猪繁殖与呼吸综合征病毒促进猪链球菌2型感染猪肺泡巨噬细胞的初步研究

为探究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)对不同毒力猪链球菌2型(SS2)感染巨噬细胞的影响,本研究建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染永生化猪肺泡巨噬细胞(iPAM)的模型,实验分为4组:HA单独感染组(HA组)、PRRSV-HA共感染组(PRRSV-HA组)、T1/5单独感染组(T1/5组)和PRRSV-T1/5共感染组(PRRSV-T1/5组),利用该模型通过黏附试验、侵入试验和细胞内存活试验检测PRRSV对HA和T1/5黏附、侵入iPAM细胞及对该细胞存活率的影响,进一步利用荧光定量PCR方法检测各感染组iPAM模型细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平。黏附试验结果显示,HA感染2 h后,PRRSV-HA组细菌对细胞的黏附水平极显著高于HA组(P<0.01或P<0.001);T1/5感染6 h后,PRRSV-T1/5组细菌对细胞的黏附水平极显著高于T1/5组(P<0.001),表明PRRSV与HA或T1/5共感染可以促进HA和T1/5对iPAM模型细胞的黏附,且HA对iPAM细胞的黏附水平高于T1/5。侵入试验结果显示,感染4 h后,共感染组细菌侵入iPAM细胞中的数量比单独感染组极显著增多(P<0.01或P<0.001)。细胞内存活试验结果显示,感染2 h后,共感染组细菌的存活率比单独感染组极显著升高(P<0.001)。荧光定量PCR试验结果显示,感染4 h时,共感染组iPAM细胞中细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-8、IFN-β)的转录水平极显著高于单独感染组(P<0.001)。本研究首次建立了高致病性PRRSV Li11株和SS2强毒株HA或无毒菌株T1/5共感染i PAM的模型,基于该模型研究首次发现PRRSV感染不仅促进了不同毒力SS2对i PAM细胞的黏附、侵入及SS2在iPAM细胞内的存活,还可以协同SS2显著提高该细胞中细胞因子的转录水平。本研究为进一步探究PRRSV和SS混合感染的机制提供了参考依据。

IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路增强小鼠肺泡巨噬细胞的吞噬功能

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)对MH-S小鼠肺泡巨噬细胞吞噬功能的影响及其相关机制。方法 脂多糖(LPS)经气道滴入激发构建小鼠急性肺损伤(ALI)模型,ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)中IL-6的含量。体外培养MH-S细胞,在信号转导子与转录激活子3 (STAT3)抑制剂Stattic(5μmol/L)存在与否的情况下,再加入IL-6(10 ng/mL~500 ng/mL)刺激6 h,加入荧光微球孵育2 h后,采用流式细胞术检测MH-S细胞吞噬荧光微球情况;Western blot法检测磷酸化的Janus激酶2(p-JAK2)、磷酸化的STAT3(p-STAT3)、肌动蛋白相关蛋白2(Arp2)、纤维型肌动蛋白(F-actin)的表达水平。结果 鼻腔滴入LPS后,小鼠BALF中IL-6含量显著升高。随着IL-6刺激剂量的增加,MH-S细胞吞噬荧光微球的作用增强,Arp2、 F-actin蛋白的表达水平升高。100 ng/mL IL-6刺激MH-S细胞后,p-JAK2和p-STAT3蛋白的表达水平升高。阻断MH-S细胞STAT3信号后,IL-6促进细胞吞噬的效应完全消失,IL-6诱导的Arp2、 F-actin蛋白表达增加被抑制。结论 IL-6通过激活JAK2/STAT3信号通路促进MH-S细胞Arp2、 F-actin蛋白的表达增强吞噬功能。

