麻黄碱对LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症和COX-2基因表达的影响

目的探讨麻黄碱对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症和环氧化酶-2(COX-2)基因表达的影响。方法体外培养肺泡上皮细胞A549,采用10μg/ml LPS干预A549细胞,实验分为Control组(未做任何处理)、LPS组(10μg/ml LPS)和Ephedrine组(10μg/ml LPS和800μg/ml麻黄碱)。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)和流式细胞术检测3组A549细胞增殖和凋亡能力,蛋白免疫印迹(Western blot)法检测凋亡相关蛋白剪切的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)和Cleaved Caspase-9的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞上清中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)的含量,比色法检测超氧化物气化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量,DCFH-DA荧光探针检测细胞活性氧(ROS)水平,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot检测3组细胞中COX-2 mRNA和蛋白表达量。结果与LPS诱导的A549细胞相比,麻黄碱能够明显提高LPS诱导的A549细胞增殖能力(P<0.05),增加SOD的活力(P<0.05),减少LPS诱导的A549细胞凋亡(P<0.05),下调Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9和COX-2的表达(P<0.05),降低TNF-α、IL-1β、IL-6、MDA含量及ROS水平(P<0.05)。结论麻黄碱能够有效缓解LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡、炎症损伤和氧化应激,并下调COX-2基因的表达。

不同液体培养对脂多糖刺激后人Ⅱ型肺泡上皮细胞A549产生凝血及纤溶因子的影响

目的观察生理盐水（NS）、羟乙基淀粉130／0．4氯化钠溶液（万汶）及乳酸钠林格溶液对脂多糖（LPS）刺激后的人丌型肺泡上皮细胞（AECⅡ）株A549产生凝血及纤溶相关因子的影响，并寻找最佳刺激剂量。方法将处于对数生长期的A549细胞按随机数字表法分为空白对照组、LPS损伤组、NS组、万汶组及林格组，每组再分为20％及40％组；各组加入终浓度为75mg／L的LPS体外刺激A549细胞株，空白对照组仅加普通培养液。培养12h后，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）及实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测细胞中组织因子（TF）、可溶性内皮细胞蛋白C受体（sEPCR）、纤溶酶原激活物抑制因子（PAI—1）、组织型纤溶酶原激活物（t—PA）的蛋白含量及mRNA表达水平，并计算PAI-1／t—PA蛋白和rnRNA的比值。结果与空白对照组比较，LPs损伤组TF、sEPCR、PAI—1、t—PA蛋白含量均明显增高，PAI-1／t—PA蛋白比值也明显增高；LPS损伤组相应的TF、EPCR、PAT-1及t—PA的mRNA表达也明显升高。与LPS损伤组比较，20％、40％NS组TF、sEPCR、PAI-1、t—PA蛋白表达均明显降低，而40％NS组降低更为明显，但仍高于空白对照组，40％NS组PAI-1／t—PA蛋白比值较LPS组明显降低。20％、40％NS组TF和sEPCR的mRNA表达及40％NS组PAI—1和t—PAmRNA表达均较LPS损伤组明显降低，且仍以40％NS组降低较为明显。20％林格组TF和sEPCR蛋白表达较LPS损伤组下降，40％林格组TF、sEPCR蛋白表达却高于LPS损伤组，两组PAI—1及PAI—0／t—PA蛋白比值均高于LPS损伤组，以40％林格组升高明显；20％、40％林格组sEPCRmRNA均较LPS损伤组明冠升高，20％林格组PAI-1mRNA较LPS损伤组降低，而40％林格组PAI—1mRNA较LPS损伤组升高；20％万汶组sEPCR蛋白较LPS损伤组降低，40％万汶组TF及sEPCR蛋白均较LPS损伤组升高；20％、40％万汶组PAI-1、PAI-1／t—PA蛋白比值均高于LPS损伤组，以40％万汶组升高更为显著；20％、40％万汶组sEPCRmRNA及40％万汶组TFmRNA、PAI-1／t—PAmRNA比值均较LPS损伤组升高。20％林格组及20％万汶组TF、TFmRNA、EPCRmRNA、PAI—1、PAI-1／t—PA蛋白比值均高于20％NS组；20％万汶组PAI-1、TFmRNA、EPCRmRNA高于20％林格组；40％林格组及40％万汶组TF、TFmRNA、sEPCR、EPCRmRNA、PAI-1、PAI-1mRNA、PAI—1／tPA蛋白比值均高于40％NS组，40％万汶组TF、TFmRNA、PAI-1、PAI-1mRNA、PAI-1／t—PA蛋白比值高于40％林格组。结论NS、乳酸林格液及万汶培养对LPS损伤后A549细胞产生凝血及纤溶相关因子存在不同影响，NS可抑制LPS刺激后A549细胞TF、sEPCR及PAI-1的合成，且其抑制作用随着培养量的增加而增加；而随着林格液及万汶培养量的增加，对TF、EPCR的合成由抑制逐渐转为促进作用，而对PAI-1则主要表现为促进作用，以万汶作用更为明显。

