c-fos在CCK-8抗LPS所致的肺动脉平滑肌细胞损伤中的变化

目的 :观察c -fos在八肽胆囊收缩素 (CCK - 8)减轻脂多糖 (LPS)所致的肺动脉平滑肌细胞 (PASMC)损伤中的变化。方法 :贴块法培养大鼠PASMC。应用电镜技术和生化方法 ,观察细胞形态和测定细胞丙二醛 (MDA)含量及乳酸脱氢酶 (LDH)释放率 ;台盼蓝染色法记录PASMC蓝染率的变化 ;免疫细胞化学技术检测细胞内c -fos蛋白的表达情况。结果 :CCK - 8可减轻LPS引起的细胞超微结构损伤 ;CCK - 8可降低LPS引起的细胞台盼蓝摄取率、MDA含量与LDH释放率的增高 ;LPS可轻微上调PASMC内c-fos蛋白表达 ,CCK - 8可使该上调作用显著上升。结论 :CCK - 8可减轻LPS所致的PASMC损伤 ;CCK - 8可能通过使c -fos蛋白表达上调来发挥其抗损伤作用。

虎杖苷调节YAP1/TAZ信号通路对缺氧性肺动脉高压新生大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究虎杖苷(PD)对缺氧性肺动脉高压(HPH)新生大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖与凋亡的影响及其作用机制。方法 将新生大鼠随机分为6组:对照组、模型组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+Hippo通路抑制剂(PD高剂量+XMU-MP-1)组,每组10只。缺氧2周后,检测各组大鼠右心室收缩压(RVSP)和右心室肥厚指数(RVHI),苏木精-伊红(HE)染色观察肺组织病理学变化,并计算肺动脉管壁厚度占总厚度的百分比(WT%)和管壁面积占总面积的百分比(WA%)。分离各组新生大鼠PASMCs,分为NC组、低氧(Hypoxia)组、PD低剂量组、PD中剂量组、PD高剂量组、PD高剂量+XMU-MP-1组。CCK-8和EdU检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹(Western blot)检测肺组织和PASMCs中Yes相关蛋白1(YAP1)、PDZ结合域的转录共刺激因子信号通路(TAZ)、哺乳动物不育系20样激酶1(MST1)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关蛋白(Bax)蛋白表达。结果 与对照组相比,模型组大鼠肺动脉管壁明显增厚,管腔变窄,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著升高(均P<0.05);与模型组相比,PD低、中、高剂量组大鼠肺动脉增厚减少,管腔变大,RVSP、RVHI、WT%、WA%、YAP1、MST1、TAZ蛋白表达显著降低,且PD各组间差异存在剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。与NC组相比,Hypoxia组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著升高,凋亡率、Bax蛋白表达显著降低(均P<0.05);与Hypoxia组相比,PD低、中、高剂量组细胞A_(450nm)值、EdU阳性率、YAP1、MST1、TAZ、Bcl-2蛋白表达显著降低,凋亡率、Bax表达显著升高,且PD各组间有剂量依赖性(均P<0.05);XMU-MP-1可逆转这一结果。结论 PD可能通过抑制YAP1/TAZ信号通路抑制HPH新生大鼠PASMCs增殖,促进凋亡。

Nrf2调控的氧化应激在Adropin抑制低氧肺动脉平滑肌细胞增殖中的作用研究

目的 观察Adropin对低氧诱导的SD大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖及氧化应激的影响,并探讨其可能机制。方法 以1%的O_(2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖及氧化应激的细胞模型,通过活性氧(ROS)激活剂H_(2)O_(2),抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)及不同浓度Adropin(100、300、1000 nmol·L^(-1))干预24 h后,检测细胞增殖及ROS,筛选Adropin抑制增殖及氧化应激的最适浓度。选择1000 nmol·L^(-1) Adropin和/或核因子E2相关因子2(Nfr2)抑制剂ML385在低氧条件下孵育PASMCs 24 h,并设置Nrf2激活剂富马酸二甲酯(DMF)作为阳性对照组,通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖;DCFH-DA探针联合荧光酶标仪测定细胞内ROS的水平;试剂盒检测细胞内超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)的水平;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测Nrf2、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E的表达。结果 与对照组相比较,H_(2)O_(2)及低氧均能够诱导PASMCs增殖及ROS生成,而不同浓度的Adropin(100、300、1000nmol·L^(-1))和NAC均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖及ROS产生,且Adropin抑制增殖及ROS产生具有浓度依赖性。与低氧组相比较,DMF或Adropin(1000 nmol·L^(-1))干预后,PASMCs增殖及细胞内ROS水平下降,SOD、GPx、CAT活性增加,MDA水平下降,Nrf2表达上调(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin的上述作用(P<0.05);DMF或Adropin能够通过抑制Cyclin D1与Cyclin E的表达,阻滞细胞周期于G_(0)/G_(1)期,从而抑制PASMCs增殖(P<0.05),而ML385能够逆转Adropin上述作用(P<0.05)。结论 Adropin可通过抑制氧化应激抑制低氧诱导的PASMCs增殖,其机制可能与激活Nrf2有关。