桑叶多糖对猪肺泡巨噬细胞的免疫调节作用

[目的]探究桑叶多糖(mulberry leaf polysaccharide,MLP)对猪肺泡巨噬细胞免疫功能的影响及其作用机制。[方法]以猪肺泡巨噬细胞为研究对象,通过CCK-8方法检测不同浓度MLP作用后猪肺泡巨噬细胞的增殖率,筛选MLP的适宜作用浓度。将细胞分成空白对照组(BC组)、阳性对照组(LPS组)和不同浓度MLP组,通过Griess法检测猪肺泡巨噬细胞中一氧化氮(NO)释放量;利用中性红吞噬试验检测猪肺泡巨噬细胞吞噬能力;使用ELISA法测定猪肺泡巨噬细胞中白细胞介素-10(IL-10)、IL-6和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;利用实时荧光定量PCR检测TNF-α、Toll样受体4(TLR4)、IL-6、IL-10以及核转录因子κB(NF-κB)的mRNA表达量;通过Western blotting检测猪肺泡巨噬细胞中TLR4和p65蛋白表达量。[结果]与0μg/mL MLP组相比,MLP浓度为20、40和80μg/mL时猪肺泡巨噬细胞增殖率极显著升高(P<0.01),且呈剂量依赖性,后续选择20、40和80μg/mL MLP进行试验。与BC组相比,不同浓度MLP组猪肺泡巨噬细胞吞噬率和NO释放量极显著升高(P<0.01)。ELISA检测结果显示,MLP浓度为80μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中IL-6和TNF-α含量显著或极显著高于BC组(P<0.05;P<0.01)。实时荧光定量PCR结果显示,MLP浓度为40和80μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中TNF-α、IL-6和TLR 4基因mRNA表达量均极显著高于BC组(P<0.01)。Western blotting检测结果显示,MLP浓度为80μg/mL时,猪肺泡巨噬细胞中p65和TLR4蛋白表达量极显著高于BC组(P<0.01)。[结论]MLP能激活猪肺泡巨噬细胞,显著促进NO的释放以及IL-6、TNF-α的分泌,具有良好的免疫调节活性,其免疫调节机制与巨噬细胞表面TLR4的激活相关。

基于PPARγ信号通路研究香烟烟雾提取物干预不同时间下对肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能影响的分子机制

目的:观察香烟烟雾提取物(CSE)干预不同时间下肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能的变化,探讨其对肺部疾病炎症反应的影响及分子机制。方法:大鼠肺泡巨噬细胞NR8383采用10%CSE分别干预6 h、12 h、24 h、48 h,分为6 h空白对照组、6 h-10%CSE组、12 h空白对照组、12 h-10%CSE组、24 h空白对照组、24 h-10%CSE组、48 h空白对照组、48 h-10%CSE组。10%CSE干预12 h后联用PPAR抑制剂/激动剂,分为PPAR抑制剂组、PPAR激动剂组。Alamar Blue法检测PPAR激动剂对NR8383细胞增殖及毒性作用;流式细胞术检测NR8383细胞胞葬、吞噬功能及M1、M2极化分型;酶联免疫吸附实验检测TNF-α、TGF-β1、MFG-E8含量;免疫印迹法检测PPARγ信号通路及下游分子CD36蛋白表达;qPCR检测PPARγ、CD36 mRNA的表达。结果:10%CSE干预6 h后,NR8383细胞吞噬及胞葬功能均有所升高,PPARγ表达下调,CD36 mRNA表达增加,TNF-α、TGF-β1、MFG-E8表达均升高,但无明显极化方向;干预12 h,NR8383细胞吞噬功能及胞葬率显著降低,PPARγ、CD36表达显著下调,TNF-α表达增强,TGF-β1、MFG-E8表达降低,向M1型巨噬细胞极化;干预24 h后,NR8383细胞胞葬率降低,但吞噬大肠杆菌的功能增强,PPARγ表达下调,CD36蛋白表达降低,TNF-α表达降低但差异无统计学意义,TGF-β1、MFG-E8表达仍处于降低状态,有明显的M1型极化倾向;48 h后NR8383细胞胞葬率仍旧降低,但吞噬能力显著提升,PPARγ表达显著降低,CD36表达显著增加,TNF-α表达降低,TGF-β1、MFG-E8表达增加,巨噬细胞向M1、M2方向极化均增加。选择10%CSE干预12 h联合PPAR激动剂、抑制剂后发现,PPAR激动剂增强NR8383细胞胞葬及吞噬能力,上调PPARγ、CD36表达,抑制炎症因子TNF-α表达,促进抑炎因子TGF-β1、胞葬辅助因子MFG-E8表达。结论:随着CSE干预时间的变化,肺泡巨噬细胞从早期炎症反应的活化状态,逐渐进展为慢性炎症反应状态,进而导致肺泡巨噬细胞胞葬及吞噬功能障碍,该机制与PPARγ通路被抑制有关。

