基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre+/+小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre+/+或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

人羊膜间充质干细胞对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子影响的研究

背景烟雾吸入性肺损伤在烧伤患者中较为常见,吸入的有毒气体、颗粒等易引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI),目前无特异性治疗方法。目的研究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells,AT-Ⅱ)增殖、凋亡及炎症因子的影响。方法采用酶消化法分离培养hAMSCs和AT-Ⅱ,采用流式细胞术和免疫荧光分别鉴定hAMSCs和AT-Ⅱ;松木屑烟雾溶液染毒AT-Ⅱ复制烟雾诱导的细胞损伤。实验细胞分为对照组(无血清DMEM/F12)、致伤组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒)和治疗组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒,hAMSCs与AT-Ⅱ共培养)。采用CCK-8检测细胞的增殖活性;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;Elisa检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的表达。结果与对照组比较,致伤组AT-Ⅱ的活性降低(P<0.01),经hAMSCs治疗后,与致伤组比较,AT-Ⅱ细胞活性增加(P<0.01);致伤组细胞的凋亡率在12 h和24 h均增加(P<0.01),hAMSCs治疗后细胞凋亡率降低(P<0.01);细胞致伤后炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量增加(P<0.05),经hAMSCs共培养12 h和24 h后,促炎因子TNF-α和IL-6的表达均下调(P<0.05),IL-10含量增加(P<0.05)。结论hAMSCs可以促进松木屑烟雾溶液诱导的AT-Ⅱ增殖和抑制细胞凋亡,可能与调节炎症因子的表达有关,为探究hAMSCs治疗烟雾引起的急性肺损伤提供理论依据。

重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用及乌司他丁干预的实验研究

目的探讨重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中其肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用并对乌司他丁对其干预的作用进行分析。方法将42只健康大鼠随机分为3组,分别为假手术组、模型组与乌司他丁干预组,每组14只,以向大鼠十二指肠乳头内侧胰胆管注射脱氧胆酸钠建立SAP大鼠模型,假手术组大鼠仅打开大鼠腹腔轻轻翻动其胰腺后关闭腹腔,乌司他丁干预组于大鼠建模后给予乌司他丁注射。对几组大鼠术后肺组织及胰腺组织的病理变化及相关指标差异进行分析。结果与假手术组比较,SAP组及乌司他丁干预组TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更高,乌司他丁干预组与SAP组比较,TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更低(P<0.05)。SAP大鼠伴随着明显的肺损伤状况,假手术组、SAP组、乌司他丁干预组肺湿/干比值分别为3.62±0.56、6.48±0.77、4.69±0.63,血气指标PaCO_(2)、PaO_(2)分别为(31.25±1.03)mmHg、(106.52±2.03)mmHg,(48.67±2.01)mmHg、(73.57±2.44)mmHg和(35.22±1.32)mmHg、(90.22±3.01)mmHg),SAP组及乌司他丁干预组大鼠肺湿/干比值及PaCO_(2)明显上升,PaO_(2)明显下降,相较于SAP组,乌司他丁干预组大鼠的肺湿/干比值及PaCO_(2)更低,PaO_(2)更高(P<0.05)。假手术组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率[(3.58±0.57)%]及Ca^(2+)浓度[(34.52±2.35)%]均显著低于SAP组凋亡率[(29.67±4.52)%]及Ca^(2+)浓度[(82.66±4.66)%]及乌司他丁干预组凋亡率[(14.62±3.67)%]及Ca^(2+)浓度[(46.77±5.02)%],乌司他丁干预组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率及Ca^(2+)浓度显著低于SAP组(P<0.05)。假手术组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达均显著低于SAP组及乌司他丁干预组,乌司他丁干预组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达显著低于SAP组(P<0.05)。SAP肺损伤大鼠线粒体细胞破坏明显,乌司他丁对减少线粒体细胞破坏数量具有明显作用。结论SAP肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能参与了其作用机制,TNF⁃α、AMY、MDA、Caspasee⁃8、BaxmRNA在肺损伤机制中存在重要作用,乌司他丁干预有利于缓解SAP肺损伤状况,有利于控制病情进展。

