兔源肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏菌的分离鉴定及小鼠感染试验

为确定某规模化兔场仔兔呼吸道感染合并腹泻引起死亡的原因,无菌采集病兔气管、肺、肝组织进行病毒和细菌检测。通过细菌分离培养、革兰氏染色、生化鉴定、16S rRNA序列同源性比对分析,确定分离菌株种属。通过药物敏感性试验、耐药基因检测及动物回归对分离菌株的耐药性和致病性进行分析。结果显示,病毒检测结果均为阴性;从同一只仔兔的肺脏、气管中分离得到2株肺炎克雷伯氏菌,分别将其命名为KF1、KQ2,从肝脏中分离得到1株大肠埃希氏菌并将其命名为EG3。药敏试验结果显示,菌株KF1、KQ2和EG3均对黏菌素和氨苄青霉素钠耐药,对阿米卡星和氟苯尼考敏感。3株菌均检出耐药基因mcr-1和bla TEM。动物致病性试验显示,KF1组小鼠5 h后死亡50%,24 h全部死亡;混合组小鼠12 h后全部死亡;KQ2和EG3组48 h全部死亡。以上研究表明,大肠埃希氏菌和肺炎克雷伯氏菌的混合感染是引起仔兔死亡的主要原因,3株分离株单独及混合感染均能引起试验小鼠死亡。

3种乳酸菌的分离鉴定及其对奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌的抑菌特性

为获得对奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌具有良好抑菌活性的乳酸菌(LAB),本试验从山东省某大型奶牛养殖场采集饲料、垫料、奶杯内衬样本各6份,以及口腔、粪便、蹄部、乳头皮肤、乳头孔、鼻腔拭子样本各12份。利用MRS琼脂培养基进行细菌分离培养,通过形态学观察和16S rRNA基因测序鉴定分离菌株种属,采用牛津杯法筛选对奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌抑菌效果较好的LAB,分析LAB发挥抑菌作用的相关物质(有机酸、细菌素和过氧化氢),建立生长曲线,检测其对抗生素的敏感性。结果显示,从90份样本中共分离得到93株LAB,分别为魏斯氏菌属58株、明串珠菌属11株、乳杆菌属17株和乳球菌属7株;抑菌试验结果显示,3株LAB对肺炎克雷伯菌具有较好的抑菌特性(抑菌圈直径>17 mm),分别为食窦魏斯氏菌SDS2.1(抑菌圈直径17.1 mm±1.2 mm),植物乳植杆菌SDN1.2(抑菌圈直径19.73 mm±0.93 mm)和弯曲广布乳杆菌SDN6.1(抑菌圈直径19.53 mm±0.15 mm);3株LAB在0~2 h处于迟滞期,食窦魏斯氏菌SDS2.1和弯曲广布乳杆菌SDN6.1在4~8 h处于对数生长期,12 h后进入平台期;植物乳植杆菌SDN1.2在4~10 h处于对数生长期,14 h后进入平台期。3株LAB的主要抑菌物质均为有机酸,对青霉素、氨苄西林和羧苄西林等13种常见抗生素敏感。结果表明,本试验分离得到的3株LAB对奶牛乳房炎源性肺炎克雷伯菌具有较好的抑菌活性,可作为防治肺炎克雷伯菌性奶牛乳房炎的候选菌株。