miR-221靶向AdipoR1基因对LPS诱导的肺泡上皮细胞A549炎症分泌及凋亡影响

目的:探讨miR-221是否靶向脂联素受体1 AdipoR1基因影响脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549炎症分泌和凋亡。方法:随机将人肺泡上皮细胞A549分为对照组、LPS组和LPS+转染组,RT-qPCR法检测miR-221和AdipoR1 mRNA表达,Western blot法检测AdipoR1蛋白及凋亡相关因子Bax、Bcl-2蛋白表达,流式细胞仪检测细胞凋亡率,ELISA法检测细胞培养上清液中炎性因子IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)浓度,双荧光素酶报告基因检测miR-221是否靶向AdipoR1。结果:与对照组比较,LPS组细胞中miR-221及Bax蛋白表达升高(P<0.05),AdipoR1 miRNA和蛋白及Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05),细胞培养上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α浓度升高(P<0.05),细胞凋亡率升高(P<0.05);双荧光素酶报告基因实验证实miR-221靶向负调控AdipoR1的表达;抑制miR-221和过表达AdipoR1均能抑制LPS诱导肺泡上皮细胞分泌炎症因子,抑制细胞凋亡;抑制AdipoR1逆转了抑制miR-221对LPS诱导的肺泡上皮细胞炎症分泌和凋亡的影响。结论:miR-221靶向AdipoR1影响LPS诱导的肺泡上皮细胞A549炎症分泌及凋亡。

白藜芦醇对脂多糖诱导的人肺泡上皮细胞A549凋亡的保护作用机制

目的:探讨白藜芦醇对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的人肺泡上皮细胞A549增殖、凋亡的影响。方法:用MTT法检测LPS对A549细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blot检测凋亡相关信号通路蛋白的表达水平;实时荧光定量PCR和免疫荧光法分别在mRNA和蛋白水平检测其表达情况。结果:LPS能够以浓度梯度和时间梯度依赖的方式显著诱导肺癌细胞A549的凋亡,同时LPS能够升高细胞内活性氧的水平。Western blot结果表明LPS能够增加细胞内p53的表达水平并降低Bcl-2的表达。用白藜芦醇处理48h后,LPS所引起的细胞内活性氧水平升高的现象显著下降。Western blot结果表明白藜芦醇能够有效逆转LPS所引起的细胞内p53表达水平升高以及Bcl-2表达下降的情况。结论:白藜芦醇通过降低细胞内活性氧、p53水平以及升高Bcl-2水平对LPS所诱导的人肺泡上皮细胞A549凋亡起到保护作用。

下调lncRNA NEAT1通过NF-κB信号传导途径抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放