PI3K/Akt/FoxO1信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响

目的探究磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/叉头框蛋白O1(FoxO1)信号通路对人源肺动脉平滑肌细胞(hPASMC)及肺动脉高压大鼠细胞凋亡的影响。方法细胞实验部分,将hPASMC分为4组:(1)空白对照组;(2)血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)组;(3)PDGF-BB+LY294002组;(4)PDGF-BB+紫杉醇(paclitaxel)组。采用TUNEL检测细胞凋亡,采用蛋白质印迹法检测Bcl-2、裂解的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。动物实验部分,将12只SD大鼠随机分为4组:(1)空白对照组;(2)野百合碱(MCT)组;(3)MCT+LY294002组;(4)MCT+paclitaxel组。采用Western blot检测Bcl-2、cleaved caspase-3和PI3K/Akt/FoxO1信号通路相关蛋白表达水平。结果细胞实验部分:相比于PDGF-BB组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的Bcl-2表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3表达水平上升(P<0.01);相比于空白对照组,PDGF-BB+LY294002组与PDGF-BB+paclitaxel组的凋亡率增加(P<0.01)。动物实验部分:相比于MCT组,MCT+LY294002组与MCT+paclitaxel组Bcl-2、磷酸化Akt与磷酸化FoxO1表达水平下降(P<0.01),cleaved caspase-3与FoxO1表达水平上升(P<0.01)。各组之间PI3K表达水平无显著差异。结论PI3K/Akt/FoxO1信号通路抑制hPASMC与肺动脉高压大鼠肺组织的细胞凋亡。

吲哚-3-甲醇通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的观察吲哚-3-甲醇(I3C)对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的作用。方法采用0.2%Ⅰ型胶原酶消化分离SD大鼠PASMCs,以低氧(1%O2)作为诱导剂,建立PASMCs增殖的细胞模型,以不同浓度的I3C(25、50、100、200μmol·L^(-1))干预24 h,检测细胞增殖及存活率;设置哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂rapamycin或缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)抑制剂LW6为阳性对照组,以100μmol·L^(-1 )I3C,HIF-1α稳定剂DMOG或mTOR激活剂MHY1485干预24 h后,CCK-8试剂盒检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞周期;Western blot检测HIF-1α、总的mTOR及磷酸化的mTOR和细胞周期调控相关蛋白的表达,确定I3C抑制PASMCs增殖的作用机制。结果25~100μmol·L^(-1 )I3C抑制低氧诱导的PASMCs增殖的作用具有浓度依赖性(P<0.05),而100μmol·L^(-1)与200μmol·L^(-1 )I3C抑制细胞增殖的作用无明显差异,且I3C无明显细胞毒性作用。I3C(100μmol·L^(-1))与LW6均可抑制低氧诱导的PASMCs增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期,抑制HIF-1α、细胞周期蛋白(Cyclin)D1、Cyclin E、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2、CDK4和CDK6的表达(P<0.05),且DMOG能够逆转I3C的上述作用(P<0.05)。另外I3C与rapamycin在抑制低氧诱导的PASMCs增殖与mTOR/HIF-1α信号通路活化方面作用相似,且MHY1485能够逆转I3C抑制细胞增殖及mTOR/HIF-1α信号通路活化的作用(P<0.05)。结论I3C可通过抑制mTOR/HIF-1α信号通路减弱低氧诱导的PASMCs增殖。

