质粒pUDKH基因治疗大鼠肢体动脉闭塞病的实验研究

目的 研究携带人肝细胞生长因子 (HGF)基因的质粒pUDKH对大鼠肢体动脉闭塞病的治疗效果及最低有效剂量。方法 手术结扎大鼠左侧后肢股动脉 ,造成急性缺血性血管病模型。并随机分为 5组 ,每组 10只 ,在手术后即刻将 pUDKH以 5 0 μg、10 0 μg、2 0 0 μg、4 0 0 μg、0 μg剂量一次多点注射于结扎部位肌肉内 ,并于注射后第 10天 ,评价各组血管新生及肌肉组织的情况。另 12只大鼠手术后即刻局部多点注射 2 0 0 μgpUDKH( 6只 )或pUDK( 6只 ) ,注射后不同时间点 (第 3,5 ,10 ,14 ,2 1天 )检测骨骼肌组织中HGF的表达。结果 于转移pUDKH质粒后第 3、5、10、14天肌肉标本与对照组比较均可见较强的HGF的表达。第 10天观察到pUDKH组 (除 5 0 μg组外 ) ,在肌肉组织间或软组织中有丰富的小血管形成。半定量评价各组血管再生程度 ,pUDKH 10 0 μg组 ( 0 96± 0 0 7)、2 0 0 μg组 ( 1 97± 0 91)、4 0 0 μg组 ( 2 2 6± 1 0 0 )与对照组 ( 0 2 7± 0 0 4 )之间差异有显著意义 (P <0 0 5 )。结论 人肝细胞生长因子基因治疗大鼠肢体动脉闭塞病是有效的 ,且以 10 0 μg组为最低有效剂量。

人肝细胞生长因子基因治疗犬肢体动脉闭塞病

以犬急性后肢完全缺血为模型, 观察携带人肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)基因的质粒(pUDKH)的治疗效果. 在完全结扎一侧股动脉及其分支后, 立即将不同剂量的裸露质粒 pUDKH一次性多点直接注射至结扎部位附近的局部肌肉内, 30 d时血管造影可见各剂量治疗组均有丰富的新生血管和侧枝循环的形成, 90 d时更为明显, 从而恢复了下肢远端血液供应; 而转移空质粒的对照组仅见少量新生血管. 另外, 各组在转移pUDKH后90 d时股动脉血流量均已恢复到结扎前的水平, 而转移空质粒的各组股动脉血流量恢复较慢, 仅为结扎前的1/5～1/3. 股动脉脉搏幅度测定结果也表明, 转移pUDKH的各组在90 d时脉搏幅度均得到恢复, 而对照组犬多数几乎测不到脉搏. 经比格犬长期毒性和大鼠急性毒性实验, 血液生化及病理检查未发现有转基因诱发的不良作用. 从而认为局部肌肉注射质粒pUDKH可促进犬完全缺血肢体血管的重建, 对肢体动脉闭塞病有潜在的临床治疗作用.

离子交换高效液相色谱法分析质粒pUDKH

采用阴离子交换高效液相色谱法监测重组质粒pUDKH的生产过程和该质粒产物中超螺旋pUDKH的比例。所用的色谱条件为:色谱柱TSKgelDNA NPR(4 6mmi d ×75mm);流动相体系由20mmol/LTris HCl(pH8 8)和1mol/LNaCl组成,梯度洗脱方式。分析结果表明:质粒产物中超螺旋pUDKH含量达95%(质量分数)以上时,检测不到残留的核糖核酸(RNA)。高效液相色谱法检测质粒pUDKH产物及其生产过程的灵敏度高、试样用量少,分辨率高。

基因治疗药物研究

1990年美国NIH正式批准首例基因治疗方案的临床试验以来，全球已有五百多个基因治疗方案陆续进人临床试验，受试人数超过3000人，其中有5个肿瘤基因治疗产品已进入临床Ⅲ期。国内已批准转导Ⅸ因子基因的体细胞治疗血友病B，腺病毒介导的P53基因或Ⅱ，2基因。