大黄素调节SIRT1/AMPK信号通路对肺炎克雷伯菌致重症肺炎大鼠细胞自噬和凋亡的影响

目的:探讨大黄素对肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)致重症肺炎(KP)大鼠细胞自噬和凋亡的影响及可能的机制。方法:通过感染K.pneu‐moniae建立KP大鼠模型并用大黄素处理。将大鼠分为假手术组、KP组、低浓度大黄素组(20mg/kg)、中浓度大黄素组(40 mg/kg)、高浓度大黄素组(80mg/kg)、大黄素+sirtinol[沉默信息调节因子(SIRT1)活性抑制剂]组(80 mg/kg大黄素+30μL/kg sirtinol);血气分析仪检测动脉血二氧化碳分压(PaCO_(2))、动脉氧分压(PaO_(2))、动脉血氧饱和度(SaO_(2));瑞氏-吉姆萨染色(Wright-Giemsa)测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞和中性粒细胞计数;HE染色检测各组肺组织病理变化;ELISA检测各组肺组织中IL-6、TNF-α、IL-1β表达;电镜扫描观察各组肺组织中细胞自噬情况;免疫荧光染色观察LC3B在肺组织中的表达情况;TUNEL法检测各组大鼠肺组织细胞凋亡变化;Westernblot检测肺组织中SIRT1、腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)、LC3-II、LC3-I、c-caspase-3、caspase-3蛋白表达。结果:K.pneumoniae诱导的肺炎大鼠肺组织呈现严重损伤,肺部炎性浸润和炎性细胞因子释放增加,动脉血中PaO_(2)和SaO_(2)水平降低,PaCO_(2)水平升高,BALF中白细胞和中性粒细胞计数升高,细胞凋亡率和c-caspase-3/caspase-3水平增加,细胞自噬以及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平降低(均P<0.05)。大黄素处理后激活SIRT1/AMPK信号通路,升高动脉血中PaO_(2)和SaO_(2)水平,降低Pa‐CO_(2)水平,抑制炎症反应,抑制肺组织细胞凋亡,恢复细胞自噬水平(均P<0.05),而使用SIRT1抑制剂sirtinol抑制SIRT1/AMPK信号通路后部分逆转了大黄素对KP大鼠的治疗作用(P<0.05)。结论:大黄素可能通过激活SIRT1/AMPK通路进而增强大鼠肺组织细胞自噬,抑制大鼠肺组织细胞凋亡,可能为KP提供潜在的治疗选择。

奶牛肺炎克雷伯菌性乳房炎的研究进展

乳房炎是制约世界乳业发展的主要奶牛疾病之一,通常由传染性或环境性病原菌感染所致。在引起奶牛乳房炎的所有细菌性病原体中,肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)感染造成的牛奶损失比较大,患牛临床症状也比较严重。本文通过对奶牛肺炎克雷伯菌性乳房炎的临床症状、病原学、流行病学、致病机制、预防措施和治疗方法等进行综述,为现代奶牛场肺炎克雷伯菌性乳房炎的防控提供理论依据和实践经验,促进乳业健康发展。

林麝源肺炎克雷伯菌耐药性及毒力基因分析

[目的]对广东地区某规模化林麝养殖场易导致成年林麝肺炎等疾病的肺炎克雷伯菌进行耐药性及毒力基因分析,为有效防控由肺炎克雷伯菌引发的疾病提供参考依据。[方法]采集广东某林麝场成年林麝粪便共81份,采用细菌分离培养、形态学观察、生化分析和PCR扩增16S rRNA和溶血酵素基因的方法分离纯化肺炎克雷伯菌。通过血清型鉴定、药敏试验和PCR扩增耐药基因和毒力基因等方法研究分离菌株特性。[结果]分离菌在麦康凯平板上形成粉红色、光滑、湿润的单菌落;革兰染色镜检显示,菌体呈红色的短杆状,可判断为革兰阴性杆菌。通过生化试验选取与肺炎克雷伯菌生化特性一致的菌株进行PCR扩增。16S rRNA基因PCR扩增结果显示,获得大小约为1 542 bp的条带。共33株分离株与GenBank数据库肺炎克雷伯菌16S rRNA基因核苷酸序列相似性>98%,且特异性基因khe检测为阳性,即本研究从81份样品中成功分离鉴定出33株肺炎克雷伯菌。血清型检测结果显示,分离株中优势血清型是K57。药敏试验结果显示,分离株对青霉素类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、氯霉素类、喹诺酮类、单环β-内酰胺类药物均有不同程度的耐药性;对头孢菌素类和碳青霉烯类药物敏感。检测的12种耐药基因中,bla_(SHV)和oqxA基因检出率均为96.97%;aac(6′)-Ⅰb-cr、rmtB、tetA、tetM、sul1、sul2、oqxB和floR基因检出率分别为57.58%、51.52%、78.79%、84.85%、72.73%、66.67%、87.88%和51.52%;未检测出bla_(KPC)和bla_(NDM)基因。检测的9种毒力基因中,wabG、uge、mrkD、entB和ureA基因检出率较高,分别为90.91%、96.97%、96.97%、100%和100%;aerobactin和allS基因检出率较低,分别为6.06%和18.18%;未检出ybtA基因。[结论]本研究成功分离鉴定出33株林麝源肺炎克雷伯菌,优势血清型是K57,存在多重耐药情况,耐药基因和毒力基因携带率高。本研究结果可为林麝源肺炎克雷伯菌所致疾病的防控提供数据支持。