POSTN通过ERK1/2信号通路诱导肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探索骨膜蛋白(periostin,POSTN)诱导肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)增殖在缺氧诱导肺动脉高压(hypoxia-induced pulmonary hypertension,HPH)发病中的作用及其机制。方法取自雄性大鼠的原代PASMC暴露于缺氧环境模拟HPH,将细胞分为常氧组、缺氧组、缺氧+对照腺病毒转染组(Ad-shNC组)、缺氧+POSTN沉默腺病毒转染组(Ad-shPOSTN组)、POSTN组、POSTN+U0126组。采用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)评估PASMC的纯度,CCK-8法检测细胞活力,Western blot法检测PASMC中POSTN、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、骨形态发生蛋白Ⅱ型受体(bone morphogenetic protein typeⅡreceptor,BMPR2)、磷酸化的细胞外信号调节激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2,p-ERK1/2)及细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase 1/2,ERK1/2)的蛋白表达水平。结果与常氧组比较,缺氧促进PASMC增殖和POSTN蛋白表达,抑制BMPR2蛋白表达。下调POSTN表达可抑制缺氧诱导的PASMC增殖,恢复BMPR2蛋白表达水平。此外,POSTN明显增加p-ERK1/2或ERK1/2的蛋白表达水平,增加PASMC增殖,而这些效应可被U0126阻断。结论在HPH病理机制中,POSTN促进PASMC增殖,其潜在的机制可能与调节BMPR2表达和活化ERK1/2信号通路有关。

lncRNA在肺动脉高压血管平滑肌细胞中的作用

肺动脉高压(pulmonary hypertension, PH)是一种病因复杂的进行性疾病,目前仍无法治愈,其病理特征主要是肺血管明显重构、肺动脉压力升高及右心室肥厚。长链非编码RNA (lncRNA)是一类长度超过200 nt不具有编码蛋白能力的RNA。近年来,越来越多的研究发现lncRNA在PH发生机制中发挥重要作用。抗凋亡、过度增殖和迁移是肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)失调导致血管重构的主要机制,而血管重构是PH发病机制的关键因素。本文主要概述在PH中调节PASMCs功能的lncRNA及其作用机制。

NO缓释纳米粒子PEG-b-PAASNO对肺动脉平滑肌细胞的影响

目的:探讨一氧化氮(NO)供体聚合物胶束PEG-b-PAASNO(PSNO)对肺动脉平滑肌细胞(PASMC)的影响。方法:构建PSNO并检测体外释放NO水平。分离并培养大鼠PASMC,CCK8确定PSNO安全浓度范围和有效作用浓度。设立空白对照组、PSNO(250 ng·mL^(-1))组(PSNO组)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB,15 ng·mL^(-1))组(BB组)和PDGF-BB+PSNO(15 ng·mL^(-1)PDGF-BB+250 ng·mL^(-1)PSNO)组(BB+PSNO组),用5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(EDU)实验、划痕实验和Transwell实验评估PSNO对PASMC增殖、迁移能力的影响,免疫印迹法评估PASMC增殖、收缩、细胞周期相关蛋白[增殖细胞核抗原(PCNA)、钙调蛋白(calponin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)]的表达水平。组间比较采用one-way ANOVA分析。结果:成功构建稳定释放NO的纳米聚合物胶束PSNO,连续释放NO超过48 h,效应呈时间-剂量依赖性。PSNO质量浓度为250 ng·mL^(-1)时有效抑制PDGF-BB诱导的PASMC增殖、迁移;与BB组相比,BB+PSNO组PCNA、calponin、α-SMA、cyclin D1和CDK2蛋白表达水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:成功构建一种可以稳定释放NO的纳米聚合物胶束PSNO,其有效释放NO超48 h,功能上阻滞PASMC增殖、迁移,并降低PASMC收缩、细胞周期相关蛋白表达水平。

LncRNA NORAD通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的作用机制

目的:探讨长链非编码RNA DNA损伤诱导的非编码RNA(LncRNA NORAD)通过miR-513b-5p/GREM1轴调节颅内动脉瘤血管平滑肌细胞(VSMC)增殖、迁移、侵袭和凋亡的机制。方法:采用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测人颅内动脉瘤组织和正常组织中LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1表达。体外分离培养人VSMC,随机分为对照组、LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组、共转染(LncRNA NORAD siRNA+miR-513b-5p inhibitor)组、共转染阴性对照(LncRNA NORAD siRNA阴性对照+miR-513b-5p inhibitor阴性对照)组,分组转染后,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞LncRNA NORAD、miR-513b-5p及GREM1 mRNA表达;采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和免疫荧光染色检测各组细胞增殖情况;采用Hoechst 33342染色和免疫荧光染色检测各组细胞凋亡情况;采用细胞划痕实验和Transwell实验检测各组细胞迁移、侵袭情况;采用免疫印记实验检测各组细胞上皮间充质转化(EMT)标志蛋白神经钙黏素(N-cadherin)、E-钙黏素(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达;采用双荧光素酶报告实验分析VSMC中LncRNA NORAD对miR-513b-5p、miR-513b-5p对GREM1的靶向调控。结果:与正常组织比较,颅内动脉瘤组织LncRNA NORAD、GREM1 mRNA表达明显升高(P<0.05),miR-513b-5p表达明显降低(P<0.05)。与对照组比较,LncRNA NORAD siRNA组、miR-513b-5p mimics组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05);共转染阴性对照组各指标差异无统计学意义(P>0.05)。与LncRNA NORAD siRNA组比较,共转染组细胞GREM1 mRNA表达、增殖率、Ki67阳性率、迁移率、侵袭数及N-cadherin、Vimentin蛋白表达升高(P<0.05),miR-513b-5p表达、凋亡率及Bax/Bcl-2、E-cadherin蛋白表达降低(P<0.05)。结论:敲低LncRNA NORAD可通过上调miR-513b-5p表达而降低GREM1表达,从而抑制VSMC增殖与侵袭迁移,并促使其凋亡。