不同浓度PM_(2.5)对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12的损伤作用及SP-B表达影响

目的探讨不同浓度细颗粒物(PM_(2.5))对小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12的损伤作用及肺表面活性蛋白-B(SP-B)表达的影响。方法将肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12分为实验组和对照组。实验组采用加入12.5、25、50、100、200μg/mL PM_(2.5)混悬液的DMEM完全培养基培养,对照组采用DMEM完全培养基培养。培养24 h或48 h后,采用光学显微镜观察细胞形态,透射电镜观察细胞超微结构,RTCA仪观察细胞增殖能力;Western blotting法检测细胞中SP-B蛋白;qRT-PCR法检测细胞中SP-B mRNA。结果随着PM_(2.5)浓度的升高,实验组细胞形态和超微结构受损程度逐渐加重,可见板层小体受损等细胞器损伤现象,对照组细胞形态和超微结构正常;与对照组相比,PM_(2.5)呈浓度依赖性抑制实验组细胞的增殖。与对照组相比,实验组细胞SP-B蛋白和mRNA表达呈浓度依赖性下调(P均<0.05)。结论PM_(2.5)可呈剂量依赖性损伤小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12,并下调SP-B表达。

不同时间高氧对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞能量代谢的影响

目的探讨不同时间高浓度氧对肺泡Ⅱ型上皮细胞线粒体能量代谢的影响。方法将大鼠RLE-6TN细胞分为对照组(21%O_(2)常规培养4 h)、高氧1、2、3、4 h组(95%O_(2)分别培养1、2、3、4 h)。采用荧光素酶化学发光法检测各组细胞的三磷酸腺苷(ATP)含量,采用微量法检测线粒体呼吸链复合体V活性,荧光探针JC-1检测细胞线粒体膜电位,实时荧光定量PCR法检测线粒体呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的核心亚基NADH脱氢酶亚基1(ND1)、细胞色素b(Cytb)、细胞色素C氧化酶亚基I(COXI)、ATP酶6(ATPase6)mRNA的表达水平。结果与对照组比较,高氧1、2、3、4 h组细胞线粒体呼吸链复合体核心亚基ND1(q=24.800,P<0.001;q=13.650,P<0.001;q=9.869,P<0.001;q=20.700,P<0.001)、COXI(q=16.750,P<0.001;q=10.120,P<0.001;q=8.476,P<0.001;q=14.060,P<0.001)及ATPase6 mRNA(q=22.770,P<0.001;q=15.540,P<0.001;q=12.870,P<0.001;q=18.160,P<0.001)表达水平均显著降低;且高氧1、4 h组细胞ATPase活性受到抑制(q=9.435,P<0.001;q=11.230,P<0.001),ATP含量降低(q=5.615,P=0.007;q=5.029,P=0.005);而高氧2、3 h组细胞ATPase活性(q=0.156,P=0.914;q=3.197,P=0.116)及ATP含量(q=0.859,P=0.557;q=1.273,P=0.652)差异无统计学意义。各组细胞线粒体膜电位之间差异无统计学意义(F=0.303,P=0.869)。结论短时间高氧会抑制呼吸链复合体核心亚基表达并降低ATPase活性,导致肺泡Ⅱ型上皮细胞能量代谢障碍。