目的:探究下调lncRNA NEAT1对TNF-α诱导的肺泡上皮细胞A549氧化损伤和炎症因子释放的影响。方法:将肺泡上皮细胞A549分成Control组、TNF-α组(TNF-α处理)、sh-NC组(转染shRNA control,TNF-α处理)、sh-NEAT1组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α处理)、sh-NEAT1+PMA组(转染NEAT1 shRNA,TNF-α和NF-κB信号激活剂PMA处理)。MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,硫代巴比妥酸法检测细胞中MDA含量,黄嘌呤氧化法检测细胞中SOD活性,CellROX Green法检测细胞中ROS水平,ELISA检测IL-6、IL-8、IL-1β水平,Western blot检测Cleaved caspase-3、p65蛋白表达。结果:与Control组相比,TNF-α组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平升高,MDA含量、ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β增多,细胞中p65蛋白表达水平升高。与sh-NC组相比,sh-NEAT1组肺泡上皮细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,细胞中Cleaved caspase-3蛋白表达水平降低,MDA含量、ROS水平降低,SOD活性升高,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β减少,细胞中p65蛋白表达水平降低。与sh-NEAT1组相比,sh-NEAT1+PMA组肺泡上皮细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved caspase-3、p65蛋白表达增多,MDA含量和ROS水平升高,SOD活性降低,细胞分泌的IL-6、IL-8、IL-1β增多。结论:下调NEAT1通过降低NF-κB信号通路激活水平抑制TNF-α诱导的肺泡上皮细胞氧化损伤和炎症因子释放。

细胞因子信号转导抑制因子1对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞A549损伤的影响

目的探讨细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞A549损伤的影响。方法以肺泡上皮细胞A549为研究对象,A549细胞分成正常组、模型组、Vector+模型组、SOCS1+模型组共四组,在细胞中转染pcDNA3.1-SOCS1,给予肺炎链球菌刺激,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测细胞中SOCS1 mRNA表达水平,蛋白质印迹法(Western blotting)检测SOCS1蛋白表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性,试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放率和细胞中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blotting检测活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(C-caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9(C-caspase-9)蛋白水平,JC-1法检测线粒体膜电位,Western blotting检测胞质和线粒体中细胞色素C(Cytochrome C)蛋白水平。结果肺炎链球菌刺激后的肺泡上皮细胞A549中SOCS1表达水平下降[正常组SOCS1 mRNA(1.00±0.09),模型组SOCS1 mRNA(0.59±0.07)],细胞存活率降低[正常组(100.00±9.68)%,模型组(63.47±5.20)%],LDH释放率升高[正常组(2.68±0.27)%,模型组(12.30±1.78)%],MDA含量升高[正常组(75.61±5.32)nmol/g,模型组(165.92±13.17)nmol/g],SOD活性降低[正常组(131.47±12.86)×103 U/g,模型组(68.41±6.38)×103 U/g],细胞凋亡率和细胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平升高,线粒体膜电位下降,胞质中Cytochrome C蛋白水平升高,线粒体中Cytochrome C蛋白水平下降。pcDNA3.1-SOCS1转染后的肺炎链球菌条件下肺泡上皮细胞A549中SOCS1表达水平升高,细胞活性升高,LDH释放率降低,MDA含量下降,SOD活性升高,细胞凋亡率和细胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平降低,线粒体膜电位升高,线粒体中Cytochrome C蛋白水平升高,胞质中Cytochrome C蛋白水平降低。结论SOCS1减轻肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞A549损伤。

miR-486调控PTEN影响LPS诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡的实验研究

目的:探讨微小RNA-486(miR-486)对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549凋亡的影响和机制。方法:以LPS处理肺泡上皮细胞,RT-qPCR测定miR-486表达变化。在肺泡上皮细胞中转染miR-486模拟物(miR-486 mimics),RT-qPCR检测LPS条件下的转染效果。流式细胞术测定凋亡变化,Western blot检测细胞中cleaved caspase-3(C-caspase-3)和C-caspase-9蛋白表达变化。靶基因预测软件预测第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)可能是miR-486的靶基因,利用萤光素酶报告载体鉴定靶向关系。在肺泡上皮细胞中共转染pcDNA 3.1-PTEN和miR-486 mimics,检测上调PTEN对miR-486 mimics调控LPS诱导的A549细胞凋亡的作用。结果:LPS处理后的肺泡上皮细胞中miR-486的表达水平显著下降(P<0.05)。miR-486 mimics可以显著上调LPS条件下肺泡上皮细胞中miR-486的表达水平(P<0.05)。LPS处理后的肺泡上皮细胞凋亡率及C-caspase-3和C-caspase-9蛋白表达水平显著升高(P<0.05);上调miR-486可以显著下调LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡(P<0.05)。miR-486靶向负调控PTEN的表达。pcDNA 3.1-PTEN可以显著提高miR-486 mimics转染后LPS诱导的肺泡上皮细胞中PTEN的表达,促进细胞凋亡和细胞中C-caspase-3和C-caspase-9蛋白的表达(P<0.05)。结论:miR-486靶向抑制PTEN的表达,减少LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡。