低氧对牦牛肺动脉平滑肌细胞增殖及氧化应激损伤作用的影响

【目的】通过研究低氧环境对牦牛(Bos grunniens)肺动脉平滑肌细胞(pulmonary arterial smooth muscle cells,PASMCs)增殖及氧化应激损伤的影响,初步探究牦牛肺动脉平滑肌对低氧的适应性特点。【方法】分离纯化并利用α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)鉴定牦牛PASMCs。试验分为常氧组和低氧组,采用CCK-8法检测牦牛PASMCs在低氧和常氧状态下0、2、4、6、12、24、48、72、96、120 h的增殖效率;采用ELISA法检测常氧组和低氧组培养24、48、72、96 h细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的蛋白浓度。【结果】细胞鉴定结果表明,95%以上的细胞均能表达α-SMA,即分离纯化所得细胞为牦牛PASMCs。CCK-8结果表明,低氧组在72、96、120 h细胞增殖倍数极显著低于常氧组(P<0.01);低氧组和常氧组在72 h的细胞增殖倍数均极显著高于48 h(P<0.01),表明牦牛PASMCs在72 h出现增殖高峰,且长时间的低氧环境能够降低牦牛PASMCs增殖效率。ELISA检测结果表明,与常氧组相比,低氧组牦牛PASMCs培养上清液中LDH蛋白浓度在72 h极显著上调(P<0.01);SOD蛋白浓度在72、96 h均极显著或显著上调(P<0.01;P<0.05);CK蛋白浓度在48、72 h均显著或极显著上调(P<0.05;P<0.01);MDA蛋白浓度在72 h显著上调、96 h显著下调(P<0.05)。在低氧条件下,各时间点上清液中LDH、SOD蛋白浓度差异不显著(P>0.05),CK、MDA蛋白浓度在24、48和72 h均显著高于96 h(P<0.05)。在常氧条件下,上清液中LDH蛋白浓度在48 h显著高于24、72 h(P<0.05);SOD蛋白浓度在24、48 h均显著高于72、96 h(P<0.05);CK蛋白浓度在24 h显著高于72、96 h(P<0.05);MDA蛋白浓度在48 h显著高于72 h(P<0.05)。【结论】长时间低氧能够增强牦牛PASMCs氧化应激反应和细胞损伤,抗氧化作用减弱,细胞增殖效率显著降低,LDH、SOD、CK和MDA 4种蛋白在低氧条件下牦牛PASMCs损伤与抗损伤以及抗氧化中发挥重要调节作用,这可能与牦牛肺脏血管的低氧适应性有关。

GW501516对低氧致肺动脉内皮细胞损伤的影响及机制

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂GW501516对低氧诱导的肺动脉内皮细胞(PAECs)损伤的影响及机制。方法通过检测PAECs的相对存活率,观察GW501516的细胞毒性作用;采用Western blot法检测PPARδ蛋白的表达水平。建立低氧条件下PAECs损伤的细胞模型,以抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)为阳性对照,通过检测细胞凋亡率、细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、活性氧(ROS)水平,考察GW501516对细胞损伤及ROS产生的影响。以核因子E2相关因子2(Nrf2)激活剂富马酸二甲酯(DMF)为阳性对照,在低氧条件下通过GW501516和(或)Nrf2抑制剂ML385孵育PAECs,以细胞损伤(细胞凋亡、细胞活力、LDH活性)及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、ROS水平及Nrf2、血红素加氧酶1(HO-1)、裂解型胱天蛋白酶3(C-caspase-3)蛋白的表达水平,探讨GW501516对低氧致PAECs损伤的作用机制。结果低氧刺激能够抑制PAECs内PPARδ蛋白的表达(P<0.05),而GW501516可在低氧条件下促进PPARδ蛋白的表达且无明显的细胞毒性作用。GW501516可抑制PAECs凋亡,提高细胞活力,降低LDH活性及ROS水平。GW501516可通过激活Nrf2通路,上调PAECs内HO-1蛋白表达水平及SOD、GPx、CAT水平,降低MDA、ROS水平(P<0.05),而Nrf2抑制剂ML385能够逆转GW501516的上述作用(P<0.05)。GW501516下调C-caspase-3蛋白表达,抑制低氧诱导的PAECs损伤的作用与Nrf2激活剂DMF相似(P<0.05),而Nrf2抑制剂ML385能够逆转GW501516抑制PAECs损伤的作用(P<0.05)。结论GW501516可通过抑制氧化应激来减轻低氧诱导的PAECs损伤,其机制与激活Nrf2有关。

DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞钙化中的作用

目的 明确DNA损伤应答通路在高钙磷环境诱导的人主动脉血管平滑肌细胞(HVSMC)钙化过程中的作用。方法 将HVSMC培养分为对照组、模型组、共济失调毛细血管扩张突变激酶(iATM)组、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(iPARP)组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测4组细胞钙化情况,彗星实验检测DNA损伤,Western blotting和免疫荧光方法检测组蛋白γH2AX磷酸化水平,酶联免疫吸附试验检测8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHDG)水平,NucleoCounterNC-3000^(TM)高级细胞分析仪分析4组细胞的存活率。结果 光学显微镜和茜素红S染色发现第9天开始,与对照组相比,模型组出现细胞内钙质沉积,第12天钙质沉积明显。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下Ca^(2+)/蛋白比较,结果:(1)不同时间点Ca^(2+)/蛋白有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组Ca^(2+)/蛋白有差异(F=203.040,P=0.000),模型组Ca^(2+)/蛋白较高,钙化明显;(3)两组Ca^(2+)/蛋白变化趋势有差异(F=13.213,P=0.000)。培养12 d时,茜素红S染色发现模型组比对照组钙化程度高,iATM组和iPARP组比模型组钙化程度低。σ-甲酚酞试验发现,iATM组和iPARP组Ca^(2+)/蛋白低于模型组(P <0.05)。彗星试验发现,对照组比较,模型组第9天开始出现更多数量的DNA受损细胞。对照组与模型组分别在第3、6、9、12天培养状态下“彗星细胞”比较,结果:(1)不同时间点“彗星细胞”有差异(F=13.141,P=0.000);(2)模型组与对照组“彗星细胞”有差异(F=121.521,P=0.000),模型组“彗星细胞”百分比较高,DNA损伤明显;(3)模型组与对照组“彗星细胞”变化趋势有差异(F=89.290,P=0.000)。模型组γH2AX蛋白相对表达量高于对照组(P <0.05)。对照组、模型组分别在第3和12天免疫荧光显微镜下观察> 3个γH2AX病灶百分比,结果:(1)不同时间点> 3个γH2AX病灶百分比有差异(F=168.970,P=0.000);(2)模型组与对照组> 3个γH2AX病灶百分比有差异(F=203.040,P=0.000),模型组> 3个γH2AX病灶百分比较高,DNA损伤明显;(3)模型组与对照组> 3个γH2AX病灶百分比变化趋势有差异(F=153.410,P=0.000)。模型组8-OHDG水平高于对照组(P <0.05)。模型组细胞存活率低于对照组、iATM组、iPARP组(P <0.05);iATM组、iPARP组与对照组细胞存活率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高Ca^(2+)/P环境激活DNA损伤应答信号通路,诱导HVSMC坏死,进而形成钙化。

血管平滑肌细胞线粒体与腹主动脉瘤发生发展的研究进展

腹主动脉瘤(AAA)是以腹主动脉壁发生持续性扩张为主要特点的血管疾病,破裂后常导致严重后果。血管平滑肌细胞(VSMCs)是构成血管中膜的重要组成部分,负责调节血管的直径和血流,以维持正常的血液循环和血压。VSMCs线粒体作为VSMCs氧化代谢的中心,在能量产生和细胞代谢中发挥重要作用。近年来,越来越多的研究表明,VSMCs线粒体功能障碍与AAA的发生发展密切相关。现从VSMCs线粒体与氧化应激和炎症、线粒体DNA损伤、线粒体动力学异常和细胞代谢四个方面探讨VSMCs线粒体损伤在AAA发生发展中的研究进展,旨在为AAA未来的治疗和预防提供新的策略。

