G蛋白、蛋白激酶C和Na^+-H^+交换在内皮素-1诱导培养心肌细胞肥大反应中的作用

内皮系-1（ET-1）是一种强的生长因子，并诱导心肌细胞肥大反应。在本实验中，我们探讨了G蛋白、蛋白激酶C（PKC）和Na＋－H＋交换在ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用。ET-1（10－10～10－7mol／L）促进3H－亮氨酸掺入，增加细胞蛋白质的含量和心肌细胞的表面积，且呈剂量依赖性，它们的EC50分别为5．2×10-10，5．2×10－10和7．3×10－10mol／L。用蛋白激酶C（PKC）抑制剂，Staurosporin（2nmol／L）预处理心肌细胞，可完全阻断ET-1诱导的心肌细胞的这些肥大反应，而蛋白激酶C激动剂，佛波酸酯（PMA）（10－8～10－6mol／L）呈剂量依赖性促进心肌细胞的肥大反应。用Na＋－H＋交换抑制剂，氨氯毗咪（10-4mol／L）预处理心肌细胞，可抑制ET－1诱导的心肌细胞肥大反应，但不影响PMA诱导的心肌细胞肥大反应。百日咳毒素（150ng／ml）预处理心肌细胞，可明显抑制ET－1诱导的心肌细胞肥大反应。这些结果提示，ET-1诱导的培养新生大鼠心肌细胞肥大反应是与百日咳毒素敏感的G蛋白相耦联，蛋白激酶C和Na＋．H＋交换可能在ET-1诱导的心肌细胞肥大反应中是重要的细胞内信使转导途径。

MKP-1在血管紧张素Ⅱ导致心肌肥大反应中的调控作用

本研究主要从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶 1(MKP 1)角度 ,研究丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)信号途径在血管紧张素Ⅱ介导的新生大鼠心肌细胞肥大反应中的作用及调控机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应的指标 ,以凝胶内MBP原位磷酸化测定MAPK活性 ,以免疫印迹法 (Westernboltting)分别测定MKP 1及磷酸化p44MAPK、p42MAPK蛋白表达。结果发现 :(1)AngⅡ (10 -7mol/L)处理 48h ,心肌细胞 3H 亮氨酸掺入率、蛋白含量及细胞表面积明显增加 ,AngⅡ增加 3H 亮氨酸掺入的作用可被血管紧张素Ⅱ 1型受体 (AT1受体 )拮抗剂CV11974(10 -6mol/L)明显抑制 (抑制 85 % ) ,被MAPK激酶 (MEK)特异性抑制剂PD0 980 5 9(5× 10 -5mol/L)部分抑制 (抑制 32 5 % ) ;(2 )CV11974或PD0 980 5 9可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达及MAPK酶活性 (以γ 32 P ATP掺入表示 ) ;(3)以磷酸化MAPK蛋白表达反映MAPK活性 ,可见AngⅡ处理心肌细胞5min ,MAPK活性即开始增加 ,30min左右达到高峰 ,2h后基本恢复正常 ;而MKP 1蛋白表达 30min即见增加 ,持续 2h以上 ;(4 )用放线菌素D (actinomycinD)处理心肌细胞 30min可明显抑制MKP 1的表达 ,同时使AngⅡ致磷酸化MAPK蛋白表达时间延长至 2h以上。

一氧化氮抑制AngⅡ介导的心肌肥大反应的信号机制

本文主要利用培养的新生大鼠心肌细胞 ,从细胞学及分子生物学角度研究一氧化氮 (NO)信号系统在AngⅡ介导的心肌肥大反应中的作用及机制。实验以心肌细胞蛋白合成速率、心房钠尿肽 (ANP)的表达作为心肌肥大反应的指标 ,以硝酸盐及亚硝酸盐含量反映心肌细胞NO水平 ,以免疫印迹法测定MKP 1蛋白表达 ,以RT PCR测定eNOSmRNA水平。结果发现 :(1)L 精氨酸 (L Arg) 10、10 0 μmol/L分别增加心肌细胞NO水平 16 %及 31%,L Arg (10 0 μmol/L)还可增加心肌细胞eNOSmRNA表达 ,其作用可被NOS抑制剂 L NAME所抑制 ;(2 )L Arg (10 0 μmol/L)可降低AngⅡ (0 1μmol/L)诱导的心肌细胞ANPmRNA表达水平和蛋白合成速率 ,而在L Arg处理之前用针对MKP 1的反义寡核苷酸转染心肌细胞 ,蛋白合成速率明显增加 ,可取消L Arg的抑制作用 ,甚至超过AngⅡ组 ;(3)L Arg (10 0 μmol/L)明显增加MKP 1蛋白表达 ,比对照组增加 2 2 5 %,NOS抑制剂L NAME及蛋白激酶G(PKG)抑制剂KT 5 82 3皆可抑制L Arg诱导的MKP 1蛋白表达 ,分别抑制 88%、83%,而AngⅡ能增加L Arg诱导的MKP 1的表达 ,较对照组增加 36 5 %,增强了L Arg的作用。以上结果表明 ,NO抑制AngⅡ介导心肌肥大反应的机制可能是通过激活PKG ,促进MKP 1的表达 。

