基于生物信息学分析肥大细胞表达膜蛋白1在胃癌中的表达及其与免疫浸润的关系

目的探讨肥大细胞表达膜蛋白1(mast cell expressed membrane protein 1,MCEMP1)在胃癌中的表达,及其与胃癌预后及肿瘤免疫浸润的关系。方法基于TCGA数据库,使用R 4.0.5软件分析胃癌肿瘤微环境中的差异基因;使用STRING在线网站构建差异基因的蛋白质-蛋白质互作网络,并和单因素Cox比例风险回归分析结果进行交叉分析以获取关键基因;使用Kruskal-Wallis秩和检验探索关键基因与临床病理特征的相关性;通过基因集富集分析预测关键基因可能参与的信号通路;通过TISIDB在线数据库及CIBERSORT算法进一步分析关键基因表达与胃癌免疫细胞浸润水平及免疫分子表达水平的关系。结果胃癌肿瘤微环境中共有760种差异表达基因,基于蛋白质-蛋白质互作网络和单因素Cox比例风险回归分析结果进行交叉分析得出一个关键基因MCEMP1;MCEMP1在胃癌组织中表达上调(P<0.001),生存分析显示MCEMP1高表达组的总体生存情况差于低表达组[HR=1.176,95%CI(1.066,1.297),P=0.046];MCEMP1的表达与年龄、胃癌T分期和临床分期相关(P<0.05);免疫浸润分析结果显示,MCEMP1表达与多种免疫细胞比例及免疫分子表达水平之间存在相关性(P<0.05)。结论MCEMP1可能是胃癌潜在的预后标志物,并与胃癌免疫浸润有关。

应用RNA干扰抑制EB病毒潜伏膜蛋白-1表达对鼻咽癌细胞生长的影响(英文)

目的探讨能否通过siRNA人工诱导RNA干扰,在EB病毒阳性的鼻咽癌细胞株C611中,选择性抑制潜伏膜蛋白1(LMP1)的表达,并了解LMP1抑制对鼻咽癌细胞生长的影响。方法利用脂质体转染的方法,将人工合成的双链siRNA导入鼻咽癌细胞,通过半定量RT-PCR检测LMP1 mRNA水平的变化。并采用MTT法和流式细胞仪检测LMP1表达抑制后,鼻咽癌细胞增殖和细胞周期的变化。结果C611细胞转染siRNA可使LMP1 mRNA水平下降90%以上。LMP1基因抑制后,C611细胞增殖速度下降33%;流式细胞检测显示,C611细胞周期在G0-G1期受阻。结论本研究证明,全新的人工诱导RNA干扰技术,能够有效抑制LMP1基因的表达,并降低鼻咽癌细胞的增殖能力,为鼻咽癌研究和抗肿瘤基因治疗提供了新的思路。

上皮膜蛋白-1在人椎间盘髓核细胞中的表达

目的观察上皮膜蛋白-1(epithelia membrane protein-1,EMP-1)在人椎间盘髓核细胞中存在的表达。方法利用我们已建成的人胚椎间盘髓核细胞和退变椎间盘细胞培养体系,采用半定量反转录PCR和免疫组化方法检测EMP-1在这两种细胞中的表达情况。结果人胚及退变椎间盘髓核细胞中EMP-1均有表达,分布在不同部位,且具有一定的丰度。结论 EMP-1在正常和退变椎间盘细胞中的存在和生物学特性改变,提示EMP-1可能在椎间盘退变中担当重要角色。

EB病毒潜伏性膜蛋白1转化NP69细胞的蛋白表达分析

目的探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)转化鼻咽上皮细胞NP69的表达蛋白。方法采用比较蛋白质组学方法,鉴定NP69-pLNSX与NP69-LMP1细胞系中的差异表达蛋白,分析LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白。结果鉴定了LMP1在NP69细胞中参与调节有22个蛋白(表达上调的蛋白9个,下调的13个)。结论LMP1在NP69细胞中可能通过调节Vimentin和Keratin 19等蛋白的表达而起转化作用。

EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白质表达的影响

为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)第三个功能活性区域(CTAR3)在鼻咽上皮细胞NP69中的转化作用机制,采用逆病毒感染的方法,将浓缩的逆病毒RV-LMP1和RV-LMP1△232～351分别感染鼻咽上皮细胞NP69,建立NP69-LMP1与NP69-LMP1△232～351稳定表达细胞系.通过绘制生长曲线、平皿克隆形成试验和软琼脂集落形成试验比较野生型和突变型LMP1对NP69细胞增殖的影响,运用蛋白质组学方法鉴定NP69-LMP1与NP69-LMP1△232～351细胞间的差异表达蛋白,选用实时荧光定量RT-PCR与Western blot对其中部分蛋白质点差异表达进行验证.结果发现:a.突变型LMP1△232～351促NP69细胞增殖的能力较野生型LMP1明显降低(n=3,P<0.05);b.鉴定了LMP1-CTAR3在NP69细胞中参与调节的16个蛋白质(表达上调的蛋白质8个,下调的8个).c.实时荧光定量RT-PCR和Westernblot证实了部分上述蛋白质的差异表达.以上结果说明,LMP1-CTAR3是其发挥促细胞增殖的重要活性部位,可能通过参与调节G蛋白和异柠檬酸脱氢酶等蛋白质的表达而起作用.

干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因的扩增、克隆及蛋白表达

目的研究干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-inducibletransmembraneprotein-1,IFITMP-1)基因的扩增、克隆及蛋白表达。方法以含IFITMP-1基因的cDNA为模板,用Pfu酶做PCR扩增,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,将目的基因克隆到pUCm-T质粒测序。进一步克隆到pET-Trx蛋白表达载体质粒,优化蛋白表达条件。结果含有IFITMP-1基因的PCR产物约1000bp。重组pUCm-T质粒经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切,有相应大小的cDNA片段插入,测序结果显示其序列正确,证实目的基因的扩增、克隆成功,并成功克隆进pET-Trx蛋白表达载体,经IPTG诱导,在BL21(DE3)plysS中有融合蛋白表达。结论成功扩增克隆IFITMP-1基因,并成功表达该基因编码的蛋白,为进一步研究IFITMP-1基因在大肠癌中的作用奠定了基础。

鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1的表达诱发转基因小鼠鼻咽不典型增生

为建立鼻咽癌来源潜伏膜蛋白 1 ( N-L MP1 )转基因小鼠模型 ,从整体的角度研究 N-L MP1的功能 ,进一步阐明 EB病毒在鼻咽癌变过程中的作用 ,应用 DNA重组技术将角质细胞特异性启动子 EDL2与 N-L MP1连接 ,构建转基因 EDL2 -N-L MP1 ;并用显微注射技术 ,将转基因 EDL2 -N-L MP1注射入小鼠受精卵前核 ,再将注射后的受精卵植入假孕母鼠 ,获得转基因鼠 ,然后观察目的基因在鼻咽部的表达和病理变化。本实验共获得 53只转基因鼠 ,PCR法证明其中 6只小鼠有 N-L MP1基因扩增带 ,Southern杂交显示 PCR阳性小鼠有特异的杂交信号 ,整合率为 1 1 .3 % ;1只 4月龄的转基因鼠出现了鼻咽部不典型增生。说明 N-L MP1单独就能诱发小鼠鼻咽部发生癌前病变 ,为 EB病毒可能是鼻咽癌的主要病因提供了有力的证据。

HIV-1跨膜蛋白gp41的截短及表达

将HIV 1跨膜蛋白gp4 1进行截短 ,在大肠杆菌中进行表达并纯化。PCR扩增 gp4 1的部分编码基因 ,回收的PCR产物纯化后克隆到连接载体 pGEM T上 ,然后用EcoRⅠ和Sa1Ⅰ切下目的基因 ,并构建到表达载体pGEX 4T3上 ,导入宿主细胞BL2 1(DE3) ,用IPTG诱导表达 ,表达产物用亲和层析进行纯化并作相应鉴定。截短的HIV 1跨膜蛋白 gp4 1能直接在大肠杆菌内进行表达 ,利用亲和层析能方便地将目的蛋白进行纯化 。

