重症急性胰腺炎肺损伤发病机制中的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用及乌司他丁干预的实验研究

目的探讨重症急性胰腺炎(SAP)发病机制中其肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的作用并对乌司他丁对其干预的作用进行分析。方法将42只健康大鼠随机分为3组,分别为假手术组、模型组与乌司他丁干预组,每组14只,以向大鼠十二指肠乳头内侧胰胆管注射脱氧胆酸钠建立SAP大鼠模型,假手术组大鼠仅打开大鼠腹腔轻轻翻动其胰腺后关闭腹腔,乌司他丁干预组于大鼠建模后给予乌司他丁注射。对几组大鼠术后肺组织及胰腺组织的病理变化及相关指标差异进行分析。结果与假手术组比较,SAP组及乌司他丁干预组TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更高,乌司他丁干预组与SAP组比较,TNF⁃α、AMY及MDA水平明显更低(P<0.05)。SAP大鼠伴随着明显的肺损伤状况,假手术组、SAP组、乌司他丁干预组肺湿/干比值分别为3.62±0.56、6.48±0.77、4.69±0.63,血气指标PaCO_(2)、PaO_(2)分别为(31.25±1.03)mmHg、(106.52±2.03)mmHg,(48.67±2.01)mmHg、(73.57±2.44)mmHg和(35.22±1.32)mmHg、(90.22±3.01)mmHg),SAP组及乌司他丁干预组大鼠肺湿/干比值及PaCO_(2)明显上升,PaO_(2)明显下降,相较于SAP组,乌司他丁干预组大鼠的肺湿/干比值及PaCO_(2)更低,PaO_(2)更高(P<0.05)。假手术组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率[(3.58±0.57)%]及Ca^(2+)浓度[(34.52±2.35)%]均显著低于SAP组凋亡率[(29.67±4.52)%]及Ca^(2+)浓度[(82.66±4.66)%]及乌司他丁干预组凋亡率[(14.62±3.67)%]及Ca^(2+)浓度[(46.77±5.02)%],乌司他丁干预组大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率及Ca^(2+)浓度显著低于SAP组(P<0.05)。假手术组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达均显著低于SAP组及乌司他丁干预组,乌司他丁干预组大鼠Caspasee⁃8、BaxmRNA表达显著低于SAP组(P<0.05)。SAP肺损伤大鼠线粒体细胞破坏明显,乌司他丁对减少线粒体细胞破坏数量具有明显作用。结论SAP肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能参与了其作用机制,TNF⁃α、AMY、MDA、Caspasee⁃8、BaxmRNA在肺损伤机制中存在重要作用,乌司他丁干预有利于缓解SAP肺损伤状况,有利于控制病情进展。

沉默信息调节因子2相关酶3调控自噬减轻H_(2)O_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡

目的探讨沉默信息调节因子2相关酶3(SIRT3)调控自噬在H_(2)O_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用。方法使用对数生长期的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞株(MLE-12),利用0.5 mmol/L H_(2)O_(2)建立MLE-12细胞凋亡模型,分为:正常对照组、H_(2)O_(2)损伤组、H_(2)O_(2)+SIRT3组、H_(2)O_(2)+SIRT3沉默组。CCK8法检测各组细胞增殖活力;SOD、MDA及T-AOC试剂盒检测SOD、MDA及T-AOC水平;构建mRFP-GFP-LC3自噬双标体系,激光共聚焦显微镜观察自噬水平;激光共聚焦显微镜观察线粒体膜电位变化及ROS水平;蛋白免疫印迹实验检测SIRT3、Bcl2、Bax及LC3B表达水平。结果与正常对照组比较,H_(2)O_(2)损伤组、H_(2)O_(2)+SIRT3组和H_(2)O_(2)+SIRT3沉默组MDA、ROS水平及自噬小体、自噬溶酶体点数升高(P<0.05),细胞活力、SOD、T-AOC水平和线粒体膜电位降低(P<0.05),SIRT3及Bcl2蛋白表达降低(P<0.05),Bax及LC2Ⅱ蛋白表达升高(P<0.05),以H_(2)O_(2)+SIRT3沉默组最为显著;与H_(2)O_(2)损伤组比较,MDA、ROS水平及自噬小体、自噬溶酶体点数下降(P<0.05),细胞活力、SOD、T-AOC水平和线粒体膜电位升高(P<0.05),SIRT3及Bcl2蛋白表达升高(P<0.05),Bax及LC2Ⅱ蛋白表达降低(P<0.05)。结论SIRT3可以通过抑制自噬、氧化应激及凋亡减轻H_(2)O_(2)诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞损伤。

氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡及细胞外信号调节激酶信号转导机制的研究

目的 探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ型细胞）修复存活、凋亡及其细胞外信号调节激酶（ERK）对凋亡的调控作用。方法 采用过氧化氢（H2O2）处理体外分离纯化培养的原代大鼠ATⅡ型细胞；用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）检测H2O2刺激后ATⅡ型细胞磷酸化ERK1／2（p—ERK1／2）的表达，用四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT）检测细胞存活率；用流式细胞仪检测细胞凋亡率，并观察ERK特异性抑制剂PD98059干预后细胞凋亡的变化。结果 与对照组比较，10μmol／L和100μmol／L的H2O2处理对ATⅡ型细胞存活率和凋亡率无明显影响；500μmol／L和1000μmol／L的H2O2处理可导致ATⅡ型细胞的存活率明显降低，凋亡率显著升高（P均＜0．05），呈剂量依赖性。500μmol／LH2O2处理ATⅡ型细胞30min，细胞存活率和凋亡率均无显著变化；处理180min细胞存活率明显降低，凋亡率明显增高（P均＜0．05），呈时间依赖性。500μmol／LH2O2可刺激P—ERK1／2阳性表达，以刺激30min表达最强；使用ERK抑制剂（PD98059）干预后，ATⅡ型细胞凋亡率明显增高。结论 H2O2可以剂量和时间依赖的方式诱导ATⅡ型细胞凋亡，ERK信号转导途径参与了ATⅡ型细胞的凋亡调控，对氧化应激状态下的ATⅡ型细胞可能起到保护作用。

银杏叶提取物干预肺纤维化模型大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的变化

目的:观察AT-Ⅱ细胞在博莱霉素致大鼠肺纤维化过程中的动态变化及银杏叶提取物对肺纤维化模型大鼠AT-Ⅱ细胞凋亡的影响。方法:96只W istar大鼠,随机分成正常组(A组)、模型组(B组)、强的松干预组(C组)、银杏叶提取物干预组(D组)。每组各24只,除A组外,其余各组采用博莱霉素复制大鼠肺纤维化模型,造模第2天起,D组用银杏叶提取物灌胃,C组用强的松混悬液灌胃,A、B组用生理盐水灌胃。每组分别于造模后第7、14、28天随机取8只大鼠,参照文献提取AT-Ⅱ细胞,用流式细胞仪检测AT-Ⅱ细胞凋亡率。结果:博莱霉素可使AT-Ⅱ细胞的凋亡率明显增加;D组与B组相比,凋亡率有显著下降(P<0.05)。结论:银杏叶提取物对AT-Ⅱ细胞可能有直接抗凋亡作用,可能通过抑制AT-Ⅱ细胞的过度凋亡而起到保护和修复肺泡结构及功能的作用。

生长激素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡抑制作用的观察

目的 :观察不同剂量生长激素 (GH )对大鼠肺泡 型上皮细胞 (AT )凋亡的影响。方法 :建立体外培养的大鼠 AT 细胞盐酸损伤模型 (p H值 6 .0～ 6 .2 ) ,加入不同剂量的 GH,采用流式细胞仪 (FCM)检测AT 细胞凋亡率和坏死率 ,并以 2 ,3二苯基溴化四唑 (MTT)染色记数法绘制活细胞生长曲线。结果 :盐酸可导致 AT 细胞损伤 ,表现为 AT 细胞坏死和凋亡发生率增高 ;GH能促进 AT 细胞增殖并降低其凋亡率 ,在 10～ 5 0 0 mg/ L 范围内其抗凋亡和促增殖作用呈剂量依赖性增强。结论 :GH对盐酸所致的 AT 细胞凋亡有直接的抑制作用。