高钙磷激活DNA损伤应答诱导人主动脉平滑肌细胞早衰

目的探讨DNA损伤应答(DDR)通路调控人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化机制。方法将HASMCs分为对照组、模型组、ATM干预组、PARP干预组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测细胞钙化;Western blot检测组蛋白γH2AX磷酸化、p16和p21、ATM上Ser1981的磷酸化水平;β-半乳糖苷酶染色检测细胞早衰;qPCR检测p16和p21 mRNA水平。8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHDG)检测氧化应激水平,ELISA方法检测IL-6、IL-8水平。结果模型组较对照组钙化明显,8-OHDG、组蛋白γH2AX磷酸化、β-半乳糖苷酶染色、p16的mRNA和蛋白、p21 mRNA、IL6和IL8、ATM磷酸化等指标有显著变化(P<0.05),ATM和PARP干预组可以缓解模型组的变化。结论高钙磷环境刺激HASMCs产生持续DNA损伤,触发ATM磷酸化并激活p16蛋白表达,诱导细胞早衰导致钙化。

低氧预处理脐带间充质干细胞源外泌体抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖

背景:已有研究表明外泌体可以改善低氧性肺动脉高压,而且不同来源、不同环境的外泌体功能存在显著差别。低氧预处理脐带间充质干细胞来源外泌体对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响尚不清楚。目的:探讨低氧预处理人脐带间充质干细胞来源外泌体对低氧诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响。方法:采用组织贴壁法分离培养原代人脐带间充质干细胞,用超滤法提取人脐带间充质干细胞来源外泌体;采用组织消化法分离大鼠肺动脉平滑肌细胞,用CCK-8法测定不同质量浓度外泌体干预肺动脉平滑肌细胞不同时间后的细胞增殖抑制率,确定外泌体作用的适宜质量浓度和干预时间。将第3代肺动脉平滑肌细胞分为常氧对照组、低氧对照组、低氧+常氧外泌体处理组和低氧+低氧外泌体处理组,EdU法检测各组细胞增殖情况,Western blot检测各组细胞核增殖抗原蛋白表达水平。结果与结论:①与常氧对照组相比,低氧对照组肺动脉平滑肌细胞增殖能力明显增加;与低氧对照组相比,低氧+常氧外泌体组细胞增殖能力下降,且低氧+低氧外泌体组增殖能力下降更明显;②与常氧对照组相比,低氧对照组细胞的细胞核增殖抗原蛋白表达升高;与低氧对照组相比,低氧+常氧外泌体组细胞核增殖抗原蛋白表达水平稍微降低,低氧+低氧外泌体组细胞核增殖抗原蛋白表达水平明显降低;③结果表明,低氧预处理人脐带间充质干细胞来源外泌体具有抑制肺动脉平滑肌细胞增殖的能力。

PPARδ的激活通过抑制糖酵解减轻PDGF-BB诱导的肺动脉平滑肌细胞表型转化

目的:探讨过氧化物酶体增殖物激活受体δ(PPARδ)激动剂GW501516对血小板源性生长因子BB(PDGF-BB)诱导的大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)表型转化和糖酵解的影响及其机制。方法:以20μg/L PDGFBB作为诱导剂,建立PASMCs表型转化及糖酵解的细胞模型,通过GW501516或糖酵解抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-DG)干预24 h,检测PASMCs表型和糖酵解的变化。设置缺氧诱导因子1α(HIF-1α)抑制剂LW6为阳性对照组,通过GW501516和(或)HIF-1α稳定剂二甲基草酰甘氨酸(DMOG)干预24 h,测定细胞外乳酸含量及葡萄糖摄取量的变化;检测PPARδ、血管平滑肌细胞表型标志蛋白、HIF-1α及糖酵解相关蛋白表达,探讨GW501516抑制PASMCs表型转化及糖酵解的机制。结果:PDGF-BB刺激可抑制PASMCs内PPARδ表达,而GW501516处理可促进PPARδ表达(P<0.05)。GW501516上调PASMCs收缩表型标志蛋白平滑肌22α蛋白(SM22α)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,下调合成表型标志蛋白波形蛋白(vimentin)和骨桥蛋白(OPN)表达,减少细胞外乳酸生成,抑制细胞对葡萄糖的摄取(P<0.05),而2-DG在抑制PASMCs表型转化及糖酵解方面的作用与GW501516相似。LW6和GW501516可抑制糖酵解与细胞表型转化,抑制HIF-1α、葡萄糖转运体1(GlUT1)、丙酮酸脱氢酶激酶1(PDK1)、乳酸脱氢酶A(LDHA)和单羧酸转运体蛋白4(MCT4)表达,同时促进丙酮酸脱氢酶(PDH)表达(P<0.05),而DMOG可逆转GW501516的上述作用(P<0.05)。结论:PPARδ激动剂GW501516可通过抑制糖酵解而抑制PDGF-BB诱导的PASMCs表型转化,其机制可能与抑制HIF-1α的表达有关。