黄芪熊竹素对脂多糖诱导肺泡上皮细胞氧化应激损伤的改善作用

目的探讨黄芪熊竹素对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞A549氧化应激损伤的改善作用,以及对核因子-红系2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)信号通路的影响。方法实验设空白对照组(DMEM培养基)、模型组(DMEM培养基+LPS 200 ng/mL),地塞米松组(DMEM培养基+LPS 200 ng/mL+地塞米松200 ng/mL)及黄芪熊竹素低、高剂量组(DMEM培养基+LPS 200 ng/mL+黄芪熊竹素400、800 ng/mL)。于570 nm波长处检测吸光度(OD)以计算细胞存活率;流式细胞仪检测细胞凋亡水平;检测氧化应激因子活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平;RT-PCR法及Western blot法分别检测细胞Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达水平。结果与模型组比较,各给药组细胞OD值,细胞存活率,单细胞克隆形成数目,SOD水平,Nrf2、HO-1 mRNA和蛋白表达水平均显著升高,细胞凋亡率,ROS、MDA水平均显著降低(P<0.05)。结论黄芪熊竹素对LPS诱导的A549细胞氧化应激损伤有显著改善作用,其机制可能与促进细胞Nrf2、HO-1的高表达有关。

衣康酸对百草枯诱导肺泡上皮细胞凋亡的保护作用及机制

为探讨衣康酸在百草枯诱导的肺泡上皮细胞凋亡中的作用及潜在分子机制,采用CCK-8、免疫荧光、RT-qPCR及免疫印迹等技术检测细胞凋亡水平和NF-κB信号通路活性.结果显示,衣康酸显著增强了百草枯抑制的人肺泡上皮细胞株BEAS-2B细胞活力(P<0.05),并抑制了百草枯诱导的Cleaved caspase-3蛋白表达.RT-qPCR结果表明,衣康酸显著降低了促凋亡基因Bax mRNA水平,并提高了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA水平(P<0.05).此外,衣康酸减少了NF-κB信号通路中P65蛋白的磷酸化.可见,衣康酸对百草枯诱导的BEAS-2B细胞凋亡具有显著抑制作用,其机制可能与抑制NF-κB信号通路中P65的磷酸化相关.

支气管肺发育不良发生机制中肺泡上皮细胞转分化关键信号通路的研究进展

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是早产儿严重呼吸系统并发症,重症病例仍缺乏有效治疗手段。BPD是多因素疾病,发病机制主要包括肺泡简单化和肺微血管发育障碍。肺泡上皮细胞是肺泡的主要构成部分,包括肺泡Ⅰ型(alveolar type 1,AT1)和肺泡Ⅱ型(alveolar type 2,AT2)细胞,其中AT1细胞参与气血屏障构建,发挥气体交换作用,AT2细胞具有增殖分化的干细胞特性,维持肺内环境稳态、修复肺损伤。肺损伤修复的核心是AT2细胞向AT1细胞的转分化,而激活转分化的信号转导机制尚未明确。本文通过文献检索和分类总结,探讨肺泡上皮细胞转分化的关键信号转导通路及研究进展,为阐述BPD发病机制及探索BPD新的治疗方案提供参考。