血管紧张素Ⅱ介导的心肌细胞肥大反应中磷酸化MAPK的作用

【目的】本研究主要是从丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK)激活及失活角度研究该信号途径在血管紧张素Ⅱ (an giotensinⅡ ,AngⅡ )介导的心肌细胞肥大反应中作用。【方法】实验分别以 :①心肌细胞蛋白合成速率作为心肌肥大反应指标 ;②磷酸化MAPK蛋白 (p44MAPK、p42MAPK)表达反映MAPK活性状态。【结果】①AngⅡ (0 .1μmol/L)处理心肌细胞 48h ,可使3H 亮氨酸掺入明显增加 ,该作用可被CV11974明显抑制 (抑制 85 % ) ,而PD0 980 5 9可部分抑制该反应 (抑制 32 5 % ) ;②AngⅡ (0 .1μmol/L)处理心肌细胞 5min ,磷酸化MAPK蛋白表达即开始增加 ,30min左右达到高峰 ,2h基本恢复正常 ,血管紧张素Ⅱ的Ⅰ型受体 (AT1)拮抗剂CV11974(0 .1mmol/L)或MAPK激酶 (MEK)特异性抑制剂PD0 980 5 9(5 0 μmol/L)可明显抑制AngⅡ介导的磷酸化MAPK蛋白表达 (30min时分别下降 89%及 81% )。【结论】AngⅡ主要通过AT1受体激活MAPK及介导心肌肥大反应 ,抑制MAPK的激活可减轻AngⅡ介导的心肌肥大反应。MAPK通路激活是AngⅡ介导的心肌肥大反应重要机制。

雌、孕激素对ET-1诱导的心肌细胞肥大反应的影响

目的观察不同浓度的17β-雌二醇(E2)和孕酮(P)单独及联合运用对内皮素-1(ET-1)诱导的心肌细胞肥大反应的影响。方法以ET-1刺激体外培养的新生大鼠心肌细胞,建立心肌肥大细胞模型,以心肌细胞[3H]-亮氨酸(3H-leu)掺入作为心肌肥大反应的指标。结果E2可明显抑制ET-1诱导的心肌细胞3H-leu掺入的增加,而P对此无显著作用;E2/P联合运用时,P对E2降低ET-1诱导的心肌细胞3H-leu掺入增加的作用具有一定程度的抑制作用。结论E2可抑制ET-1诱导的心肌细胞肥大反应,E2/P联合使用时,P可一定程度的抑制E2对心肌的保护效应,应用时应以低浓度为宜。

MKP-1在17β-雌二醇抑制ET-1诱导的心肌肥大反应中的调控作用

目的从丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(MKP-1)的角度研究ERK1/2信号通路在17β-雌二醇(E2)抑制内皮素-1(ET-1)诱导的心肌肥大反应中的作用及其调控机制。方法利用培养的新生大鼠心肌细胞,以蛋白合成速率、蛋白含量及细胞表面积作为心肌肥大反应指标,以免疫印迹法分别测定磷酸化ERK1/2及MKP-1蛋白的表达。结果①E2明显抑制ET-1诱导的心肌肥大反应;②E2可抑制ET-1诱导的ERK1/2活性增加;③ET-1刺激条件下,E2可使心肌细胞MKP-1蛋白表达进一步增加。结论 E2可通过增加心肌细胞MKP-1蛋白表达,抑制ET-1诱导的心肌细胞ERK1/2活性增高,从而抑制ET-1诱导的心肌肥大反应。