右美托咪定通过JAK2/STAT3信号通路影响肺泡巨噬细胞极化

目的:研究右美托咪定(DEX)对脂多糖(LPS)诱导的肺泡巨噬细胞极化的影响,并探讨其相关机制。方法:体外培养大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,实验1:对照组、模型组(1μg/ml LPS)、DEX低、中、高剂量组(1、5、10 mg/kg DEX+1μg/ml LPS);实验2:DEX高剂量组(10 mg/kg)、DEX高剂量+Colivelin(JAK2/STAT3信号通路激活剂)组(10 mg/kg DEX+0.5μmol/L Colivelin)。倒置显微镜观察大鼠肺泡巨噬细胞NR8383形态学变化;RT-PCR检测NR8383细胞中iNOS与Arg1 mRNA表达水平;流式细胞术检测NR8383细胞中CD86、CD163蛋白表达水平;Western blot检测NR8383细胞表面标志物蛋白TNF-α、iNOS、SOCS、Arg1、TGF-β及JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达水平变化。结果:与对照组比较,模型组NR8383细胞间隙有大量细胞碎片,iNOS mRNA、CD86阳性细胞比例、TNF-α、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平显著升高,Arg1 mRNA、CD163阳性细胞比例、SOCS、TGF-β表达水平显著降低(P<0.05);与模型组相比,DEX低、中、高剂量组NR8383细胞间隙细胞碎片减少,iNOS mRNA、CD86阳性细胞比例、TNF-α、p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平显著降低,Arg1 mRNA、CD163阳性细胞比例、SOCS、TGF-β表达水平显著升高(P<0.05)。Colivelin对JAK2/STAT3信号通路再激活可减弱DEX对LPS诱导的NR8383细胞极化作用。结论:DEX抑制LPS诱导的NR8383细胞M1型极化,可能是通过抑制JAK2/STAT3信号通路实现的。

三磷酸腺苷对脂多糖诱导大鼠肺泡巨噬细胞焦亡的作用及其机制研究

目的探讨三磷酸腺苷(ATP)对脂多糖(LPS)诱导大鼠肺泡巨噬细胞焦亡的影响。方法将大鼠肺泡巨噬细胞随机分为Control组、LPS组、ATP组和LPS+ATP组;应用双抗体夹心法测定标本白细胞介素-1β(IL-1β)表达水平,应用Western blotting检测GSDMD、GSDMD-N、Caspase-1、NLRP3蛋白表达;用TUNEL染色法检测各组细胞焦亡情况。结果Control组、LPS组、ATP组、LPS+ATP组的大鼠肺泡巨噬细胞IL-1β水平比较,经析因设计的方差分析,结果:①LPS的效应差异有统计学意义(P<0.05);②ATP的效应差异有统计学意义(P<0.05);③LPS和ATP交互效应差异有统计学意义(P<0.05)。各组Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、NLRP3蛋白相对表达量比较,经析因设计的方差分析,结果:①LPS的效应差异有统计学意义(P<0.05);②ATP的效应差异有统计学意义(P<0.05);③LPS和ATP交互效应差异有统计学意义(P<0.05)。Control组、LPS组、ATP组、LPS+ATP组的大鼠肺泡巨噬细胞焦亡率比较,经析因设计的方差分析,结果:①LPS的效应差异有统计学意义(P<0.05);②ATP的效应差异有统计学意义(P<0.05);③LPS和ATP交互效应差异有统计学意义(P<0.05)。结论ATP对LPS诱导大鼠肺泡巨噬细胞的焦亡具有一定的促进作用,为深入探讨细胞焦亡的作用及其机制提供了初步的实验依据和理论基础。