CFTR氯离子通道在Ⅱ型肺泡上皮细胞高氧损伤机制的研究

目的 研究囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)氯离子通道在Ⅱ型肺泡上皮细胞(AECⅡ)高氧损伤中的作用。方法 AECⅡ于密封舱中通入95%O_(2)+5%CO_(2),持续24h或48h,构建高氧损伤AECⅡ模型。将实验组AECⅡ随机分为高氧24h组、高氧24h+激动剂(Gen)组、高氧24h+抑制剂(AA)、高氧48h组、高氧48h+Gen组和高氧48h+AA组;对照组通入空气,未干预。以膜片钳系统记录CFTR氯离子电流强度。细胞外液中分别加入GEN50μM或AA10μM,记录GEN激活或AA抑制后氯离子电流强度。采用Clampfit 10.6行数据分析,应用R4.4.1统计软件对不同组别行Spearman相关性分析。结果 1.高氧24h、48h明显抑制AECⅡ氯离子电流(P<0.01),以24h较明显;2. Gen明显增加高氧24h、48hAECⅡ氯离子电流;AA明显抑制氯离子电流(P<0.01),均以48h较明显。结论 高氧可能通过影响AECⅡCFTR氯离子外流而发挥作用。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

lncRNA SNHG14调控肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞损伤的机制研究

目的探讨长链非编码RNA SNHG14(lncRNA SNHG14)靶向miR-17-5p/叉头蛋白K2(FOXK2)轴对肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞增殖、凋亡和炎症反应的影响。方法将肺泡上皮细胞A549分为对照组、感染组、sh-NC组、sh-SNHG14组、sh-SNHG14+inhibitor NC组、sh-SNHG14+miR-17-5p inhibitor组。采用荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测细胞lncRNA SNHG14、miR-17-5p、FOXK2 mRNA表达,CCK-8试剂盒检测A549细胞增殖,流式细胞术检测A549细胞的凋亡,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测细胞白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-6水平;采用双荧光素酶报告基因实验检测lncRNA SNHG14与miR-17-5p、miR-17-5p、FOXK2的结合情况。结果与对照组相比,感染组lncRNA SNHG14、FOXK2 mRNA表达水平、细胞凋亡率、IL-6、TNF-α、IL-1β水平均升高,miR-17-5p表达水平、吸光度(A)值均降低,差异有统计学意义(P<0.05);sh-SNHG14组lncRNA SNHG14、FOXK2 mRNA表达水平、细胞凋亡率、IL-6、TNF-α、IL-1β水平较感染组、sh-NC组均降低,miR-17-5p表达水平、A值较感染组、sh-NC组均升高,差异有统计学意义(P<0.05);sh-SNHG14+miR-17-5p inhibitor组FOXK2 mRNA表达水平、细胞凋亡率、IL-6、TNF-α、IL-1β水平较sh-SNHG14+inhibitor NC组均升高,miR-17-5p表达水平、A值较sh-SNHG14+inhibitor NC组均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验验证结果显示,lncRNA SNHG14与miR-17-5p、miR-17-5p与FOXK2均存在靶向关系。结论干扰lncRNA SNHG14表达可上调miR-17-5p的表达,下调FOXK2的表达,从而使肺炎链球菌感染的肺泡上皮细胞的凋亡及炎症反应受到抑制,并促进其增殖。