沉默信息调节因子2相关酶3调控自噬减轻H_(2)O_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡

目的探讨沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)调控自噬在H_(2)O_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用。方法使用对数生长期的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞株(MLE-12),利用0.5 mmol/L H_(2)O_(2)建立MLE-12细胞凋亡模型,分为:正常对照组、H_(2)O_(2)损伤组、H_(2)O_(2)+SIRT3组、H_(2)O_(2)+SIRT3沉默组。CCK8法检测各组细胞增殖活力;SOD、MDA及T-AOC试剂盒检测SOD、MDA及T-AOC水平;构建mRFP-GFP-LC3自噬双标体系,激光共聚焦显微镜观察自噬水平;激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化及ROS水平;蛋白免疫印迹实验检测SIRT3、Bcl2、Bax及LC3B表达水平。结果与正常对照组比较,H_(2)O_(2)损伤组、H_(2)O_(2)+SIRT3组和H_(2)O_(2)+SIRT3沉默组MDA、ROS水平及自噬小体、自噬溶酶体点数升高(P<0.05),细胞活力、SOD、T-AOC水平和线粒体膜电位降低(P<0.05),SIRT3及Bcl2蛋白表达降低(P<0.05),Bax及LC2Ⅱ蛋白表达升高(P<0.05),以H_(2)O_(2)+SIRT3沉默组最为显著;与H_(2)O_(2)损伤组比较,MDA、ROS水平及自噬小体、自噬溶酶体点数下降(P<0.05),细胞活力、SOD、T-AOC水平和线粒体膜电位升高(P<0.05),SIRT3及Bcl2蛋白表达升高(P<0.05),Bax及LC2Ⅱ蛋白表达降低(P<0.05)。结论SIRT3可以通过抑制自噬、氧化应激及凋亡减轻H_(2)O_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤。

急性肺损伤幼鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞和SP-A变化相关性的研究

目的该实验旨在研究急性肺损伤(ALI)时肺泡Ⅱ型上皮细胞(AEC-Ⅱ)超微结构变化和肺组织表面活性蛋白SP-A含量的变化关系,从而探讨ALI的发病机制。方法48只Sprague-Dawley幼鼠被随机分为正常对照组和ALI组。腹腔注射脂多糖(LPS,4 mg/kg)建立ALI模型,正常对照组注射等量生理盐水。LPS注射后24,48,72 h每亚组各处死8只大鼠。取左肺下肺组织待透射电镜检查。用Western blot方法测定肺组织SP-A的相对含量。结果ALI 24 h时,AEC-Ⅱ微绒毛消失。24 h及48 h时板层小体(lamellar body,Lb)数量增加,体积增大,密度减低,排空明显增强,呈指环状绕核排列,细胞增生活跃,代谢旺盛。48 h时Lb呈巨大空泡样变性。肺组织SP-A含量明显高于对照组(24 h时ALI组为6.52±0.62,对照组为5.02±0.35,P<0.01;48 h时ALI组为6.65±0.62,对照组为5.01±0.36,P<0.01)。72 h时Lb破溃,数目明显减少,细胞核形态不规则,部分核边界不清,肺组织SP-A含量下降(ALI组为3.87±0.50,对照组为5.22±0.36,P<0.01)。结论LPS致幼鼠ALI时AEC-Ⅱ和肺组织SP-A的变化为时间依赖性,随AEC-Ⅱ损伤程度的加重肺组织SP-A由代偿转为失代偿,可能是发生ARDS的重要机制之一。

p53信号通路在MTB感染肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549中的免疫调控作用

【目的】探讨p53通路在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的免疫调控作用。【方法】将供试的p53基因过表达和干扰载体转染293T细胞,对其作用效果进行验证。利用脂质体分别转染p53基因过表达和干扰载体到AECⅡ细胞系A549中,建立p53基因过表达和干扰A549系模型细胞。用牛结核分枝杆菌减毒株(BCG)分别感染未经任何处理的A549细胞(感染对照组)及模型细胞,以未感染BCG的各类A549细胞为参照。以β-actin为内参基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析信号分子p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达,以及炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的mRNA表达情况。【结果】过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT和干扰载体TP53-RNAi(2648)作用效果明显,成功建立了p53基因过表达和干扰的A549细胞模型。BCG感染的对照组、p53基因过表达组和干扰组的A549细胞中,p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达显著或极显著高于相应的BCG未感染组,其中p300表达与p53基因表达量呈正相关,NF-κB、TLR-4、TRAF6表达与p53基因表达量呈负相关;BCG感染可引起TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的显著表达,且与p53基因表达量呈负相关。【结论】BCG感染A549细胞时,p53信号通路中的p53协同p300来抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化及负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,从而抵抗MTB的侵染。