基于PPARγ/LXR-α信号通路探讨槲皮素对急性肺损伤肺泡巨噬细胞胞葬功能影响机制

目的 观察槲皮素对急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能的影响,并基于过氧化物酶增殖物激活受体γ(PPARγ)/肝X受体α(LXR-α)信号通路研究其作用机制。方法 将60只雄性SD大鼠随机分为6组,每组10只。槲皮素低、中、高剂量组分别于造模前给予10 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg的槲皮素灌胃,地塞米松组给予5 mg/kg的地塞米松灌胃,正常组和脂多糖组给予等量生理盐水灌胃,均1次/d。连续灌胃14 d后,除正常组外,其余组均采用鼻滴法给予脂多糖建立急性肺损伤模型。于造模后24 h,检测各组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能,原位末端转移酶标记法(TUNEL)测定肺组织细胞凋亡率,ELISA法检测血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)水平,HE染色观察肺组织病理形态,免疫组化法检测肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达情况,RT-PCR法检测肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA表达情况。结果 与正常组比较,脂多糖组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能明显减弱(P<0.05),肺组织细胞凋亡率和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显增高(P均<0.05),血清IL-10水平明显降低(P<0.05),肺细胞肿胀、变性及大量炎性细胞浸润,肺组织中PPARγ、LXR-α、CD68蛋白阳性表达平均光密度值及mRNA相对表达量均明显降低(P均<0.05);与脂多糖组比较,槲皮素各组及地塞米松组大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能均明显增强(P均<0.05),槲皮素中、高剂量组及地塞米松组肺组织细胞凋亡率和血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显降低(P均<0.05),槲皮素各剂量组血清IL-10水平均明显升高(P均<0.05),槲皮素高剂量组肺组织病理损伤明显改善,槲皮素中、高剂量组PPARγ、LXR-α、CD68阳性表达平均光密度值和PPARγ、LXR-α、CD68 mRNA相对表达量均明显高于脂多糖组(P均<0.05),地塞米松组PPARγ和CD68阳性表达平均光密度值、PPARγ和LXR-α mRNA相对表达量均明显高于脂多糖组(P均<0.05)。结论 槲皮素可增强脂多糖诱导急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞胞葬功能,减轻肺组织病理损伤,其机制可能与激活PPARγ/LXR-α信号通路有关。

肺泡巨噬细胞自噬在急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征中的研究进展

急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)是一种高发病率与高病死率的临床危重疾病。近年来众多研究发现,细胞自噬与ALI/ARDS肺部损伤密切相关。肺泡巨噬细胞自噬在ALI/ARDS病程中具有重要调节作用,能够有效干预ALI/ARDS病程。结合文献研究发现,肺泡巨噬细胞自噬调节是减轻ALI/ARDS的重要靶点,能够有效减轻肺损伤。本研究主要对肺泡巨噬细胞自噬在ALI/ARDS中的双重靶向调节作用研究进展进行综述,以期为今后ALI/ARDS的临床治疗提供新的研究思路和方向。

肺泡巨噬细胞与肺泡上皮细胞相互作用的研究进展

肺泡巨噬细胞位于肺泡腔表面,其作为肺内重要的免疫细胞在不同微环境条件下发挥作用,是肺部防御呼吸道病原体的第一道防线。肺泡上皮作为肺泡的基础性组织结构,承担肺呼吸、分泌、修复等多种功能。研究表明肺泡巨噬细胞与肺泡上皮细胞不仅结构相连,二者还存在多种相互作用。本文综述肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞各自的基本功能,并对二者之间的相互作用进行阐述,以期为进一步研究肺的生理、病理状态提供新的研究思路。

氢吗啡酮对脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞高尔基体应激影响

目的探讨氢吗啡酮(HM)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠肺泡巨噬细胞高尔基体应激的影响及其机制。方法以10mg/LLPS处理小鼠肺泡巨噬细胞系MH-S,构建肺泡巨噬细胞高尔基体应激模型。将细胞随机分为Control组(A组,正常培养)、LPS组(B组,给予10mg/L的LPS)、LPS+HM组(C组,给予1μmol/LHM和10mg/LLPS)、Nrf2siRNA+LPS+HM组(D组,Nrf2siRNA转染后给予1μmol/LHM和10mg/LLPS)和NC siRNA+LPS+HM组(E组,NCsiRNA转染后给予1μmol/LHM和10mg/LLPS)。采用ELISA法检测细胞上清液白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素6(IL-6)含量;检测丙二醛(MDA)含量与超氧化物歧化酶(SOD)活性;采用Westernblot法检测核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)、高尔基体基质蛋白130(GM130)、高尔基体蛋白97(Golgin-97)、甘露糖苷酶Ⅱ(MannosidaseⅡ)、钙转运ATP酶2C型成员1(ATP2C1)蛋白表达水平;透射电镜下观察细胞高尔基体形态学改变。结果与A组比较,B组IL-1β、IL-6、MDA含量显著升高及Nrf2、HO-1蛋白表达上调,SOD活性显著降低及GM130、Golgin-97、MannosidaseⅡ、ATP2C1蛋白的表达下调(F=2.33~47.61,P<0.05);与B组比较,C组IL-1β、IL-6、MDA含量显著降低,SOD活性显著升高及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、MannosidaseⅡ、ATP2C1蛋白表达上调(P<0.05);与C组比较,D组IL-1β、IL-6、MDA含量显著升高,SOD活性显著降低及Nrf2、HO-1、GM130、Golgin-97、MannosidaseⅡ、ATP2C1蛋白表达下调(P<0.05)。透射电镜显示,C组细胞高尔基体损伤、空泡化与碎片化较B组减轻;D组细胞高尔基体损伤、空泡化与碎片化较C组加重。结论HM通过调控Nrf2/HO-1信号通路抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞高尔基体应激,减轻细胞炎症与氧化应激反应。