miR-20a对肺泡上皮细胞A549合成肺表面活性物质的影响及其机制

目的研究miR-20a对肺泡上皮细胞A549合成肺表面活性物质的影响及其可能的作用机制。方法将成功构建的miR-20a过表达慢病毒载体（miR-20a组）与空载慢病毒（空载组）分别转染A549细胞，通过观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达确定转染效率；采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况；生物信息学方法预测miR-20a促进肺发育的潜在相关靶基因；实时荧光定量PCR（qPCR）检测miR-20a、肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）、肺表面活性物质相关蛋白B（SP-B）、肺表面活性物质相关蛋白C（SP-C）和肺表面活性物质相关蛋白D（SP-D）mRNA的表达；免疫印迹法检测SP-A、SP-B、SP-C、SP-D及信号转导及转录活化因子3（STAT3）蛋白水平。结果通过绿色荧光表达观察到慢病毒成功转染入A549细胞，RT-PCR提示转染miR-20a过表达慢病毒载体后miR-20a的表达（3．85±0．18）较正常组（0．99±0．04）及空载组（1．21±0．12）显著增高，差异均有统计学意义（t=10．85、9．64，均P〈0．001），细胞株成功建立。与正常组（24h、48h、72h：0．23±0．01、0．39±0．01、0．56±0．03）及空载组（24h、48h、72h：0．25±0．01、0．44±0．05、0．59±0．01）比较，miR-20a对不同时间的A549细胞增殖（24h、48h、72h：0．26±0．01、0．41±0．02、0．58±0．02）无影响，差异均无统计学意义（均P〉0．05）。在线软件预测发现STAT3基因很可能是miR-20a的靶基因。与正常组（1．00±0．05、1．24±0．20、1．31±0．09、0．89±0．12）及空载组（0．76±0．10、1．31±0．13、1．50±0．11、1．01±0．11）比较，miR-20a可上调SP-A、SP-B、SP-C和SP．DmRNA的表达（2．05±0．17、2．14±0．10、2．84±0．09、1．66±0．08），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。与正常组（0．46±0．01、0．27±0．03、0．69±0．01、0．43±0．01）及空载组（0．43±0．01、0．21±0．01、0．79±0．02、0．44±0．02）比较，miR-20a也可上调SP-A、SP-B、SP-C和SP-D蛋白的表达（0．55±0．01、0．47±0．05、0．96±0．02、0．59±0．03），差异均有统计学意义（均P〈0．05）。。与正常组（0．60±0．04）及空载组（0．68±0．06）比较，miR-20a组STAT3表达水平（0．37±0．05）显著降低，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。结论STAT3是miR-20a的靶基因，miR-20a很可能通过抑制STAT3表达来促进A549细胞合成肺表面活性物质。

脂氧素A4对Ⅱ型肺泡上皮细胞-间质转化的抑制作用及其机制

目的 探讨脂氧素A4(lipoxin A4, LXA4)对Ⅱ型肺泡上皮细胞(alveolar epithelial typeⅡcell, ATⅡ)间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的影响及可能机制。方法 将A549细胞分为对照组、转化生长因子β1(transforming growth factor, TGF-β1)组、空质粒+TGF-β1组、pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组及LXA4+TGF-β1组。TGF-β1组以5 ng/mL TGF-β1干预A549细胞48 h;空质粒+TGF-β1组和pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞先分别转染空质粒或Nrf2过表达质粒,再以5 ng/mL TGF-β1干预48 h;LXA4+TGF-β1组A549细胞先用100 nmol/L LXA4预处理6 h再给予5 ng/mL TGF-β1干预48 h。光镜观察细胞形态变化,免疫印迹及免疫荧光法检测上皮标志物E钙黏蛋白(E-cadherin)、间质标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)表达;免疫印迹法检测核因子红细胞2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)蛋白水平。结果 与对照组相比,TGF-β1组光镜下可见部分A549细胞形态从鹅卵石状变成细长不规则状,呈间质性改变,E-cadherin表达减少(P<0.05)、α-SMA表达增多(P<0.01),Nrf2蛋白水平下调(P<0.05)。与TGF-β1组相比,pcDNA3.1-Nrf2+TGF-β1组A549细胞E-cadherin表达增多(P<0.05)、α-SMA表达减少(P<0.01);LXA4+TGF-β1组A549细胞E-cadherin上调、α-SMA下调以及Nrf2蛋白水平增多(P<0.05)。结论 LXA4可抑制A549细胞发生EMT,其机制与上调Nrf2表达相关。