沉默Bax基因对TNF-α诱导人肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响

目的:运用RNA干扰(RNAi)技术沉默人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549的B细胞淋巴瘤-2相关基因(Bax),探讨Bax在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导A549细胞凋亡中的作用。方法:体外培养A549细胞,利用脂质体LipofectamineTM2000将化学合成的Bax小干扰RNA(siRNA)转染入A549细胞,给予10μg/LTNF-α刺激24h,RT-PCR检测bax mRNA的表达,Western blotting和免疫组化检测Bax蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡率的变化。结果:化学合成的Bax siRNA抑制了A549细胞Bax mRNA和蛋白的表达(P<0.05),流式细胞术显示BaxsiRNA组的细胞凋亡率明显低于TNF-α组和阴性对照siRNA组(P<0.05)。结论:体外实验证明Bax的高表达在TNF-α诱导A549细胞凋亡中发挥了重要的促凋亡作用,利用RNAi技术沉默Bax基因可以有效抑制由TNF-α介导的A549细胞凋亡。

p53在氧化应激下肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡中的作用

目的:探讨氧化应激状态下肺泡II型上皮细胞(ATIIcells)凋亡时,activecaspase-3的表达和p53在细胞内分布情况.方法:原代培养大鼠ATII细胞,用500μmol/L过氧化氢(H2O2)处理,建立氧化损伤性细胞模型.经DAPI染色后观察细胞核的形态变化.流式细胞术检测H2O2刺激后细胞凋亡率的变化;蛋白质免疫印迹法检测H2O2刺激后activecaspase-3的表达变化.免疫荧光染色后观察p53的表达和细胞内分布.结果:DAPI染色发现,正常对照组细胞核较大,发出浅蓝色的荧光,而H2O2刺激后,细胞核发生致密浓染,核周出现光晕等改变.与正常对照组比较,随H2O2刺激时间延长,细胞凋亡率显著上升(P<0.05);Western Blot检测发现H2O2刺激后,activecaspase-3蛋白表达增加(P<0.05).激光共聚焦显微镜观察发现正常细胞p53表达微弱,H2O2刺激3h后,p53表达显著增强,主要集中于细胞核.结论:氧化应激能促使activecaspase-3蛋白表达增加及p53细胞核内表达增加,诱导细胞发生凋亡;p53可能通过转录依赖的途径诱导细胞凋亡.

依达拉奉对肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的保护作用

目的探讨依达拉奉(EDA)对氧化应激诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响及可能机制。方法用过氧化氢氧化应激建立氧化应激肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡模型细胞。将细胞分为:过氧化氢处理组(H组)、依达拉奉-过氧化氢处理组(E组)和对照组(C组)。采用脂质过氧化物(MDA)、谷胱甘肽(GSH)试剂盒检测A549细胞MDA、GSH的含量,同时测定三组细胞生长的抑制率、凋亡率、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3与caspase-9mRNA及蛋白表达。结果与C组比较,H组细胞MDA、细胞生长抑制率、凋亡指数、caspase-3与caspase-9mRNA相对表达及蛋白表达量明显升高;而GSH明显降低(P<0.01)。与H组比较,E组细胞MDA、细胞生长抑制率、凋亡指数、caspase-3与caspase-9mRNA相对表达及蛋白表达量明显降低;而GSH明显增高(P<0.05)。结论依达拉奉可通过抗氧化及抗caspase-3,caspase-9引起的凋亡以保护肺泡Ⅱ型上皮细胞对抗氧化应激。

内毒素诱导小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡不依赖TNF-α的研究

目的 :探讨内毒素 (脂多糖 ,LPS)诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞 (AECⅡ )凋亡的分子机制 ,LPS介导的AECⅡ凋亡是否需要肿瘤坏死因子 α(TNF α)的参与。 方法 :采用文献方法加以修改而建立小鼠 (C5 7、TNFKO)AECⅡ体外培养模型 ,采用LPS和重组小鼠TNF α刺激细胞 2 4h后观察。用ELISA法测定细胞培养上清中TNF α水平 ,而细胞凋亡检测采用TNUEL法。 结果 :①LPS诱导AECⅡ细胞凋亡在C5 7野生型小鼠呈剂量依赖关系 ,LPS 5 0 μg/ml刺激时 ,细胞凋亡率为 (2 2 .7± 2 .1 ) % ,对照组为 (6 .4± 0 .9) % ,P <0 .0 5 ;②LPS在诱导AECⅡ凋亡的同时 ,诱导TNF α水平升高 1 1倍 ;③大剂量的重组TNF α并不能明显诱导AECⅡ凋亡 ;④在TNF基因剔除 (knockout,KO)小鼠 ,LPS仍可明显诱导AECⅡ凋亡。 结论 :①在体外培养条件下 ,LPS可明显诱导AECⅡ凋亡 ;②LPS刺激的TNF α释放并不参与LPS介导的AECⅡ凋亡 ;③LPS诱导的AECⅡ凋亡是通过TNF

肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡在急性肺损伤中研究进展

细胞凋亡在急性肺损伤的发生发展中起着重要的作用,其中肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡与急性肺损伤的预后及生存率密切相关。急性肺损伤按不同的病因可分为直接性和间接性急性肺损伤两类,脓毒症是引起间接性急性肺损伤中最常见的病因。本文就肺泡Ⅱ型上皮细胞在直接性急性肺损伤和脓毒症导致的急性肺损伤中的研究进展作一综述。

肠缺血再灌注时肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡与肺损伤

目的 观察肠缺血再灌注中肺损伤与肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的关系及其可能的发生机制。方法 Wistar大鼠，肠系膜上动脉夹闭后松夹造成肠缺血再灌注。不同时间点活杀动物，测肺通透指数、肺泡灌洗液（BALF）和血浆中NO、IL-2含量，分离肺泡Ⅱ型上皮细胞，观察凋亡率。结果与结论 肠缺血再灌注可能引起肺损伤；肠缺血再灌注后肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率上升，再灌注30 min 达高峰；缺血再灌注后血、BALF中NO、IL-2增加；肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率与肺通透指数显著相关，BALF中IL-2水平与肺通透指数、肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡率显著相关。

液体通气对胎粪吸入综合征大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响

目的:观察液体通气对胎粪吸入综合征(MAS)大鼠肺的影响。方法:建立大鼠MAS模型,分离并培养肺泡Ⅱ型上皮细胞,通过对比实验组与对照组不同时间段的电镜和细胞凋亡率的变化,探讨液体通气在MAS中的应用。结果:电镜显示,实验组的形态学损伤轻于对照组,且细胞凋亡率低于对照组,两者存在统计学差异(P<0.05)。结论:液体通气可抑制MAS中大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的凋亡,减少肺组织损伤。

急性肺损伤中肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡机制的研究进展

急性肺损伤（acute lung injury,ALI）/急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）指创伤、感染、休克等疾病导致的进行性缺氧性呼吸衰竭。病理特点是多型核中性粒细胞浸润、弥漫性肺泡上皮细胞损伤、肺出血水肿及透明膜形成。ALI/ARDS是临床常见危重症,病死率为26%～35%[1]。肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC-Ⅱ）是肺泡壁的重要组成部分,也是ALI/ARDS发生、发展,

氧化应激诱导肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡时NF-κB和Bak的表达变化

目的:探讨氧化应激状态下肺泡Ⅱ型(alveolar typeⅡ,ATⅡ)上皮细胞的凋亡情况及核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)p65和Bak表达变化。方法:原代培养大鼠ATⅡ细胞,用过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)500μmol/L处理不同时间,建立氧化损伤性细胞模型。相差显微镜下观察细胞形态变化。流式细胞仪检测H2O2刺激后细胞凋亡率的变化。蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测ATⅡ细胞受H2O2刺激后NF-κB p65和Bak的表达变化。免疫荧光染色后,激光共聚焦显微镜下观察NF-κB p65的变化和细胞内分布情况。结果:受H2O2刺激3 h后,ATⅡ细胞体积减小,胞内颗粒数目减少,细胞核固缩。与正常对照组比较,受H2O2刺激1 h和3 h后,ATⅡ细胞的凋亡率明显上升(P=0.000,P=0.000)。Western blot检测发现H2O2刺激3 h后,细胞核内NF-κB p65的表达明显增加(P=0.000),ATⅡ细胞Bak蛋白的表达增加(P=0.000)。激光共聚焦显微镜观察发现正常细胞NF-κB p65表达微弱,H2O2刺激3 h后,NF-κB p65表达明显增强,主要集中分布于细胞核。结论:氧化应激能诱导ATⅡ细胞凋亡,在此过程中NF-κB p65在细胞核内的表达增加,Bak的表达也增加,两者参与了ATⅡ细胞的凋亡。

生长激素对盐酸致大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的保护

目的 观察不同剂量生长激素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的影响。方法 建立体外培养AT-Ⅱ细胞盐酸损伤模型，采用不同剂量的生长激素干预，行流式细胞仪检测AT-Ⅱ细胞凋亡和坏死率。以2，3-二苯基溴化四唑(MTT)染色记数法记细胞生长曲线。结果 盐酸可导致AT-Ⅱ细胞损伤，表现为肺泡Ⅱ型上皮细胞坏死和凋亡率增高；GH可促进AT-Ⅱ细胞增殖并降低其凋亡率，在10ugml-1至500ugml-1范围内，其抗凋亡和促增殖作用呈剂量依赖性。结论 GH对盐酸致肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡可能有保护作用。

肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡与肺损伤的研究进展

细胞凋亡是有秩序、受控制并按某种预定程序发展的生理性的自然死亡过程，对生物机体发育、分化、组织重建具有重要作用。其途径：①死亡受体途径，Fas／FasL、TNF／TNFR1、caspase3等；②线粒体途径日，Bcl-2、Bax、caspase3等；③内质网信号途径，钙离子平衡的破坏或蛋白的过量积累、caspase3等；④失巢凋亡途径目，ERK、JNK等。

钙通道与急性肺损伤肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的研究进展

急性肺损伤（ ALI）是重症监护病房最常见的急危重症，由肺内外各种因素引起肺泡上皮细胞（ AEC）和肺毛细血管内皮细胞损伤，造成急性肺水肿，导致顽固性低氧血症，甚者并发严重呼吸衰竭。近年来研究发现，钙离子在细胞凋亡中发挥着重要的作用，本文就钙离子与ALI肺泡Ⅱ型上皮细胞（ AECⅡ）凋亡作以下论述。

miR-21抗肺泡Ⅱ型上皮细胞凋亡的研究进展

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）起病急骤，发展迅猛，预后极差，病死率高达45％以上，现已成为临床危重病学研究的热点和难点。氧疗是临床治疗ARDS的主要措施，是纠正顽固性低氧血症的基本手段，然而，机体长时间接触高氧容易引起高氧性急性肺损伤（hyperoxia-induced acute lung injury,HALI）。导致病情进一步加重，严重威胁患者生命。前期研究表明肺泡Ⅱ型上皮细胞（typellalveola，epithelial cell，AEC-Ⅱ）凋亡与HAL1、ARDS、COPD等多种肺疾病相关，通过抑制AEC-Ⅱ可有效减轻肺疾病发病程度。目前抗细胞凋亡方法缺乏有效性及特异性。miRNAte：术为解决细胞凋亡提供新思路，研究表明在AEC-Ⅱ凋亡过程中miR-21—5p下调，上调AEC-Ⅱ细胞内表达，可明显降低AEC—Ⅱ凋亡率。因此，研究miR-21抗AEC—Ⅱ凋亡机制可为ARDS等肺疾病的临床防治提供理论依据及新策略。本文将就miR-21抗AEC—Ⅱ凋亡机制的研究现状作一综述。

人羊膜间充质干细胞对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞增殖、凋亡及炎症因子影响的研究

背景烟雾吸入性肺损伤在烧伤患者中较为常见,吸入的有毒气体、颗粒等易引起急性肺损伤(acute lung injury,ALI),目前无特异性治疗方法。目的研究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)对松木屑烟雾溶液染毒大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar typeⅡepithelial cells,AT-Ⅱ)增殖、凋亡及炎症因子的影响。方法采用酶消化法分离培养hAMSCs和AT-Ⅱ,采用流式细胞术和免疫荧光分别鉴定hAMSCs和AT-Ⅱ;松木屑烟雾溶液染毒AT-Ⅱ复制烟雾诱导的细胞损伤。实验细胞分为对照组(无血清DMEM/F12)、致伤组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒)和治疗组(0.75‰松木屑烟雾溶液染毒,hAMSCs与AT-Ⅱ共培养)。采用CCK-8检测细胞的增殖活性;Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡;Elisa检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6和IL-10的表达。结果与对照组比较,致伤组AT-Ⅱ的活性降低(P<0.01),经hAMSCs治疗后,与致伤组比较,AT-Ⅱ细胞活性增加(P<0.01);致伤组细胞的凋亡率在12 h和24 h均增加(P<0.01),hAMSCs治疗后细胞凋亡率降低(P<0.01);细胞致伤后炎症因子TNF-α、IL-6和IL-10的含量增加(P<0.05),经hAMSCs共培养12 h和24 h后,促炎因子TNF-α和IL-6的表达均下调(P<0.05),IL-10含量增加(P<0.05)。结论hAMSCs可以促进松木屑烟雾溶液诱导的AT-Ⅱ增殖和抑制细胞凋亡,可能与调节炎症因子的表达有关,为探究hAMSCs治疗烟雾引起的急性肺损伤提供理论依据。