肠道病毒71型VP1外壳蛋白二级结构及B细胞表位预测

目的预测肠道病毒71型（EV71）外壳蛋白VP1二级结构和B细胞表位，为制备EV71疫苗的研究提供理论基础。方法应用GOR4、HNN、SOPMA、nnPredict等方法预测EV71 VP1二级结构，并结合亲水性、柔韧性、表面可能性和吴氏抗原指数法综合预测潜在的B细胞表位。结果EV71 VP1二级结构以无规卷曲和β-片层为主，含有少量的α-螺旋，少见β-转角；EV71 VP1潜在的B细胞表位很可能位于第67-71位氨基酸残基。结论联合多种生物信息学方法成功预测了EV71 VP1二级结构和B细胞表位；此为制备EV71疫苗的研究提供了理论基础。

虎杖苷与白藜芦醇体外抗肠道病毒71型的初步研究

目的检测虎杖苷与白藜芦醇体外抗肠道病毒71型(EV71)活性,分析其与NF-κB信号通路的关系。方法采用噻唑蓝(MTT)比色法检测虎杖苷与白藜芦醇对人横纹肌肉瘤(RD)细胞的毒性以及抗EV71作用;western blot分析EV71感染RD细胞后EV71/衣壳蛋白VP1、NF-κBp50、NF-κBp65蛋白表达及磷酸化水平,Luminex流式液相芯片技术检测RD细胞分泌IL-6、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-α(IFN-α)和IFN-β的水平。结果虎杖苷与白藜芦醇的50%病毒抑制细胞毒性浓度(CC50)分别为542.76μg/mL和85.73μg/mL,50%病毒抑制浓度(IC50)分别为979.66μg/mL和21.36μg/mL,治疗指数(TI)为0.55和4.01。虎杖苷对EV71的抑制作用较弱,250μg/mL时的病毒抑制率为(23.57±3.64)%。白藜芦醇可抑制RD细胞EV71/VP1合成,作用8、12、24 h的VP1表达量差异具有统计学意义(t值分别为5.968、5.364和4.922,P均<0.05)。与EV71感染组比较,EV71+白藜芦醇组NF-κBp50磷酸化水平降低,差异有统计学意义(8、12、24 h的t值分别为11.642、12.284和28.844,P均<0.05);NF-κBp65磷酸化水平降低,也具有统计学意义(4、8、12、24 h的t值分别为9.017、16.883、10.287和6.922,P均<0.05)。白藜芦醇可显著降低EV71感染的RD细胞分泌IL-6、TNF-α和IFN-β(t值分别为23.589、34.564和13.296,P均<0.05)。结论白藜芦醇可通过抑制RD细胞的NF-κB信号通路干扰EV71复制。

重叠延伸PCR法合成EV71 VP1-LTB融合基因及其原核表达

目的用重叠延伸PCR(overlap extension PCR)法获得人肠道病毒71型vp1与大肠埃希菌不耐热肠毒素B亚单位(ltb)的融合基因,构建EV71 VP1-LTB融合表达质粒并在原核系统表达。方法设计14对引物通过重叠延伸PCR技术合成vp1基因,以ETEC(44815)质粒DNA为模板,PCR扩增ltb基因,将vp1基因与ltb基因连接并测序,连接产物插入原核表达质粒pBEX,构建重组质粒pBEX-VP1-LTB,转化E.coliB1221(DE3)进行表达,SDS-PAGE及W estern blotting分析其表达。电转法将重组质粒转入双歧杆菌。结果合成的vp1基因全长891 bp,测序结果与预期相符,重组表达质粒pBEX-VP1-LTB经PCR及双酶切鉴定,表明构建正确;目的蛋白在E.coliBL21(DE3)中获得了表达,Western bloting分析结果表明该蛋白具有与EV71 VP1抗体的反应原性;电转法成功将重组质粒转入双歧杆菌。结论应用重叠延伸PCR技术成功构建了EV71 VP1-LTB融合表达质粒,并在E.coliBL21(DE3)中获得有生物学功能的VP1表达产物,重组质粒双歧杆菌转化及VP1-LTB融合蛋白的表达研究,为研制EV71分子内佐剂疫苗打下了基础。