探讨HMGB1对诱导人肺腺癌上皮细胞(A549)上皮间质转化的影响

目的研究HMGB1对诱导人肺腺癌上皮细胞(A549)上皮间质转化的影响。方法通过不同浓度rHMGB1(0、0.5、1、2、4μg/mL)体外刺激A549细胞,western blot检测各浓度组vimentin蛋白相对表达量,得出rHMGB1体外刺激的最佳作用浓度。然后分三组实验,HMGB1组、TGF-β组(阳性对照)、control组(阴性对照),分别以2μg/mL rHMGB1、2μg/mL TGF-β、RPMI1640培养基体外刺激A549细胞。37℃、5%CO_(2)培养48 h或96 h后,MTT检测各组细胞增殖率、transwell检测各组细胞迁移能力,western blot检测各组细胞E-cadherin、vimentin和snail1蛋白相对表达量。结果HMGB1组和TGF-β组分别与control组比较,细胞增殖率显著增加(分别为P<0.0001和P<0.01);细胞迁移数量明显增加(P<0.0001);胞内snail1、vimentin蛋白相对表达量明显增加(P<0.0001),E-cadherin蛋白相对表达量明显降低(P<0.0001)。结论HMGB1体外有诱导人肺腺癌上皮细胞(A549)上皮间质转化的作用。

circ_0114427靶向微小RNA-330-5p调控脂多糖诱导的肺泡上皮细胞凋亡及炎症反应

目的探讨circ_0114427对脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症的影响及其机制。方法体外培养人肺泡上皮细胞,分别转染si-circ_0114427、微小RNA(miR)-330-5p mimics或共转染si-circ_0114427与anti-miR-330-5p后,用10 mg/L LPS处理24 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞中circ_0114427和miR-330-5p表达量;采用蛋白免疫印迹评估活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase3)和活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-9(Cleaved-caspase9)蛋白水平;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达;采用流式细胞术分析细胞凋亡。采用双荧光素酶报告实验验证circ_0114427和miR-330-5p的互作关系。结果肺泡上皮细胞经LPS处理后,细胞中circ_0114427表达升高,miR-330-5p表达降低(P<0.05)。敲减circ_0114427或上调miR-330-5p可以抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡、Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9表达以及IL-6和TNF-α水平(P<0.05)。circ_0114427靶向结合并负调控miR-330-5p。miR-330-5p下调可以逆转circ_0114427敲低对LPS诱导的细胞凋亡和炎症的抑制作用。结论敲减circ_0114427可抑制LPS诱导的肺泡上皮细胞凋亡和炎症,这可能与miR-330-5p上调有关。

p53信号通路在MTB感染肺泡Ⅱ型上皮细胞系A549中的免疫调控作用

【目的】探讨p53通路在结核分枝杆菌(MTB)感染肺泡Ⅱ型上皮细胞(AECⅡ)中的免疫调控作用。【方法】将供试的p53基因过表达和干扰载体转染293T细胞,对其作用效果进行验证。利用脂质体分别转染p53基因过表达和干扰载体到AECⅡ细胞系A549中,建立p53基因过表达和干扰A549系模型细胞。用牛结核分枝杆菌减毒株(BCG)分别感染未经任何处理的A549细胞(感染对照组)及模型细胞,以未感染BCG的各类A549细胞为参照。以β-actin为内参基因,通过实时荧光定量PCR和Western blot来分析信号分子p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达,以及炎症细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的mRNA表达情况。【结果】过表达载体plRES2-EGFP-p53 WT和干扰载体TP53-RNAi(2648)作用效果明显,成功建立了p53基因过表达和干扰的A549细胞模型。BCG感染的对照组、p53基因过表达组和干扰组的A549细胞中,p53、p300、NF-κB、TLR-4、TRAF6在mRNA和蛋白水平的表达显著或极显著高于相应的BCG未感染组,其中p300表达与p53基因表达量呈正相关,NF-κB、TLR-4、TRAF6表达与p53基因表达量呈负相关;BCG感染可引起TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的显著表达,且与p53基因表达量呈负相关。【结论】BCG感染A549细胞时,p53信号通路中的p53协同p300来抑制NF-κB、TLR-4和TRAF6的活化及负调控TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-8的分泌,从而抵抗MTB的侵染。