铁蛋白自噬抑制调控低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探究低氧诱导小鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)游离铁减少的机制及其在PASMCs增殖和肺血管重塑中的作用。方法①体外培养原代小鼠PASMCs,分为常氧组(C)、常氧柠檬酸铁铵组(C+FAC)、常氧雷帕霉素组(C+R)、低氧组(H)、低氧柠檬酸铁铵组(H+FAC)、低氧雷帕霉素组(H+R)。C组、C+FAC组和C+R组置于常氧(21%O_(2))环境中培养48 h,H组、H+FAC组和H+R组置于低氧(1%O_(2))环境中培养48 h。C+FAC组和H+FAC组使用柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)处理,C+R组和H+R组使用雷帕霉素(rapamycin)处理。检测各组细胞增殖情况,细胞内游离铁含量,铁调节蛋白(iron regulatory proteins,IRPs)、转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)、铁转运蛋白(ferroportin,FPN)和铁蛋白重链(ferritin heavy chain,FTH)等铁稳态调节蛋白表达水平。②将24只C57/BL6N小鼠(雄性,6周龄,体质量18~22 g)分4组:常氧组(C-4W)、常氧高铁饮食组(C+HID-4W)、低氧组(H-4W)和低氧高铁饮食组(H+HID-4W)(n=6);H-4W组与H+HID-4W组置于模拟海拔5000 m低压低氧环境中4周。检测各组小鼠右心功能,右心室收缩压,以及肺血管重塑变化。结果与C组相比,H组PASMCs增殖活性显著增强(P<0.01),细胞内游离铁含量显著减少(P<0.01),FTH的蛋白水平显著上调(P<0.01)。与H组相比,H+FAC组PASMCs内游离铁含量显著增加(P<0.01),细胞增殖活性显著降低(P<0.01)。与H组相比,H+R组PASMCs内游离铁含量显著增加(P<0.01),细胞增殖活性显著降低(P<0.05),FTH的蛋白水平显著降低(P<0.05)。与H-4W组相比,H+HID-4W组小鼠的右心功能显著改善(P<0.01),右心室收缩压显著降低(P<0.05),右心肥厚显著减轻(P<0.01),肺动脉增厚显著抑制(P<0.01)。结论低氧通过抑制铁蛋白自噬途径,介导游离铁减少,进而促进PASMCs增殖以及肺动脉重塑。

肺动脉平滑肌细胞外泌体上调miR-106b-5p增强肺动脉内皮细胞Warburg效应促进动脉型肺动脉高压的分子机制

目的探讨肺动脉平滑肌细胞与内皮细胞的胞间通讯在促进动脉型肺动脉高压(PAH)疾病进展中的作用机制。方法采集并分离健康个体(HC)和PAH患者外周血浆中的外泌体,并对其内的miRNAs进行微阵列测定和差异表达分析。体外缺氧诱导处理原代人肺动脉平滑肌细胞(h PASMCs)和原代肺动脉内皮细胞(hPAECs),分为常氧组和缺氧诱导组。生物信息学分析miR-106b-5p和USP32的序列互作位点。腺病毒转染过表达/敲低h PASMCs内miR-106b-5p,过表达/敲低hPAECs内PKM2。双荧光素酶报告基因分析确证二者的负作用方式。Western blot法测定胞内USP32、PKM2、GLUT1、HK2、LDHA蛋白质的表达水平。结果微阵列测定和差异表达分析结果显示,与HC组相比,PAH组外周血浆中外泌体内miR-106b-5p的水平明显上调。在体外,与常氧组相比,miR-106b-5p的水平在缺氧诱导组hPASMCs上清液外泌体内明显上调,而在h PAECs细胞上清液外泌体中则无此变化。miR-106b-5p负调控USP32的表达。与miR-NC组/Inhibitor-NC组相比,在h PASMCs中miR-106b-5pmimic/miR-106b-5pinhibitor处理后,胞内PKM2、GLUT1、HK2和LDHA蛋白质表达明显增强/抑制。与shRNA-NT组/vector组相比,在hPAECs中PKM2 shRNA/PKM2-OE处理后,胞内PKM2、GLUT1、HK2和LDHA蛋白质表达明显抑制/增强(P<0.05)。结论hPASMCs通过外泌体上调miR-106b-5p增强hPAECs胞内Warburg效应,在动脉型肺动脉高压中具有潜在的促进疾病进展的作用。