超表达转运膜蛋白21对介导阿尔茨海默氏病γ分泌酶复合物重要组分PS-1及NCT蛋白表达量的影响

研究转运膜蛋白21(TMP21)在小鼠胚胎成纤维细胞中超表达对PS-1及NCT蛋白表达量的影响.脂质体介导TMP21 cDNA转染敲除淀粉样前体蛋白表达基因的小鼠胚胎成纤维细胞系(MEF(KO)),以梯度浓度G418筛选TMP21表达量最高的细胞.处理超表达组(T)和对照组(C)细胞,并收集纯化过程中含γ分泌酶复合物的样本,用Western blotting检测γ分泌酶复合物重要组分Nicastrin(NCT)、Presenilin-1(PS-1)以及TMP21的蛋白表达量.结果表明,样本T1、T2及IPT2所含TMP21的蛋白表达量较相应对照组样本C1、C2和IPC2分别上升11.5%(P=0.08)、28.1%(P<0.01)及69.1%(P<0.001),提示经TMP21 cDNA转染后MEF(KO)细胞中TMP21蛋白表达明显提高,而转染组和对照组中,构成γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量无明显变化.这表明在TMP21蛋白高表达状态下,不会影响MEF(KO)细胞中γ分泌酶复合物的重要组分NCT与PS-1蛋白表达量.

重组HIV-1跨膜蛋白gp41在大肠杆菌中的表达

1目的 构建重组 HIV- 1SF2株跨膜蛋白 gp41基因片段的原核表达克隆并在大肠杆菌中表达。2方法 通过聚合酶链反应 (PCR)扩增目的基因 ,然后用限制性内切酶将其与原核表达载体 p MAL - p2定向连接 ,构建成重组质粒转入大肠杆菌 DH5α菌中。经 IPTG诱导 ,SDS- PAGE电泳分析有无重组蛋白表达。3结果 获得了重组的原核表达质粒及其表达产物。4结论 在 p MAL - p2中构建的 HIV - 1gp41重组质粒可在大肠杆菌中表达。

EB病毒潜伏膜蛋白2A_(1-119)重组质粒的表达及鉴定

目的:构建含EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白(LMP)2A N端1-119基因的重组质粒,探讨其在原核表达系统中的表达情况。方法:采用RT-PCR方法从B95-8细胞中获得LMP2A1-119外显子基因片段,并克隆到pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NTA离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果:pGEX/LMP2A1-119重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达。SDS-PAGE结果表明表达产物相对分子质量约为50 kD,West-ern blot结果证实其为目的蛋白。结论:EBV LMP2A1-119蛋白可在pGEX-4T-1原核表达系统中表达,为进一步研究其免疫学特性打下了基础。

高尔基膜蛋白1在前列腺癌中的表达及意义

目的探讨新型高尔基相关蛋白高尔基膜蛋白1(golgi membrane protein 1,GOLM1)在前列腺癌组织中的表达特点及在诊断中的临床价值。方法获取正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌等不同前列腺组织芯片,采用免疫组化法检测GOLM1蛋白的表达,并分析其表达差异。在人前列腺癌细胞(human prostate cancer cell,PC-3)、DU145和22Rv1三种不同前列腺癌细胞系中,分别采用定量PCR技术和Western blot方法,同时检测GOLM1在mRNA水平和蛋白水平的表达情况。在DU145中,使用免疫荧光技术观察GOLM1在前列腺癌细胞中的定位情况。结果GOLM1在正常前列腺、良性前列腺增生和前列腺癌组织中表达程度不同,其中阳性表达率分别为40.0%(4/10)、50.0%(10/20)和92.0%(46/50),前列腺癌组织中阳性表达率显著高于其他两组,差异有统计学意义(P<0.05)。但病理结果显示,GOLM1的高表达状态与肿瘤Gleason分级和病理分期则差异无统计学意义(P>0.05)。PC-3、DU145和22Rv1三种不同前列腺癌细胞中均见GOLM1表达,激素依赖型前列腺癌细胞22Rv1显著低于激素非依赖型前列腺癌细胞(PC-3和DU145),差异有统计学意义(P<0.05)。GOLM1定位于前列腺癌细胞DU145高尔基体顺面网络结构。结论与正常前列腺和良性前列腺增生相比,GOLM1在前列腺癌中表达明显升高,是一种潜在的肿瘤标志物,进一步研究其在前列腺癌中的作用机制具有重要意义。