不同浓度CO_2对肺泡Ⅱ型上皮细胞模型A549细胞活性的影响

目的观察不同浓度的CO2对A549细胞生物学性状的影响,探讨允许性高碳酸血症(PHC)的肺保护机制。方法 A549细胞株,分别采用5%CO2(A组)、10%CO2(B组)、18%CO2(C组)培养。分别于细胞培养24 h、36 h、48 h时,应用噻唑蓝比色法检测各组的细胞活性(吸光度值);采用血气分析仪检测细胞培养液p H值、二氧化碳分压(PCO2)、碳酸氢根(HCO3-);应用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果 (1)3组A549细胞吸光度值随培养时间延长而增高(P<0.05),B组各时点吸光度值均高于A组;与A组比较,C组于36 h、48 h的吸光度值降低(P<0.05)。(2)3组p H值随培养时间延长而降低(P<0.05),B、C两组p H值均低于A组相同时点,C组的p H值较B组更低(P<0.05)。3组PCO2值随培养时间延长而升高(P<0.05),B、C两组各时点的PCO2值均高于A组,C组的PCO2值较B组更高(P<0.05)。3组HCO3-值随时间延长而降低(P<0.05),B、C两组各时点HCO3-均高于A组,C组36 h、48 h时的HCO3-较B组更高(P<0.05)。(3)3组G1峰值和凋亡率随培养时间延长而升高(P<0.05);A组与B组比较,各时点的G1峰值和凋亡率均无统计学差异(P>0.05);与A组比较,C组在24 h、36 h G1峰值明显增高,并于干预后36 h、48 h凋亡率增加(P<0.05)。结论 10%CO2不影响A549的增殖,但可增加A549细胞活性;18%CO2抑制A549细胞的增殖并促进其凋亡。

金合欢素通过调节Sirt1介导的AMPK/Nrf2信号通路改善肺炎链球菌感染引起的肺泡上皮细胞损伤

目的:探讨金合欢素通过调节沉默信息调节因子相关酶1(Sirt1)介导的5'-磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)/核因子E2相关因子2(Nrf2)信号通路对肺炎链球菌(SP)感染引起的肺泡上皮细胞损伤的影响。方法:SP感染体外培养的肺泡上皮细胞A549建立细胞损伤模型,采用终浓度分别为0、5、25、50、100、150、200μmol/L的金合欢素处理,CCK-8检测各处理组细胞活力并筛选金合欢素最佳作用浓度。体外培养的A549细胞随机分为5组:对照组、模型组、金合欢素(150μmol/L)组、EX527(Sirt1抑制剂,40μmol/L)组、金合欢素(150μmol/L)+EX527组(40μmol/L),对照组不进行处理,其余各组以SP感染建立细胞损伤模型,150μmol/L金合欢素和40μmol/L EX527分别处理,CCK-8、流式细胞术分别检测各组细胞活力与凋亡率;试剂盒检测各组细胞活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)水平及IL-10、IL-1β、TNF-α水平;免疫印迹法检测各组细胞增殖相关蛋白Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、凋亡相关蛋白caspase-9、Bax表达、Sirt1与AMPK/Nrf2信号通路蛋白p-AMPK/AMPK、Nrf2表达。结果:与对照组比较,模型组A549细胞活力、SOD、IL-10水平、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2、Ki-67与PCNA蛋白表达降低(P<0.05),凋亡率、MDA、LDH、ROS水平、IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)。与模型组、金合欢素+EX527组分别比较,金合欢素组A549细胞活力、SOD、IL-10水平、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2、Ki-67与PCNA蛋白表达均升高(P<0.05),凋亡率、MDA、LDH、ROS、IL-1β、TNF-α水平均降低(P<0.05);EX527组A549细胞活力、SOD、IL-10水平、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Nrf2、Ki-67与PCNA蛋白表达均降低(P<0.05),凋亡率、MDA、LDH、ROS、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05)。结论:金合欢素可通过上调Sirt1表达激活AMPK/Nrf2信号,进而促进抗炎因子分泌,减少ROS和促炎因子产生,减轻炎症与氧化应激,最终缓解神经元损伤。