过表达p53对机械负荷导致的心肌细胞肥大反应的影响

目的:观察心肌细胞内过表达p53对机械牵张引起的心肌细胞肥大反应的影响。方法:使用大鼠乳鼠来源的心肌细胞,对贴壁培养在硅胶培养皿内的心肌细胞进行0min、5min、10min、30min、1h和2h的机械牵张,以Western blot法检测心肌细胞肥大反应相关蛋白激酶细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在不同时间牵张后磷酸化水平变化的时间特点;将含p53基因的重组腺病毒载体(p53-Adv)转染心肌细胞使之高表达p53蛋白,再行同样的不同时间的机械牵张,观察磷酸化ERK1/2表达的时间变化特点;最后将两部分结果对比以明确p53过表达对机械牵张后ERK1/2磷酸化变化的影响。结果:未行p53-Adv转染时5min牵张组磷酸化ERK1/2表达比0min牵张组明显升高(P<0.05),并且随着牵张时间的延长ERK1/2磷酸化水平逐步增高;而p53-Adv转染后,5min牵张组磷酸化ERK1/2表达较0min牵张组仍增加(P<0.05),但更长时间牵张组较0min牵张组ERK1/2磷酸化水平不升反降(P<0.05),以2h组最低(P<0.05)。结论:心肌细胞内过表达p53后,虽然不影响短期牵张(5min)的ERK1/2磷酸化水平的升高,但明显抑制更长时间牵张后的磷酸化ERK1/2表达,提示心肌细胞内的p53对机械负荷后晚期的心肌肥厚反应有抑制作用,p53可能与心肌肥厚由代偿期向失代偿期的转化有关。

1-磷酸鞘氨醇(S1P)对H9c2心肌细胞肥大反应的保护作用

目的:研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)对H9c2心肌细胞肥大反应的影响。方法:将培养的H9c2心肌细胞随机分为4组,即正常对照组、S1P(1μmol/L)处理组、苯肾上腺素(PE,100μmol/L)处理组、PE(100μmol/L)加S1P(1μmol/L)处理组,每组设3个复孔。处理24 h后应用Actin-Trakcer Green免疫荧光染色检测各组心肌细胞形态大小;Real-Time PCR技术测定各组H9c2心肌细胞中肥大标志物ANP、BNP及β-MHC的转录水平;Western印迹法测定各组中ANP的蛋白表达情况。然后将H9c2心肌细胞随机分为5组,即正常对照组、PE(100μmol/L)组、PE(100μmol/L)加低浓度S1P(0.1μmol/L)组、PE加中浓度S1P(1μmol/L)组、PE加高浓度S1P(10μmol/L)组,每组设3个复孔。处理24 h后应用Western印迹法测定低、中、高浓度S1P干预下磷酸化的Janus激酶2(JAK2)及信号转导和转录激活子3(STAT3)的蛋白表达水平。每项试验独立重复三次。结果:与正常对照组比较,PE组的H9c2心肌细胞表面积显著增大(P<0.05),ANP、BNP及β-MHC的转录水平显著升高(P均<0.05),ANP的表达亦显著升高(P<0.05),而与PE组比较,PE加S1P组的H9c2心肌细胞表面积显著减小(P<0.05),ANP、BNP及β-MHC的转录水平显著降低(P均<0.05),ANP的表达亦显著降低(P<0.05);在PE加不同浓度S1P处理后,与正常对照组及PE组相比,p-JAK2和p-STAT3表达均显著升高(P<0.05),且呈一定的剂量依赖性。结论:S1P可以减轻PE诱导的心肌细胞肥大反应,这一保护作用可能与JAK2/STAT3信号通路的激活相关。

微管蛋白在体外牵张刺激诱导心肌细胞肥大反应中的作用

目的 探讨细胞骨架微管蛋白在牵张刺激心肌细胞肥大反应中的作用。方法 通过体外牵张培养的心肌细胞 ,采用3H 亮氨酸掺入法和四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法反映心肌细胞肥大指标和活心肌细胞数目 ,激光共聚焦定性、定量微管蛋白的合成和分布情况。结果 2 0 %的持续性牵张引起心肌细胞的3H 亮氨酸掺入量 [12h为 (1870 0± 112 5 )cpm ,2 4h为 (2 0 15 5± 193 7)cpm],与对照组 [12h为 (112 2 7± 12 6 5 )cpm ,2 4h为 (12 10 7± 2 2 2 7)cpm]比较显著增加 ,微管解聚剂秋水仙素 (4μmol L)可以明显抑制3H 亮氨酸掺入量 [12h为 (12 92 7± 14 2 6 )cpm ,2 4h为 (132 7 8± 97 4 )cpm]。牵张 12h即可见微管蛋白荧光强度增强 ,2 4h部分细胞呈现微管蛋白结构坍塌 ,纹理模糊 ,荧光强度分布不均 ,微管蛋白最高光密度值 16 0 0 (任意单位 ) ,可被 4 μmol L秋水仙素抑制。 结论 细胞骨架微管蛋白系统是牵张刺激诱导心肌细胞肥大反应的细胞内信号传递途径之一。

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