雷公藤红素对HMC-1细胞凋亡相关基因表达的影响

目的 :探讨雷公藤红素诱导人肥大细胞系 HMC- 1细胞凋亡的基因调节机制。 方法 :雷公藤红素 (0 .5μmol/ L )与HMC- 1细胞共育不同时间 (4、8或 12 h)后 ,用 RT- PCR、免疫组化方法检测 bcl- 2家族、c- m yc、白细胞介素 1β转换酶 (ICE)基因在 m RNA和蛋白质水平表达的变化 ,并分析它们在细胞凋亡中的作用。 结果 :HMC- 1细胞本已存在 Bcl- 2、Bax、C- myc蛋白表达 ;雷公藤红素作用后 ,Bcl- 2蛋白表达受到抑制 ,Bax、C- m yc蛋白表达增加。 HMC- 1细胞能自发表达 bcl- 2、bax、 bcl- XL 和ICE的 m RNA,在雷公藤红素作用下 ,bcl- 2、bax、bcl- XL 的 m RNA表达水平均下降 (以 bcl- 2下降最为明显 ) ,而 ICE m RNA 3次检测 2次上升 ,1次下降。 结论 :雷公藤红素诱导 HMC-

EB病毒LMP1促鼻咽上皮细胞增殖的蛋白分子鉴定

目的:探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)促鼻咽上皮细胞增殖的分子机制。方法:采用逆病毒感染的方法,将浓缩的逆病毒RV-pLNSX(空载体)和RV-LMP1分别感染鼻咽上皮细胞NP69,建立NP69-pLN-SX与NP69-LMP1稳定表达细胞系,通过绘制细胞生长曲线、平皿克隆形成实验和软琼脂集落形成实验检测LMP1对NP69细胞增殖的影响;运用比较蛋白质组学方法鉴定LMP1在NP69细胞中参与调节的蛋白,并对部分蛋白表达进行验证。结果:(1)LMP1具有促鼻咽上皮细胞NP69增殖的作用(n=3,P<0.05)。(2)鉴定了22个LMP1参与调节NP69细胞的蛋白(表达上调的蛋白9个,下调的13个),实时荧光定量RT-PCR和Western blotting证实了部分上述蛋白的差异表达。结论:LMP1可能通过参与调节keratin19和vimentin等蛋白的表达促鼻咽上皮细胞NP69增殖。

干扰素诱导的跨膜蛋白-1对诊断结直肠癌的临床价值

目的探讨干扰素诱导的跨膜蛋白-1(IFITM1)基因在肿瘤组织中的表达,血清抗IFITM1的抗体反应以及对临床诊断结直肠癌的意义。方法应用半定量RT-PCR方法检测IFITM1基因mRNA在正常大肠粘膜、结直肠癌组织、大肠炎性息肉、腺瘤性息肉、胃癌、食管癌和肝癌组织中的表达。采用Western印迹法检测患者血清抗IFITM1的抗体反应。分析有IFITM1基因表达癌肿的病理特点。结果结直肠癌组织中IFITM1基因mRNA表达率为47.4%(18/38),显著高于大肠腺瘤性息肉的15%(3/20)和胃癌组织的4.8%(1/21)(P<0.05),而正常大肠粘膜、大肠炎性息肉、食管癌和肝癌组织均无表达。结直肠癌组织IFITM1基因mRNA呈强表达,其表达水平(0.8048±0.2273)显著高于大肠腺瘤性息肉(0.4447±0.0989)(P<0.001)。结直肠癌血清相应的抗体反应率为36.8%(14/38),明显高于胃癌的9.5%(2/21)(P<0.05),而在食管癌、肝癌、大肠炎性息肉和大肠腺瘤性息肉以及健康人血清则未检测出相应的抗体反应。有IFITM1基因表达的结直肠癌多数直径大于5cm,侵及浆膜,有淋巴结和远处转移,多属DukesC期和D期,以高分化腺癌为主。结论IFITM1基因可能在结直肠癌的发生、发展和转移过程中起重要作用,有望成为临床诊断结直肠癌的一个良好标志物。

鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中EBV-LMP 1的表达

目的:探讨人高分化鼻咽癌细胞系CNE1和人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中EB病毒编码的LMP 1基因表达情况。方法:用免疫组化法及Western bolt法分别检测鼻咽癌细胞系CNE1和CNE2Z中LMP 1基因的表达情况。结果:免疫组化及Western bolt法均显示,CNE2Z细胞中LMP 1呈强阳性表达,而CNE1细胞中LMP 1呈阴性表达。结论:人高分化鼻咽癌细胞系CNE1中没有LMP 1的表达而人低分化鼻咽癌细胞系CNE2Z中LMP 1呈阳性表达,鼻咽癌的恶性程度可能与LMP 1的表达有关。

