IgM抗体,阳性率分别为33.0%和25.0%,检出率分别在第5天和第7天达到100%,抗体可持续检出时间达数月。EV71感染血清CA16-IgM捕获ELISA法交叉反应率为25.0%,CA16感染血清EV71-IgM捕获ELISA法交叉反应率为28.0%。EV71-IgM和CA16-IgM抗体存在严重交叉反应,通过两者450 nm处吸光度(A450 nm)比值可以成功诊断97.1%EV71感染和93.0%CA16感染。同一天采集的肛拭子及血清标本检测结果表明,荧光定量PCR与ELISA法诊断EV71及CA16感染的结果差异无统计学意义。结论 EV71及CA16抗体捕获ELISA法是一种简单、有效的诊断方法,联合两种方法检测可以有效提高诊断特异性。