羊源肺炎克雷伯菌分离鉴定及其外膜囊泡提取方法的建立

旨在探究羊源肺炎克雷伯菌的致病性及其外膜囊泡的提取方法。本研究对伴有咳嗽、腹泻症状死亡的绵羊剖检并采集肺,肝,空肠等病变器官,采用形态观察、生化特性鉴定,分子生物学鉴定及测序方法对病原菌进行分离鉴定;通过药敏试验、拉丝试验、毒力基因检测、致病性试验及病理组织学观察分析其致病性和耐药性;使用改良沉淀法提取其外膜囊泡,通过透射电镜,纳米粒径测定及SDS-PAGE进行鉴定。结果显示病原菌经分离纯化后镜下呈现卵圆形革兰阴性杆菌,结合生化试验及16S rRNA鉴定结果表明该病原菌为肺炎克雷伯菌;药敏试验结果显示病原菌对阿米卡星,头孢他啶,亚胺培南,哌拉西林四种药物敏感;拉丝试验结果符合阳性特征及毒力基因扩增显示荚膜多糖基因wzy-K1及代谢基因peg-344为阳性,确定该病原菌为高毒力肺炎克雷伯菌;小鼠致病性试验结果表明病原菌对小鼠半数致死量(LD_(50))浓度为1.8×10^(5 )CFU,经病理组织学观察肝脏、脾脏淤血且有大量炎性细胞浸润;透射电镜,纳米粒径测定显示沉淀物形态结构、粒径大小均符合细菌外膜囊泡特征,SDS-PAGE显示存在特征性条带。本试验成功从病死绵羊体内分离出高毒力肺炎克雷伯菌并通过沉淀法提取其外膜囊泡,为预防和治疗羊源肺炎克雷伯菌病提供参考及肺炎克雷伯菌外膜囊泡的基础研究提供帮助。

基于不同ST型肺炎克雷伯菌感染的小鼠乳腺炎模型的差异分析

[目的]肺炎克雷伯菌感染是奶牛乳腺炎的常见病因,其诱导的临床型乳腺炎发病急、临床症状重,牛奶产量和质量降低,给奶牛场造成巨大的经济损失。本研究旨在探究奶牛乳腺炎源性不同序列型(sequence type, ST)肺炎克雷伯菌的毒力作用,筛选肺炎克雷伯菌发挥感染作用的潜在关键毒力基因。[方法]采用多位点序列分型(multi-locus sequence typing, MLST)分析山东、湖北2个大型奶牛场的129株临床乳腺炎源性肺炎克雷伯菌的ST型分布,并选择3种检出率较高的ST型肺炎克雷伯菌感染小鼠建立乳腺炎模型,探究小鼠乳腺的形态学损伤及炎性因子表达变化。通过分析肺炎克雷伯菌的感染特性与毒力基因分布,筛选与肺炎克雷伯菌感染相关的关键毒力基因。[结果]129株肺炎克雷伯菌共分为79种ST型,其中ST107占比最高,为19.37%;其次为ST2324(7.75%)和ST13(3.87%)。与ST107和ST13型相比,感染后24 h, ST2324型肺炎克雷伯菌诱导小鼠临床评分和乳腺载菌量均显著升高(P<0.05);乳腺内腺泡轮廓消失和大量炎性细胞浸润,乳腺中白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和细胞色素C(Cyt C)mRNA表达量均显著升高(P<0.05)。毒力基因检测结果显示,3种不同ST型分离株共检测到74个毒力基因,其中ST2324型分离株中检出了ST13和ST107型分离株没有检出的毒力基因manB、pla和pilW。[结论]本研究从129株肺炎克雷伯菌中共检出79种ST型,其中ST2324、ST107和ST13检出率较高,ST2324型肺炎克雷伯菌对小鼠致病性最强,且携带的毒力基因manB、pla和pilW与肺炎克雷伯菌的高致病性密切相关。本研究结果为进一步解析肺炎克雷伯菌感染奶牛乳腺炎的机制提供了理论参考。