不同条件下小鼠肺泡巨噬细胞体外培养的实验研究

目的:应用文献报道的肺泡巨噬细胞(AMs)体外培养方法,利用GM-CSF、TGF-β和PPAR-γ激动剂罗格列酮(简称GTR)培养体系,分析不同年龄小鼠、不同来源前体细胞产生AM样细胞或AMs的特征。方法:收取不同周龄小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)、骨髓单个核细胞以及胚胎15~17 d小鼠肝脏单个核细胞,种入12孔板,置于GTR体系中培养。流式细胞术检测产出细胞AM表面标志分子F4/80、CD11b、CD170和CD11c表达。结果:培养后,光镜下BALF来源细胞基本呈圆形,骨髓来源细胞近半呈圆形,胎肝来源细胞85%左右呈圆形。4周龄小鼠BALF-AMs比例接近90%,比例和数量均随小鼠年龄增加而增加,12周龄小鼠BALF-AMs数量接近1×106个。4周龄小鼠骨髓源AM样细胞比例不到20%,8周龄和12周龄小鼠比例为40%~45%,数量随小鼠年龄增加而增加,12周龄小鼠骨髓源AM样细胞数量约为0.8×106个/孔。胎肝源AM样细胞比例约为84%,1个孔产出的AM样细胞约为4×106个。结论:不同年龄小鼠、不同来源前体细胞产生AM样细胞或AMs的纯度和数量有较大差别,应根据具体研究要求选择合适方法。

肺泡巨噬细胞脂质代谢在慢性阻塞性肺病中的研究进展

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一种呼吸道慢性炎症性疾病,高发病率和死亡率造成了巨大社会和经济负担,2019年WHO公布COPD已成为全球第三大死亡原因[1]。但COPD的发病机制尚不明了。随着脂质代谢研究的深入,在COPD中肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)内的脂质代谢变化也备受关注。Fujii等[2]在研究中发现了AM中的脂质组成以COPD疾病等级依赖性的方式发生变化,这些变化的脂质主要是鞘脂、胆固醇、磷脂和脂肪酸,表明脂质代谢在COPD病程的发生发展中起到一定的作用。

肺纤维化微环境中肺泡巨噬细胞的蛋白质组学分析

目的肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages,AMs)能够处理表面活性物质来维持肺泡膨胀开放,并充当防御病原体入侵的第一道免疫防线,对肺部微环境稳态的维持至关重要。已有研究表明,肺纤维化过程中,单核来源的AMs持续释放促炎因子和趋化因子,招募更多免疫细胞到受损区域,维持并加剧炎症,从而发挥负面作用。目前,大多数研究聚焦于肺纤维化微环境AMs的基因表达水平,而在蛋白质功能和调控方面的报道较少。本研究旨在探讨正常生理条件下与肺纤维化后AMs的差异表达蛋白(differentially expressed proteins,DEPs),以便更全面地理解AMs在肺纤维化发展过程中的作用。方法本研究建立博来霉素诱导肺纤维化小鼠模型,利用流式细胞分选技术收集来自生理盐水对照组和肺纤维化模型的AMs(每个样本2.5×105个细胞),通过无标记蛋白质组学方法获得蛋白质表达谱。结果通过将生理盐水组与已公开的生理AMs蛋白质组数据比对发现,本研究产出的蛋白质组数据质量较高,能够满足研究需求。综合分析结果显示,与对照组相比,博来霉素组AMs有778种蛋白质表达上调。此外,上调的DEPs中富集通路包括I-κB/NF-κB通路、炎症反应调节通路、吞噬调节通路、TGF-β通路和HIF-1通路,表明肺纤维化微环境中的AMs具有促炎和促纤维化功能。对DEPs的蛋白质-蛋白质相互作用网络分析表明,Tlr2和Pycard之间的相互作用是AMs促炎表型的控制节点,从而导致肺纤维化进展。结论本研究探讨了AMs在肺纤维化微环境中蛋白质表达谱的变化。结果发现,AMs显著上调多条与炎症和纤维化关联的通路蛋白,并提示Tlr2和Pycard的相互作用是AMs表现出高度促炎活性的控制节点。

