糖基化终末产物对肠道L细胞株胰高血糖素肽-1分泌水平及L细胞凋亡的影响

目的探讨糖尿病糖基化终末产物(AGEs)对肠道L细胞株GLUTag细胞凋亡及胰高血糖素肽-1(GLP-1)分泌水平的影响。方法 200μg/m L AGEs分别作用GLUTag细胞0、12、24、48 h,采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测细胞凋亡率。利用ELISA检测GLUTag细胞GLP-1分泌水平。实验分5组:空白对照组不加入干预因素,仅培养于DMEM低糖培养基中;BSA对照组培养于加入BSA的DMEM低糖培养基中;AGEs 100μg/m L组培养于100μg/m L AGEs浓度的DMEM低糖培养基中;AGEs 200μg/m L组培养于200μg/m L AGEs浓度的DMEM低糖培养基中;AGEs 300μg/m L组培养于300μg/m L AGEs浓度的DMEM低糖培养基中,分别作用细胞24h。采用AnnexinⅤ-FITC/PI染色检测细胞凋亡率。利用ELISA检测GLUTag细胞GLP-1分泌水平。结果各组细胞经药物干预24 h后,100、200、300μg/m L AGEs组的细胞凋亡率均显著高于空白对照组和BSA对照组(P=0.000);且300μg/m L AGEs组的细胞凋亡率最高(P<0.05),100、200、300μg/m L AGEs组的细胞分泌GLP-1浓度显著低于空白对照组和BSA对照组(P=0.000),且300μg/m L AGEs组最低(P<0.05)。200μg/m L AGEs作用12、24、48 h后的细胞凋亡率显著高于BSA对照组(P=0.000),且作用48 h组凋亡率最高(P=0.000);200μg/m L AGEs作用12、24、48 h后的细胞分泌GLP-1浓度均显著低于BSA对照组(P=0.000);且作用48 h最低(P<0.05)。结论肠道L细胞株GLUTag细胞的凋亡在相同作用时间下随着AGEs的浓度升高而增多,且在相同剂量下随着AGEs的作用时间延长而增多。AGEs可呈剂量、时间依赖性诱导肠道L细胞凋亡,并显著降低L细胞分泌GLP-1的能力。

晚期糖基化终末产物对肠道L细胞凋亡及增殖活性的影响

目的探讨晚期糖基化终末产物(AGEs)对肠道L细胞株GLUTag细胞凋亡及细胞增殖活性的影响。方法肠道L细胞株GLUTag细胞由加拿大多伦多大学Druker实验室惠赠。将GLUTag细胞株分5组:空白对照组,牛血清白蛋白(BSA)对照组,AGEs 100μg/m L组,AGEs 200μg/m L组,AGEs 300μg/m L组。培养方法:空白对照组,将GLUTag细胞株培养于低糖DMEM中;BSA对照组,将GLUTag细胞株细胞培养于加入BSA的低糖DMEM中;AGEs 100μg/m L组,将GLUTag细胞株培养于终质量浓度100μg/m L AGEs的低糖DMEM中;AGEs 200μg/m L组,将GLUTag细胞株培养于终质量浓度200μg/m L AGEs的低糖DMEM中;AGEs 300μg/m L组,将GLUTag细胞株培养于终质量浓度300μg/m L AGEs的低糖DMEM中;每组细胞均培养24 h。将培养在终质量浓度200μg/m L AGEs中GLUTag细胞株分别培养0、12、24、48 h(即4组)。各组细胞干预结束后采用双染细胞凋亡检测方法检测细胞凋亡率;Hoechst33258荧光染色观察细胞形态;细胞计数试剂盒检测细胞增殖活性。结果各组细胞经药物干预24 h后,AGEs 100μg/m L组、AGEs 200μg/m L组、AGEs 300μg/m L组凋亡细胞百分率明显升高,均显著高于空白对照组和BSA对照组,且AGEs 300μg/m L组凋亡细胞百分率最高(P=0.000)。AGEs 200μg/m L作用12、24、48 h后凋亡细胞百分率显著高于阴性对照组(作用0 h),且作用48 h凋亡率最高(P=0.000)。100、200、300μg/m L AGEs作用GLUTag细胞24 h后,细胞活性光密度(OD)值显著低于空白对照组和BSA对照组,且AGEs 300μg/m L组OD值最低(P<0.05)。AGEs 200μg/m L作用12、24、48 h后细胞OD值显著低于阴性对照组(作用0 h),其中48 h组OD值最低(P<0.05)。结论 AGEs对肠道L细胞株GLUTag细胞的凋亡及增殖活性均产生影响,其细胞凋亡率在相同作用时间下随着AGEs的浓度增高而增多,且在相同剂量下随着AGEs的作用时间延长而增多。AGEs可诱导肠道L细胞凋亡,抑制细胞增殖活性,从而损伤肠道L细胞。

黄蜀葵花中5种黄酮类化合物对肠道L细胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信号通路的调节作用