头孢他啶 阿维巴坦治疗终末期肾脏病患者合并耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌所致肺炎1例

感染是慢性肾脏病患者主要并发症之一,更是其主要死亡原因[1-2]。肺炎克雷伯菌作为终末期肾脏病患者合并肺炎的主要致病菌之一,其耐药性逐年增强[3]。2019年上市的头孢他啶阿维巴坦(ceftazidime-avibactam,CAZ-AVI)对于治疗耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(Carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)所致肺炎的效果较好[4]。然而CRKP所致肺炎合并终末期肾脏病时,由于终末期肾脏病导致免疫力低下[1]、肾脏代谢功能障碍和需长期透析等,这些因素均会对药代动力学产生影响[5]。

高毒力肺炎克雷伯菌致侵袭性肺炎克雷伯菌肝脓肿综合征1例

肺炎克雷伯菌为定植于人体呼吸道、胃肠道黏膜的条件致病菌,可导致血流、呼吸系统、泌尿生殖系统感染的发生。高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae,hvKP)因表达铁载体、荚膜多糖等毒力因子而呈现强致病性,能引起患者不同远端部位的侵袭性感染,易导致脓毒血症、感染性休克、多器官功能障碍,致残率、病死率高,严重威胁全球公共卫生安全。回顾性分析hvKP感染患者的临床资料有助于了解其致病特征及诊治相关感染。通过PCR等技术研究hvKP分离株的遗传学背景,对预防和控制hvKP的传播与流行具有重大意义。该文报道了1例糖尿病患者因感染hvKP而出现不同远隔部位感染,并分析了hvKP菌株的分子生物学特点,以期为临床预防和诊疗hvKP感染提供参考依据。

产NDM-1和产KPC-2耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌临床及分子流行病学特征比较

目的比较产NDM-1和产KPC-2耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)的临床及分子流行病学特征。方法回顾性分析2017—2020年某儿童医院非重复儿童住院患者临床分离的CRKP,查阅菌株来源患者的病历资料获得患者的基本临床特征。对CRKP进行药敏试验及多位点序列分型(MLST)分析,比较产NDM-1和产KPC-2的CRKP临床及分子流行病学特征。结果2017—2020年共收集164株CRKP菌株,其中96株携带bla NDM-1,68株携带bla KPC-2,产NDM-1的CRKP主要分布在新生儿科室,产KPC-2的CRKP以非新生儿科室居多,两组在标本来源、患者年龄、科室分布和预后情况方面比较,差异均有统计学意义(均P<0.05);产NDM-1的CRKP菌株以ST 17型和ST 278型为主,分别为40.63%、18.75%;而产KPC-2的CRKP菌株以ST 11为主,达73.53%。产KPC-2的CRKP分离株对头孢吡肟、氨曲南、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、呋喃妥因和磷霉素的耐药率均高于产NDM-1的CRKP分离株,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论产NDM-1和产KPC-2的CRKP菌株在临床及分子流行病学方面均存在差异,产KPC-2的CRKP菌株表现出更严重的耐药性,感染KPC-2 CRKP的患者预后较差,应引起临床和感控的重视。

产KPC肺炎克雷伯菌感染治疗的研究进展

近年来全国耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)分离率逐年上升,且由于其多重耐药、病死率高的特点,给临床治疗带来了严峻挑战。CRKP耐药最主要机制为产碳青霉烯酶,在CRKP中常见的碳青霉烯酶类型为Ambler A、B、D类,C类少见。碳青霉烯酶中最常见的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC),属于A类。产KPC肺炎克雷伯菌(KPC-KP)在全球范围内广泛扩散,临床有效治疗药物非常有限。本文就KPC-KP感染治疗的研究进展进行总结,以期为临床治疗提供借鉴意义。

mCIM联合eCIM试验检测产碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的临床应用

探讨mCIM联合eCIM在碳青霉烯类抗菌药物耐药的肺炎克雷伯菌耐药表型筛选中的应用,选择住院患者标本中分离的76株亚胺培南或厄他培南耐药的肺炎克雷伯菌,按照CLSI推荐的mCIM和eCIM方法试验,以PCR方法检测其碳青霉烯酶基因作为参考依据,评估mCIM联合eCIM试验对CRKP的筛选效能及不同底物的筛选水平。结果从76株CRKP中检测出73株阳性,与PCR方法检测碳青霉烯酶基因阳性结果一致。统计学分析mCIM与eCIM联合试验检测碳青霉烯酶的结果与PCR基因检测比较有高度一致性。因此,采用mCIM联合eCIM检测CRKP中的碳青霉烯酶表型,具有操作简单,成本较低,结果易于判读,与PCR基因检测结果具有高度一致性等特点,在临床微生物检验中具有广泛的应用前景,尤其适合在基层实验室中开展。