不同区段HIV-1 env基因在Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统中的表达及检测

利用昆虫细胞杆状病毒表达系统 ,将从一株HIV - 1阳性克隆质粒中获得的几个HIV包膜蛋白基因片段 ,克隆入转移载体中得到重组病毒。用此重组病毒感染昆虫细胞后表达出 3种HIV包膜蛋白 ,即GP12 0 - 41P、GP41T、GP41P ,分别含有HIV - 1包膜糖蛋白GP12 0及部分GP41,删除了N端 12个疏水氨基酸的GP41和仅有主要表位约 2 40个氨基酸的GP41。收获后分别以Western -blotting和EIA检测 ,有较好的免疫学活性 ,其中GP41T的活性最强。该实验为HIV包膜蛋白的结构研究提供了依据 ,加以改进后可能有免疫检测的价值。

肥大细胞与慢性马兜铃酸肾病间质纤维化关系的初步探讨

目的:初步探讨慢性马兜铃酸肾病(CAAN)患者肾间质肥大细胞浸润与间质纤维化之间关系。方法:随机选取CAAN16例、非CAAN的慢性间质性肾炎(CIN)16例及微小病变病(MCD)11例患者肾穿刺组织作为研究对象。采用免疫组织化学、免疫荧光双重染色方法观察类胰蛋白酶(Try)染色阳性的肥大细胞(MCs)、蛋白酶活化受体-2(PAR-2)、转化生长因子-β1(TGF-β1)及Ⅰ型胶原(ColⅠ)表达的变化。结果:与MCD对照组相比,CAAN、CIN组肾间质MCs数量、肾小管上皮细胞PAR-2和TGF-β1及肾间质ColⅠ表达面积显著增加,而CAAN与CIN两组间上述指标无统计学差异;MCs数量与肾小管上皮细胞PAR-2和TGF-β1表达面积及肾间质ColⅠ表达面积呈显著正相关,肾小管上皮细胞PAR-2与TGF-β1表达面积之间也呈显著正相关;MCs数量分别与肾间质PAR-2和TGF-β1阳性细胞数量呈显著正相关,PAR-2阳性细胞数量和TGF-β1阳性细胞数量间也呈显著正相关。肾间质中Try染色阳性细胞与PAR-2或TGF-β1染色阳性细胞存在部分重叠。结论:MCs可能参与CAAN细胞外基质蓄积,推理可能与活化PAR-2,增加TGF-β1表达相关。

多房棘球绦虫葡萄糖转运蛋白1重组抗原肽构建及原核表达方法建立

目的设计构建及表达纯化多房棘球绦虫葡萄糖转运蛋白1重组抗原肽(GLEP),为后续疫苗研究寻找有效工具。方法用生物信息学软件预测EmGLUT1跨膜结构,将设计构建的表达载体pCzn1-GLEP转化入大肠杆菌真核表达系统,经IPTG诱导、Ni-NTA纯化获得目的蛋白。结果生物信息学软件分析结果表明EmGLUT1为12次跨膜蛋白,用柔性序列GS和KK将筛选后的肽段进行串联,构建重组表达载体pCzn1-GLEP,测序及酶切验证成功后,转化入Artic express大肠杆菌表达系统(表达部位鉴定属于可溶性表达),经Ni-NTA亲和柱层析纯化后获得电泳纯级的GLEP蛋白。结论成功构建GLEP的原核表达系统,并得到纯化重组蛋白,为后续疫苗研究提供有效工具。

Mistic融合蛋白促进ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1在大肠埃希菌中高效表达

目的构建真核膜蛋白ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1基因在大肠埃希菌中的高效表达质粒。方法利用分子克隆技术构建携带Fat-1基因的重组原核表达质粒pET32a-Fat-1和插入膜蛋白表达分子伴侣Mistic基因的pET32a-Mistic-Fat-1;将两种重组质粒转化大肠埃希菌株BL21(DE3),IPTG诱导表达Fat-1蛋白和M110-Fat-1蛋白,通过十二烷基-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)灰度分析其表达量,蛋白免疫印迹法(Western blot)进一步鉴定蛋白表达。结果经酶切鉴定和测序证实成功构建了pET32a-Fat-1和pET32a-Mistic-Fat-1原核表达载体;SDS-PAGE和Western blot证实ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1在原核表达系统中没有明显诱导表达,而M110-Fat-1融合蛋白在大肠埃希菌中获得了高效表达,占全细胞蛋白总量的15%。结论ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1基因与Mistic基因融合表达,实现了在原核宿主中高效表达真核膜整合蛋白ω-3脂肪酸去饱和酶Fat-1。