目的探讨黄蜀葵花中5种黄酮类化合物对肠道L细胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信号通路的调节作用。方法200 mg·L^(-1)AGEs作用肠道于L细胞株GLUTag细胞,Western blot检测细胞中RAGE、p22^(Phox)、p47^(Phox)、p53、Bax蛋白的相对表达量,ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6、caspase-3、caspase-9的含量。实验分为7组:空白对照组(NG)、模型组(AGEs)、槲皮素组(QT)、异槲皮苷组(IQT)、金丝桃苷组(HY)、槲皮素-3'-O-葡萄糖苷组(QG)、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷组(GG)。NG细胞培养于DMEM低糖培养基中;AGEs细胞培养于含200 mg·L^(-1)AGEs的DMEM低糖培养基中;给药组细胞分别培养于含50μmol·L^(-1)各黄酮单体及含200 mg·L^(-1)AGEs的DMEM低糖培养基中。各组细胞经药物干预24 h后,Western blot检测细胞中RAGE、p22^(Phox)、p47^(Phox)、p53、Bax、p-p38MAPK、NF-κB蛋白的相对表达量,ELISA法检测TNF-α、IL-1、IL-6的含量及caspase-3、caspase-9的活性。结果模型组细胞中RAGE、p22^(Phox)、p47^(Phox)、Bax、caspase-3、caspase-9、Phospho-p38MAPK、NF-κB相对表达量及细胞上清液中TNF-α、IL-1、IL-6的分泌量明显上调(P<0.01),p53相对表达量明显下调(P<0.01)。50μmol·L^(-1)槲皮素、异槲皮苷、金丝桃苷、槲皮素-3'-O-葡萄糖苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷分别给药后,各蛋白的相对表达量及炎症因子的分泌量接近正常组。结论黄属葵花中5种黄酮类化合物能明显抑制肠道L细胞AGEs/RAGE/p38MAPK/NF-κB信号通路。

糖基化终产物对P38MAPK/NF-κB通路诱导的肠道L细胞损伤的影响

目的探讨糖基化终产物(AGEs)在其下游信号通路诱导的肠道L细胞(GLUTag)致炎症损伤中的作用及其机制。方法将肠道L细胞分成6组,即空白对照组、BSA对照组、100μg/ml AGEs干预组、200μg/ml AGEs干预组、300μg/ml AGEs干预组、apocynin(NADPH氧化酶阻断剂)+AGEs(200μg/ml)共培养干预组。各组细胞培养24h后,采用ELISA检测胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌水平和炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1(IL-1)、IL-6的表达水平,RT-PCR检测p38MAPK及NF-κB p65 mRNA水平,Western blotting检测p38MAPK、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和NF-κB p65蛋白表达水平。结果与对照组相比,AGEs干预肠道L细胞后,AGEs浓度越高,GLP-1分泌水平下降越明显,呈剂量依赖性(P<0.05),同时p38MAPK及NF-κB p65 mRNA水平明显升高,亦呈剂量依赖性(P<0.05),而炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6分泌水平也随着AGEs浓度的升高而升高。与AGEs干预组相比,在apocynin干预后,NADPH氧化酶活性受到抑制,GLP-1分泌水平明显升高(P<0.05)。此外,p-p38MAPK和NF-κB p65蛋白表达水平变化与上述mRNA变化趋势一致。结论 AGEs与AGEs受体(RAGE)结合后激活NADPH/p38MAPK/NF-κB信号通路,可能是肠道L细胞早期炎症损伤并最终导致GLP-1分泌减少的作用机制之一。

二甲双胍对2型糖尿病大鼠肠道L细胞及味觉受体的影响

目的观察二甲双胍对于2型糖尿病大鼠肠道L细胞功能及味觉受体相关蛋白的影响。方法将18只健康的8~10周龄雄性Wistar大鼠经高糖高脂饮食4周后予链脲佐菌素（STZ）成模。随机分为三组：模型组＋二甲双胍、模型组＋普食;对照组。分别于成模干预前和干预第6周时行口服糖耐量实验（OGTT）,并测血脂及胰高血糖素样肽-1（GLP-1）表达量。第6周时处死大鼠,并留取肠道组织标本运用real-time RT-PCR法检测胰高血糖素原（PG）基因,Western blot检测葡萄糖转运蛋白-2（GLUT-2）、味觉受体T1R2、T1R3及Gαgust蛋白的表达。结果干预后二甲双胍组和正常组的随机血糖均较干预前明显下降,差异有统计学意义（P〈0.01）,且二甲双胍组下降更明显（P〈0.05）。干预后二甲双胍组血清总胆固醇（CHOL）较干预前明显改善（P〈0.05）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、甘油三酯（TG）均较干预前也有所下降,但差异无统计学意义（P〉0.05）,且与正常组、对照组干预后相比,二甲双胍组CHOL明显下降（P〈0.01）,LDL-C及TG也有所下降,但差异无统计学意义（P〉0.05）。干预6周后,二甲双胍组空腹血清GLP-1的表达量较干预前增加,且比正常组和对照组高,差异有统计学意义（P〈0.05）;高糖负荷后,二甲双胍组血清GLP-1表达水平明显增加,且与正常组及对照组相比差异有统计学意义（P〈0.05）。结论二甲双胍具有良好的降糖降脂的作用;二甲双胍可能具有通过上调肠道L细胞内PG基因的表达,从而促进肠道L细胞GLP-1的产生,同时影响GLUT-2、味觉受体及其下游的信号因子Gαgust表达,进而间接起到降糖的作用。