呕吐毒素体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子和m^(6)A甲基化相关基因表达的影响

本实验构建了呕吐毒素(DON)体外刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞模型,研究DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞对炎性因子IL-6、IL-8和m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3、METTL14、FTO、WTAP和YTHDF2表达的影响。利用2μmol/L的DON刺激细胞24h和48h,收集不同时间点细胞样品的总RNA和总蛋白,通过实时荧光定量PCR检测炎性因子和m^(6)A修饰相关基因表达水平的变化,并利用蛋白免疫印迹法(WB)检测METTL3和FTO蛋白的表达水平变化。结果表明:2μmol/L的DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞24 h和48 h后,炎性细胞因子IL-6、IL-8的相对表达量均上调(P<0.01);与对照组相比,METTL3基因的mRNA转录水平均上调(P<0.05),FTO基因的mRNA转录水平均下调(P<0.05),METTL14基因仅在24 h后上调(P<0.05),而WTAP和YTHDF2基因在DON刺激细胞24 h和48 h后均无显著变化。蛋白免疫印迹分析结果显示,METTL3蛋白在48 h后上调(P<0.05),而FTO蛋白在24 h和48 h均下调(P<0.05)。以上结果表明,DON刺激3D4/21猪肺泡巨噬细胞可引起细胞内炎性因子的表达增加,且m^(6)A甲基化修饰相关基因METTL3的上调和FTO的下调可能与细胞炎症相关。此外,对DON组小鼠腹腔注射5 mg/kg BW DON,对照组注射等体积的磷酸盐缓冲液。3 h后检测小鼠肺脏组织中m^(6)A甲基化修饰相关基因的表达情况,与对照组相比,肺脏组织中m^(6)A甲基化相关基因METTTL3、METTL14、WTAP、YTHDF2均无显著差异;FTO下调(P<0.001)。蛋白免疫印迹分析结果显示:在DON刺激小鼠3h后FTO蛋白下调(P<0.01),表明DON在动物体内也表现出相似的效应。

芒果苷抑制脂多糖诱导小鼠肺泡巨噬细胞炎症反应的机制研究

【目的】探究芒果苷抑制脂多糖(LPS)诱导的炎症反应作用机制,为筛选治疗脓毒症的候选药物提供科学依据。【方法】选取小鼠肺泡巨噬细胞(MH-S)为研究对象,通过CCK-8试剂检测芒果苷对MH-S细胞的毒性作用,根据细胞毒性试验确定芒果苷的作用浓度为100μg/mL,以正常培养的MH-S细胞为对照,使用10μg/mL LPS处理24 h构建体外炎症模型(LPS组),再以100μg/mL芒果苷干预24 h(干预组);通过ELISA检测MH-S细胞上清液中的炎症因子(IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18)含量,采用实时荧光定量PCR检测IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因表达情况,并以Western blotting和免疫荧光法检测TLR4/NF-κB信号通路的变化。【结果】芒果苷浓度低于287.60μg/mL时,对MH-S细胞无明显的毒性作用。与对照组相比,LPS组MH-S细胞中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因相对表达量极显著升高(P<0.01,下同),细胞上清液中的IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18含量显著(P<0.05,下同)或极显著升高;但以芒果苷干预后,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-18基因的相对表达量及其分泌水平均显著降低,表明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞的炎症反应。此外,LPS组MH-S细胞中的NF-κB基因相对表达量与蛋白表达水平极显著高于对照组,经芒果苷干预后NF-κB基因相对表达量与蛋白表达水平均显著下降,表明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞中核转录因子的表达;LPS组MH-S细胞表面的TLR4表达水平明显升高,但经芒果苷干预后MH-S细胞表面的TLR4表达水平明显降低,说明芒果苷能有效抑制LPS诱导MH-S细胞表面TLR4的表达。【结论】芒果苷对MH-S细胞的增殖无明显抑制作用,其半数增殖抑制率(IC50)为287.60μg/mL;芒果苷对LPS诱导的MH-S细胞炎症反应具有良好的保护作用,其作用机制可能与抑制TLR4/NF-κB信号通路激活而减少炎症因子的分泌有关。

