芪连结肠宁对溃疡性结肠炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路及肠黏膜保护因子的影响

目的研究芪连结肠宁对溃疡性结肠炎大鼠TLR4/NF-κB信号通路及肠黏膜保护因子的影响。方法健康雄性SD大鼠50只,随机分为正常组、模型组、芪连结肠宁低、中、高剂量组,每组10只。采用5%葡聚糖硫酸钠(DSS)喂养建立溃疡性结肠炎大鼠模型,连续给药3周后检测指标。观察体质量变化及DAI评分;HE染色观察结肠组织病理情况;免疫组化法观察结肠组织MUC2表达情况;Western blot检测结肠组织TLR4、NF-κB p65、IL-6、TNF-α、MUC2、TFF3蛋白表达水平;实时荧光定量PCR检测结肠组织MUC2、TFF3 mRNA的表达。结果芪连结肠宁各组大鼠在给药之后体质量明显增加(P<0.01),DAI评分明显降低(P<0.01),且中、高剂量组具有明显优势。芪连结肠宁各组大鼠结肠组织病理损伤不同程度恢复,MUC2、TFF3蛋白表达相比于模型组均明显增加(P<0.01)。与模型组比较,芪连结肠宁各组大鼠结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表达均有不同程度的下降(P<0.05,P<0.01),TFF3 mRNA相对表达量显著增加(P<0.01)。结论芪连结肠宁能有效恢复溃疡性结肠炎模型大鼠结肠组织的病理损伤,降低DAI评分,降低结肠组织TLR4、p-NF-κB p65、IL-6、TNF-α蛋白表达,增加MUC2、TFF3蛋白及TFF3 mRNA的表达,进而治疗溃疡性结肠炎,其中芪连结肠宁中、高剂量组疗效及调节作用较为显著。

猪肠黏膜保护因子HO-1的短小芽孢杆菌表达系统建立与分析

【目的】对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)基因进行克隆及原核表达,为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】根据GenBank中公布的HO-1序列(登录号:NM_001004027.1),利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段,将其与pMD19-T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆进行PCR鉴定;将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行SalⅠ和KpnⅠ双酶切,使用T4 DNA连接酶连接,利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌,使用IPTG进行诱导表达,应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】猪HO-1基因全长897 bp,编码298个氨基酸。双酶切后在约5200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段,证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1;电转后的双酶切结果表明,在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段,证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现,在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹,表明成功表达了HO-1的重组蛋白,且为胞外分泌。【结论】本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体,pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。