miR-425-5p对脂多糖诱导的肠道L细胞GLP-1分泌的影响及机制研究

目的探讨miR-425-5p对脂多糖诱导的肠道L细胞胰升糖素样肽1(GLP-1)分泌的影响及其机制。方法采用脂多糖孵育肠道L细胞系GLUTag细胞,检测miR-425-5p和GLP-1的表达和分泌;采用MTT法测定细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡。采用实时定量PCR和Western印迹法检测miR-425-5p、磷酸酶和张力蛋白同源基因(PTEN)、胰升糖素原mRNA和蛋白的表达。通过检测TOP/FOP比率测定Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路的活性。采用双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀(ChIP)明确miR-425-5p与PTEN、β-catenin之间的相互作用。结果在GLUTag细胞中,随着脂多糖浓度的升高,miR-425-5p表达增加,活性GLP-1水平降低,细胞凋亡增加,细胞活力下降;而且miR-425-5p参与脂多糖对GLP-1表达和肠道L细胞活力的调节作用。抑制miR-425-5p可降低胰升糖素原mRNA表达和TOP/FOP比率,提高PTEN蛋白水平,抑制细胞活力。在脂多糖诱导下,miR-425-5p通过靶向PTEN上调β-catenin的表达水平,而β-catenin作为顺式作用元件诱导胰升糖素原的转录,进而促进GLP-1的表达。结论在脂多糖诱导的肠道L细胞中,miR-425-5p通过靶向PTEN调控β-catenin水平进而促进GLP-1的分泌。

基于肠道L细胞葡萄糖转运体表达的小檗碱降糖机制研究

目的:基于肠道L细胞的葡萄糖转运体表达调控探讨小檗碱降糖机制。方法:以CCK8法及实时无标记细胞分析技术(RTCA)测定小檗碱对STC-1细胞活性的影响。ELISA及葡萄糖氧化酶(GOD-POD)法测定小檗碱对STC-1细胞胰高血糖素样肽-1(GLP-1)分泌及葡萄糖消耗的影响,利用qRT-PCR及Western blot技术分析细胞中钠/葡萄糖协同转运蛋白1(SGLT1)、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)mRNA及蛋白表达情况。结果:与正常组比较,5、10、50μmol/L小檗碱显著促进STC-1细胞分泌GLP-1(P<0.01,P<0.05)。10、50μmol/L小檗碱促进葡萄糖的消耗(P<0.01),上调STC-1细胞的SGLT1 mRNA表达(P<0.05),50μmol/L小檗碱上调SGLT1蛋白表达(P<0.05),而各浓度小檗碱对STC-1细胞的GLUT2 mRNA和蛋白的表达量无显著影响。结论:小檗碱促进STC-1细胞GLP-1分泌、提高糖消耗,其作用机制可能与上调SGLT1的表达有关。

糖基化终产物通过其受体激活NADPH氧化酶及其下游通路诱导L细胞的凋亡

目的:探讨糖基化终产物(AGEs)与其受体(RAGE)及其下游信号通路在肠道L细胞(GLUTag)凋亡中的作用。方法:首先将不同浓度的AGEs作用于GLUTag细胞24 h后,RT-PCR及Western blot检测各组细胞RAGE mRNA及蛋白表达水平。然后将细胞分为BSA对照组、AGEs 200μg/mL组、AGEs+siRNA-RAGE组、AGEs+apocynin组。采用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率,荧光探针检测细胞内活性氧水平,Western blot检测NADPH氧化酶亚单位p22^(phox)、p47^(phox)磷酸化水平和Bcl-2、Bax蛋白表达水平。结果:AGEs干预后GLUTag细胞RAGE mRNA及蛋白表达水平呈剂量依赖性增加。AGEs单独处理组与BSA对照组相比,细胞凋亡率显著增加,NADPH氧化酶亚单位p22^(phox)、p47^(phox)的表达增多,细胞内ROS水平升高,促凋亡蛋白Bax表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调。AGEs+apocynin组、AGEs+siRNA-RAGE组与AGEs单独处理组相比,细胞凋亡率显著下降,NADPH氧化酶亚单位p22^(phox)、p47^(phox)的表达减少,细胞内ROS水平下降,促凋亡蛋白Bax表达下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调。结论:AGEs作用于GLUTag,可上调细胞RAGE受体表达,激活NADPH氧化酶,使细胞内ROS生成增多,进而通过p53/Bax途径诱导GLUTag凋亡。