二肽基肽酶4基因沉默对脂多糖诱导肺泡巨噬细胞焦亡的促进作用及其机制

目的观察二肽基肽酶4(DPP-4)基因沉默对脂多糖(LPS)诱导肺泡巨噬细胞焦亡的促进作用,并探讨其可能的机制。方法取对数生长期的MH-S肺泡巨噬细胞系(简称MH-S细胞),随机分为Control siRNA组(转染Control siRNA)、DPP-4 siRNA组(转染DPP-4 siRNA)、Control siRNA+LPS组(转染Control siRNA后加入LPS)、DPP-4 siRNA+LPS组(转染DPP-4 siRNA后加入LPS)。倒置显微镜下观察各组细胞形态是否呈焦亡表现(细胞空泡化、发生聚团及细胞膜破裂),CCK-8法观察细胞增殖活性,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性实验观察焦亡所致细胞毒性(以LDH释放量表示),Calcein-AM/PI双染法观察细胞死亡情况(以PI阳性细胞率表示),Western blotting法检测细胞焦亡通路标志蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 p20亚基(Caspase-1 p20)、焦孔素D-N端(GSDMD-N)及炎症因子白细胞介素18(IL-18)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白相对表达量。取对数生长期的MH-S细胞,随机分为Control siRNA+LPS作用组(转染Control siRNA后加入LPS)、DPP-4 siRNA+LPS作用组(转染DPP-4 siRNA后加入LPS)、Control siRNA+SB203580+LPS作用组(转染Control siRNA后加入p38抑制剂SB203580、LPS)、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组(转染DPP-4 siRNA后加入p38抑制剂SB203580、LPS),采用Western blotting法检测细胞p38活化相关指标及焦亡通路标志蛋白表达。结果Control siRNA组细胞无焦亡表现,DPP-4 siRNA组可见少量细胞呈焦亡表现,Control siRNA+LPS组和DPP-4 siRNA+LPS组可见大量细胞呈焦亡表现,以DPP-4 siRNA+LPS组细胞焦亡表现更明显。Control siRNA组、DPP-4 siRNA组、Control siRNA+LPS组、DPP-4 siRNA+LPS组细胞增殖活性依次降低,LDH释放量、PI阳性细胞率及细胞NLRP3、ASC、Caspase-1 p20、GSDMD-N、IL-18、IL-1β蛋白相对表达量均依次升高,组间两两比较P均<0.05。与DPP-4 siRNA+LPS作用组比较,Control siRNA+LPS作用组、Control siRNA+SB203580+LPS作用组、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组p-p38/p38、p-NF-κB/NF-κB及NLRP3、Caspase-1 p20、GSDMD-N蛋白相对表达量均降低,以Control siRNA+SB203580+LPS作用组、DPP-4 siRNA+SB203580+LPS作用组降低更明显(P均<0.05)。结论DPP-4基因沉默可促进LPS诱导的肺泡巨噬细胞焦亡,其机制可能与促进p38、NF-κB磷酸化后启动NLRP3炎症小体形成及炎症因子释放,从而调控Caspase-1介导的经典细胞焦亡通路有关。

基于CRISPR/Cas9技术的SIRT3基因敲除猪肺泡巨噬细胞系的构建与鉴定

【目的】旨在构建稳定敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞系,分析SIRT3敲除对病毒诱导的炎症反应的调控作用,为探究SIRT3基因在宿主抗病毒感染中的作用奠定试验基础。【方法】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,针对猪SIRT3基因第2号外显子设计sgRNA,连接pb-U6-puro-BFP质粒后转染3D4/21细胞,筛选单克隆细胞,结合Sanger测序、qPCR和Western blot技术对获得的单克隆细胞进行鉴定,进而获得SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21-SIRT3-KO),并以流感病毒A/WSN/33为研究对象,感染野生型和3D4/21-SIRT3-KO猪肺泡巨噬细胞,利用qPCR方法检测炎症相关因子IL-6、IL-8的表达水平,初步分析SIRT3基因在流感病毒感染诱导炎症反应的影响。【结果】Sanger测序结果显示,在挑选获得的敲除SIRT3基因的猪肺泡巨噬细胞克隆中,SIRT3基因第2号外显子位点产生了碱基缺失,并导致移码突变;同时,利用qPCR和Western blot检测猪肺泡巨噬细胞中SIRT3 mRNA和蛋白水平的表达,结果显示与野生型细胞相比,3D4/21-SIRT3-KO细胞中SIRT3 mRNA和SIRT3蛋白均不表达;流感病毒感染SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞时发现,敲除SIRT3能显著加剧流感病毒感染诱导的炎症反应。【结论】研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功构建了SIRT3基因敲除的猪肺泡巨噬细胞系,并初步分析了SIRT3在流感病毒感染中作用。