利多卡因对LPS致大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护作用

目的:观察利多卡因(lidocaine,L ido)抗LPS所致的大鼠肺泡Ⅱ型上皮(AT-Ⅱ)细胞凋亡作用。方法:体外培养的大鼠AT-Ⅱ细胞暴露到LPS和L ido中2 4 h后,采用流式细胞仪(FCM)及电镜检测AT-Ⅱ细胞凋亡和坏死率;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测LDH活性。结果:LPS可直接导致AT-Ⅱ细胞损伤,表现为AT-Ⅱ细胞坏死和凋亡发生率增高,LDH释放量增多。L ido能降低AT-Ⅱ细胞凋亡率。结论:L ido对LPS所致的AT-Ⅱ细胞凋亡和坏死有直接的抑制作用。

TGF-β1诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变

目的检测转化生长因子(TGF-β1)能否在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞-间质细胞转变(epithelial-mes-enchymal transition,EMT)及其相应的信号转导机制。方法在体外培养的大鼠肺泡Ⅱ型细胞(RLE-6TN)中加入TGF-β1后,于不同时间段收取细胞,分别采用Real-time PCR及Western blot检测上皮及间质细胞标志物表达的改变;Western blot检测TGF-β1对RLE-6TN细胞p-Smad2/3表达的影响;TGF-β1诱导的RLE-6TN细胞形态学的改变采用倒置相差显微镜观察,超微结构的改变采用透射电子显微镜观察。结果加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后,其间质细胞标志物表达上调,上皮细胞标志物的表达下调;加入TGF-β1到RLE-6TN细胞后,其p-Smad2/3的表达明显上调;形态学上,TGF-β1诱导RLE-6TN细胞向成肌纤维细胞样细胞转变;超微结构上,TGF-β1诱导RLE-6TN细胞特有的嗜锇性板层小体发生变性、肿胀并随TGF-β1作用时间延长最终完全消失。结论TGF-β1能在体外诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞向间质细胞转变,其机制部分与Smad信号转导途径相关。

构建原代分离培养与鉴定小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的方法及模型

背景:肺泡Ⅱ型上皮细胞在肺发育和肺功能调节中起重要作用,它与肺纤维化和肺癌等疾病的发生发展有密切联系,为了对这些疾病进行体外实验研究,必须对肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、原代培养与鉴定以建立一个稳定高效的细胞模型。目的:建立一套可靠的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化、原代培养与鉴定的方法,为肺纤维化及肺癌等疾病的进一步研究奠定基础。方法:①用低浓度胰酶联合Ⅰ型胶原酶消化法,分离小鼠肺组织细胞成分。取出小鼠肺组织,剪成小块,加入胰蛋白酶,移出细胞悬液,加入含胎牛血清的DMEM中止消化;同法用胰蛋白酶再消化1次,中止消化后加入Ⅰ型胶原酶,再中止消化。②经差速离心差速贴壁和免疫黏附法纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,进行原代培养。将肺细胞悬液接种入包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出含未黏附细胞的液体接种于另一包被小鼠IgG的培养皿中培养,吸出未黏附细胞,去上清,重悬沉淀,将细胞接种于培养皿和培养板中培养。倒置显微镜观察细胞形态及生长特点,测定肺泡Ⅱ型上皮细胞产量、纯度及活力,免疫细胞化学染色鉴定肺泡表面活性蛋白A和肺泡表面活性蛋白C的表达,透射电镜鉴定肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性细胞结构。结果与结论:用此方法,每只小鼠获得肺泡Ⅱ型上皮细胞(4.8±1.2)×106,纯度达到(85.0±2.4)%,细胞活力为(92.0±2.4)%,倒置显微镜下原代肺泡Ⅱ型上皮细胞呈圆形或立方形,细胞质内有大量反差明显的细小颗粒,细胞为岛状生长方式;免疫细胞化学鉴定,肺泡表面活性蛋白A呈棕黄色,肺泡表面活性蛋白C呈绿色,均定位表达于细胞浆;透射电镜见特征性板层小体和细胞游离面大量微绒毛。证实利用胰酶联合胶原酶消化,差速离心差速贴壁和免疫黏附纯化的方法可获得高产量高纯度的AECⅡ,能满足一般的体外实验要求。