三七总皂苷调控SIRT1/FOXO3a/p27通路抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖

目的探讨三七总皂苷(PNS)通过SIRT1/FOXO3a/p27通路抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞(PASMCs)增殖的作用。方法首先将PASMCs随机分为正常(Control)组和三七总皂苷(PNS)组、野百合碱(MCT)组和野百合碱+三七总皂苷(MCT+PNS)组,CCK8检测PNS对正常细胞的安全浓度,进一步检测PNS抑制增殖的最适浓度;为研究作用机制将PASMCs分为Control组、溶剂(DMSO组)组、MCT组、MCT+PNS组、MCT+PNS+SIRT1抑制剂(MCT+PNS+EX-527)组。造模结束,Edu检测细胞增殖;免疫荧光检测SIRT1、FOXO3a表达;qPCR检测细胞SIRT1、FOXO3a、p27、PCNA的表达。结果CCK8显示:0~400 mg·L^(-1)的PNS对正常细胞无毒(P>0.05),100 mg·L^(-1)的PNS可显著抑制MCT诱导的细胞增殖(P<0.01);Edu显示:MCT组较Control组增殖增多;MCT+PNS组较MCT组增殖减少;MCT+PNS+EX-527组较MCT+PNS组增殖增多。免疫荧光和qPCR显示:MCT组较Control组,SIRT1、FOXO3a、p27表达降低,PCNA表达增高;较MCT组,MCT+PNS组SIRT1、FOXO3a、p27表达增多,PCNA表达降低;较MCT+PNS组,MCT+PNS+EX-527组SIRT1、FOXO3a、p27表达降低,PCNA表达增高。结论PNS可通过SIRT1/FOXO3a/p27通路抑制大鼠PASMCs增殖。

Hoxa1通过MEK/ERK信号通路促进低氧下大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移和表型转换的研究

背景 低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary arterial hypertension,HPH)是一种以血管阻力持续性升高和血管重塑为特征的进展性疾病。研究表明Hoxa1参与血管生成过程,但Hoxa1在调控肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)中的作用尚不明确。目的 本研究旨在确定Hoxa1对PASMCs增殖、迁移和表型转化的调控作用。方法 使用Ⅱ型胶原酶消化分离培养原代大鼠PASMCs。采用1%低氧处理细胞构建低氧诱导的细胞模型,并检测24 h、48 h、72 h低氧处理的PASMCs中Hoxa1 mRNA和蛋白表达水平。采用干扰或过表达Hoxa1慢病毒下调或上调细胞中Hoxa1表达。慢病毒干扰实验分为常氧组(Normoxia)、低氧组(Hypoxia)、低氧空病毒组(Hypoxia+shRNA-NC)、低氧Hoxa1干扰病毒组(Hypoxia+shRNA-Hoxa1);慢病毒过表达实验分为对照组(Control)、过表达空病毒组(LV-NC)、过表达Hoxa1组(LV-Hoxa1)。采用EdU检测细胞增殖能力;RT-qPCR检测Hoxa1 mRNA表达;Western blot检测Hoxa1、表型转化标志蛋白、MEK/ERK信号通路蛋白表达;免疫荧光检测Hoxa1、α-actin表达;免疫共沉淀实验确定Hoxa1与MEK的相互作用。结果 成功分离培养PASMCs,并鉴定细胞表达α-SMA。低氧诱导下PASMCs中Hoxa1表达上调(P<0.05)。低氧下Hoxa1沉默抑制PASMCs增殖和迁移,而常氧下Hoxa1过表达促进PASMCs增殖和迁移(P均<0.05)。低氧下沉默Hoxa1导致Hypoxia+shRNA-Hoxa1组收缩型标志蛋白表达升高,合成型标蛋白表达降低(P<0.05)。而在常氧下过表达Hoxa1导致LV-Hoxa1组收缩型标志蛋白降低,合成型标志蛋白升高(P均<0.05)。此外,Hoxa1表达增加促进MEK/ERK信号通路激活。免疫共沉淀结果显示,Hoxa1与MEK存在相互作用。结论 Hoxa1可能通过激活MEK/ERK通路促进PASMCs增殖、迁移和表型转化。