哮喘中肺泡巨噬细胞相关研究进展

支气管哮喘作为一种呼吸道的过敏性疾病,其在世界范围内有较高的发病率。对该病患者的生活质量产生了很大影响,常常产生多种并发症,甚至导致患者死亡。气道炎症与气道高反应性与支气管哮喘的发病密切相关,其中肺泡巨噬细胞作为人体免疫细胞之一,也参与了支气管哮喘气道炎症的发生发展过程,并在此过程中受到多种因素的影响,继而导致肺泡巨噬细胞在吞噬功能、细胞极化、气道重塑、胞葬作用等方面发生了变化,本篇综述从肺泡巨噬细胞的起源及其在支气管哮喘中相关功能改变等方面进行综述。

肺泡巨噬细胞和肺泡上皮细胞在急性呼吸窘迫综合征中的研究进展

急性肺损伤常导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)危重患者死亡,免疫细胞浸润被视为ARDS的重要标志,其中肺泡巨噬细胞(AMs)是ARDS发病过程中发挥作用的免疫细胞,AMs主要通过与肺泡上皮细胞(AECs)相互作用来参与疾病的发展。在ARDS早期阶段,激活的AMs分泌促炎细胞因子,以清除可能破坏AECs细胞结构并引起细胞死亡的病原体。在ARDS晚期,交替激活的巨噬细胞分泌抗炎细胞因子,抑制炎症反应,促进上皮再生和肺泡结构重塑。本文主要回顾AMs和AECs在ARDS中的功能和特点,以及描述AMs和AECs之间的相互作用。

骨髓间充质干细胞源外泌体对急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞M1/M2极化的影响及其机制

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞来源的外泌体(bone marrow mesenchymal stem cells derived exosomes,BMSCs-Exos)对脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞NR8383 M1/M2极化的影响及其潜在的机制。方法:分离SD大鼠骨髓间充质干细胞并制备BMSCs-Exos。分别用0.1、1 mg/mL BMSCs-Exos预处理NR8383细胞1 h,再用1μg/mL LPS诱导48 h,采用ELISA和蛋白免疫印迹分别检测细胞上清液中炎性因子含量以及细胞内极化标志物蛋白表达。将NR8383细胞单独培养或与BMSCs共培养,经20μmol/L外泌体抑制剂GW4869处理并予以1μg/mL LPS诱导48 h,采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分别检测细胞内miR-212-5p以及IL-4Rα和p-STAT6蛋白相对表达。生物信息学预测miR-212-5p与IL-4RαmRNA结合位点并通过荧光素酶实验验证。结果:成功制备BMSCs-Exos。ELISA和免疫印迹结果表明,1μg/mL LPS诱导48 h可促进NR8383细胞分泌炎性因子(TNF-α,IL-1β和IL-10)及M1极化,BMSCs-Exos预处理可明显降低LPS诱导的NR8383细胞培养上清液中炎性因子TNF-α和IL-1β含量,增加抗炎因子IL-10含量,同时抑制细胞M1极化并促进其M2极化,且1 mg/mL BMSCs-Exos明显强于0.1 mg/mL BMSCs-Exos。细胞共培养实验结果表明,1μg/mL LPS诱导48 h可增加NR8383细胞中miR-212-5p相对表达量以及IL-4Rα和p-STAT6蛋白表达,与BMSCs共培养可有效抑制LPS对上述指标的影响,但BMSCs的作用可被GW4869阻断。荧光素酶实验结果显示,miR-212-5p可与IL-4RαmRNA 3′UTR结合并促进其蛋白表达。结论:BMSCs-Exos可能通过miR-212-5p/IL-4Rα/STAT6通路抑制LPS诱导的急性肺损伤大鼠肺泡巨噬细胞NR8383的M1极化并促进其M2极化。