新风胶囊通过调节肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch/Jagged-HES轴改善佐剂性关节炎大鼠肺功能

目的观察新风胶囊(XFC)对肺泡Ⅱ型上皮细胞Notch/Jagged/HES影响。方法大鼠分为正常对照组、模型组、来氟米特(LEF)组、XFC组,除正常对照组外,其余3组复制佐剂关节炎大鼠模型。致炎后第13天给药,每天1次,连续给药30 d。正常对照组、模型组给予生理盐水灌胃,每天1次;LEF组给予LEF(0.5 mg/100 g)灌胃、XFC组给予XFC(0.034 g/100 g)灌胃,观察大鼠足跖肿胀度、关节炎指数、肺功能,透射电镜观察大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构,Western blot法检测肺泡Ⅱ型上皮细胞转化生长因子β1(TGF-β1)、Notch1、Notch3、Jagged1、HES1蛋白表达。结果模型组大鼠肺功能参数最大呼气第一秒呼出的气量的容积(FEV1)、50%肺活量的呼气流量(FEF50)、75%肺活量的呼气流量(FEF75)、用力最大呼气流量(PEF)较NC组显著降低,肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构破坏,肺泡Ⅱ型上皮细胞TGF-β1、Notch1、Notch3、Jagged1、HES1表达升高。与模型组比较,XFC组FEV1、FEF_(50)、FEF_(75)、PEF均显著升高,TGF-β1、Notch1、Notch3、Jagged1、HES1降低。XFC组较LEF组肺功能升高。结论 XFC通过下调TGF-β1、Notch1、Notch3、Jagged1、HES1,抑制肺间质纤维化,改善肺功能。

胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离及原代培养

目的:探讨胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(Alveolar epithelial cell typeⅡ,AECⅡ)的分离、纯化及原代培养方法,为有关胎儿肺发育及新生儿肺部疾病的研究奠定基础。方法:采用胰酶结合胶原酶的消化方法,分离肺组织细胞成份,然后经差速离心和差速贴壁的方法纯化AECⅡ,进行原代培养;通过台盼蓝染色检测细胞活力,倒置相差显微镜观察细胞生长特点及形态特征,透射电镜鉴定,改良巴氏染色检测细胞纯度以及免疫荧光技术检测表面蛋白C(Surfactant proteinc,SPC)的表达。结果:每3～5只胎鼠可获得AECⅡ(36±5)×106,活力98%±2%。镜下观察原代AECⅡ呈岛状生长,外观呈多边形或立方形。透射电镜可见特征性的板层小体,改良巴氏染色见胞质内有较多颗粒,纯度为96%±3%,呈现SPC绿色免疫荧光的细胞占96%以上。结论:利用胰酶和胶原酶消化,以及差速离心和差速贴壁的方法可成功分离出高产量、高纯度的胎鼠AECⅡ,能满足体外进一步实验的需要。

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞体外培养和鉴定

目的 建立大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞 (简称AT Ⅱ )的改良体外原代培养法 ,并比较其鉴定方法的优劣。方法 AT Ⅱ分离、用胰蛋白酶消化法并用IgG包被的培养瓶粘附纯化 ,原代培养后通过鞣酸多彩、碱性磷酸酶 (Alkalinephosphatase ,AKP)、肺表面活性物质相关蛋白A(SP A)免疫组化三种染色法和电镜鉴定AT Ⅱ。结果 胰酶消化加IgG粘附纯化后所得的AT Ⅱ纯度为 90 % ,AKP染色鉴定最好。结论 采用IgG粘附纯化能提高AT Ⅱ纯度 ,AKP染色简便实用。

氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及细胞外信号调节激酶信号转导机制的研究

目的 探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ型细胞）修复存活、凋亡及其细胞外信号调节激酶（ERK）对凋亡的调控作用。方法 采用过氧化氢（H2O2）处理体外分离纯化培养的原代大鼠ATⅡ型细胞；用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测H2O2刺激后ATⅡ型细胞磷酸化ERK1／2（p—ERK1／2）的表达，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）检测细胞存活率；用流式细胞仪检测细胞凋亡率，并观察ERK特异性抑制剂PD98059干预后细胞凋亡的变化。结果 与对照组比较，10μmol／L和100μmol／L的H2O2处理对ATⅡ型细胞存活率和凋亡率无明显影响；500μmol／L和1000μmol／L的H2O2处理可导致ATⅡ型细胞的存活率明显降低，凋亡率显著升高（P均＜0．05），呈剂量依赖性。500μmol／LH2O2处理ATⅡ型细胞30min，细胞存活率和凋亡率均无显著变化；处理180min细胞存活率明显降低，凋亡率明显增高（P均＜0．05），呈时间依赖性。500μmol／LH2O2可刺激P—ERK1／2阳性表达，以刺激30min表达最强；使用ERK抑制剂（PD98059）干预后，ATⅡ型细胞凋亡率明显增高。结论 H2O2可以剂量和时间依赖的方式诱导ATⅡ型细胞凋亡，ERK信号转导途径参与了ATⅡ型细胞的凋亡调控，对氧化应激状态下的ATⅡ型细胞可能起到保护作用。

氧化应激对肺泡Ⅱ型上皮细胞的损伤作用及JNK信号转导机制

目的:探讨氧化应激状态下肺泡II型上皮细胞(Alveolar type Ⅱ epithelial cell,ATⅡ)存活、凋亡和JNK(c-jun NH2-terminal kinase)的调控机制。方法:采用过氧化氢(Hydrogen peroxide,H2O2)刺激原代大鼠ATⅡ细胞,复制活性氧(Reactive oxygen species,ROS)攻击ATⅡ细胞损伤模型。蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测ATⅡ细胞受500μmol/LH2O2刺激后磷酸化JNK的动态变化,四甲基偶氮唑盐反应比色法(MTT法)检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,并观察JNK抑制剂SP600125干预前后存活率和凋亡率的变化。结果:ATⅡ细胞在受H2O2刺激后随作用时间的延长细胞存活率下降,凋亡率增加;H2O2刺激可导致JNK的磷酸化激活,使用SP600125后,细胞存活率增加,凋亡率降低。结论:H2O2以时间依赖的方式诱导ATⅡ细胞凋亡,抑制JNK信号激活对氧化应激状态下的ATⅡ细胞可能起到保护作用。

大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的培养、鉴定及体外特性初步研究

目的建立成年大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ细胞)分离、纯化、原代培养和鉴定的技术方法 ,并观察其体外生长特性及SP-A表达情况。方法将0.08%胰蛋白酶消化液从气管注入肺组织,消化分离ATⅡ细胞。将大鼠IgG包被的培养皿免疫吸附纯化后,进行原代培养。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,透射电镜(TEM)鉴定细胞,改良巴式染色法鉴定并计算细胞纯度,MTT法检测细胞增殖情况,Western blot检测细胞表达SP-A动态变化。结果细胞产量约为2.2×107个/只大鼠。电镜下观察到ATⅡ细胞特征性结构——板层小体;纯度大于90%。体外培养36～72h时细胞生长良好,细胞质内有较多颗粒;96h后细胞呈长索形,细胞内颗粒减少,并出现空泡。ATⅡ细胞表达SP-A在36h左右达高峰,之后表达减弱。结论利用0.08%胰蛋白酶消化分离和大鼠IgG免疫吸附纯化可获得满意的原代ATⅡ细胞。培养36～72h时细胞增殖旺盛,生长良好,SP-A表达丰富,是进行体外实验的良好时期。

麦冬皂苷D预处理对PM2.5介导肺泡Ⅱ型上皮细胞炎性损伤的抑制作用及其机制

目的观察麦冬皂苷D预处理对大气细颗粒物(PM2.5)介导肺泡Ⅱ型上皮细胞MLE-12炎性损伤的抑制作用并探讨其机制。方法采用CCK-8法检测不同浓度麦冬皂苷D对MLE-12细胞活性的影响,结果显示麦冬皂苷D的安全用药范围为≤80μmol/L。取对数生长期的MLE-12细胞,随机分为空白对照组、PM2.5组及麦冬皂苷D组,麦冬皂苷D组分别加入浓度为10、20、40、80μmol/L的麦冬皂苷D预处理1 h,麦冬皂苷D组及PM2.5组中分别加入PM2.5混悬液(调整其终浓度为80μg/mL),作用24 h。空白对照组不作任何处理。采用ELISA法检测各组培养基上清炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达,Western blotting法检测细胞核及细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量。结果 PM2.5组培养基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达均明显高于空白对照组(P均<0.01),加入80μmol/L麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组培养基上清IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α表达均低于PM2.5组(P均<0.01)。加入不同浓度麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组培养基上清IL-8、TNF-α表达均高于对照组,加入10、20、40μmol/L麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组培养基上清IL-1β、IL-6表达均高于对照组(P<0.05或<0.01)。PM2.5组细胞核NF-κB p65蛋白相对表达量高于对照组,细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量低于对照组(P均<0.01)。加入不同浓度麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组细胞质NF-κB p65蛋白相对表达量均高于PM2.5组,加入20、40、80μmol/L麦冬皂苷D的麦冬皂苷D组细胞核NF-κB p65蛋白相对表达量均明显低于PM2.5组(P均<0.01)。结论麦冬皂苷D预处理可减轻PM2.5引起的MLE-12细胞炎性损伤,80μmol/L浓度时作用最明显且细胞毒性较小;其机制可能与抑制NF-κB p65入核及其相关信号通路激活有关。

氢气对高氧致肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨氢气对高浓度氧导致的早产大鼠肺泡型Ⅱ上皮细胞(AECⅡ)氧化应激性损伤的影响。方法将分离培养的原代AECⅡ随机分为空气对照组、高氧对照组、空气+氢气组、高氧+氢气组。空气组和高氧组分别暴露在21%和95%氧气中,空气+氢气组和高氧+氢气组细胞置于富氢培养基中。各组均于24 h后光镜观察细胞形态改变,采用四甲基偶唑氮蓝(MTT)法检测各组细胞增殖能力,JC-1荧光探针法检测各组细胞线粒体膜电位(△Ψ)变化,化学比色法测定细胞上清丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果与空气对照组比较,空气+氢气组各项指标均无显著差异,高氧对照组细胞的增殖活性明显受到抑制,细胞的△Ψ明显降低,MDA含量显著增高,SOD活性明显降低。氢气干预后,与高氧对照组相比,细胞的增殖活性和SOD活性均有所升高,△Ψ有所恢复,MDA含量显著下降(P<0.05)。结论氢气可显著减轻高氧导致的早产鼠AECⅡ的氧化损伤,提高细胞抗氧化能力,稳定细胞△Ψ,减弱高氧对细胞的增殖抑制效应。

TLR4在内毒素激活肺泡Ⅱ型上皮细胞过程中的表达及可能作用机制

目的 探讨TLR4(tolllikereceptor 4)在内毒素 (LPS)激活肺泡Ⅱ型上皮细胞 (ATⅡcells)中的表达及可能作用机制。方法 通过RT PCR的方法检测TLR4mRNA在ATⅡcells的表达 ;电泳迁移率改变法检测LPS刺激后的ATⅡcellsNF κB活性的变化 ;ELISA检测ATⅡcells培养上清中TNF α和IL 6的含量变化。结果 正常ATⅡcells表达有TLR4mRNA ,LPS刺激后表达增强 ;其表达在 1～ 10 3 ng/mlLPS范围内呈浓度依赖性增强。LPS刺激后 ,ATⅡcellsNF κB活性及TNF α和IL 6的生成均呈浓度依赖性的增强。