ICU患者和社区健康成人肠道内肺炎克雷伯菌的毒力基因及耐药性

目的探讨重症监护室(intensive care unit,ICU)患者和社区健康成人肠道内肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,KP)的检出情况并对其毒力基因和耐药性进行分析。方法收集2020年12月至2021年12月温州医科大学附属第三医院就诊的ICU患者和社区健康成人的粪便拭子或粪便标本,进一步筛选KP。采用拉丝试验鉴定高黏液(hypermucoviscosity,HM)表型;采用Vitek 2全自动微生物分析系统和K-B纸片扩散法进行药敏试验;采用PCR筛选超广谱β-内酰胺酶、碳青霉烯类耐药基因、9个毒力相关基因(allS、entB、fimH、iutA、kfu、magA、mrkD、rmpA、ybtS)和6个高毒力荚膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54和K57),并分析其多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)。采用SPSS 23.0软件对数据进行统计分析。结果共收集粪便拭子或粪便标本448份,其中ICU患者140份,健康成人308份;分离出KP 89株,其中ICU患者36株(25.7%),健康成人53株(17.2%),ICU患者检出率高于健康成人(χ^(2)=4.375,P<0.05)。ICU患者检出9株(25%)高黏液肺炎克雷伯菌(HMKP),健康成人检出19株(35.8%),两组间的检出率差异无统计学意义(χ^(2)=1.170,P>0.05)。HMKP和健康成人检出的KP除对氨苄西林天然耐药外,对常用的抗生素仍相当敏感。ICU患者KP对临床常用药物均有不同程度的耐药,除妥布霉素外,ICU患者对头孢菌素类、青霉素酶抑制剂类、碳青霉烯类、喹诺酮类、氨曲南、庆大霉素、阿米卡星、复方磺胺噁唑的耐药性均高于健康成人(P均<0.05):检出18株(50%)产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrumβ-lactamase,ESBL)KP,且均为非HM表型,有6株为耐碳青霉烯酶KP(carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)。5株CRKP携带KPC酶,均为ST11型;1株携带NDM酶,为ST1855型。共检出27株高毒力荚膜血清型(30.3%)阳性KP,以K1、K2、K57为主,未检出K5,ICU患者与健康成人9个毒力基因和5个高毒力荚膜血清型的检出率差异均无统计学意义(P均>0.05)。两组人群均检出高危ST分型。结论本地区健康成人肠道内检出高毒力高危型KP,增加了从社区转移至医院感染的危险性,且在ICU患者肠道内检出耐碳青霉烯酶ST11型,应高度警惕耐药质粒的传播。

建立一种适合本实验室快速检测产KPC酶肺炎克雷伯菌的方法

目的运用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)检测产肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP),筛选并验证其特征峰,建立一种适用于本实验室快速检测产KPC酶型CRKP的方法。方法收集临床耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌39株,运用PCR方法检测出其中23株产KPC酶,再采用MALDI-TOF MS技术检测KPC酶阳性CRKP菌株,得到质谱图后用Flex Analyst软件分析筛选出其中特征峰,并进行重复性实验和临床验证评估。结果综合筛选出产KPC酶CRKP最佳特征峰为m/z 6432,特征峰验证实验和重复性实验的特异性和敏感性分别为96.67%和100%。临床验证评估特异性和敏感性分别为92.31%和100%。结论利用MALDI-TOF MS技术可检出产KPC酶CRKP的最佳特征峰为m/z 6432,经实验证实该特征峰特异性和敏感性高,可为临床快速诊断和治疗产KPC酶CRKP提供理论基础。

噬菌体PCCM_KpP1172的鉴定及其对大蜡螟幼虫碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌感染的疗效评估

背景碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌感染发生率逐年增加,临床治疗困难,死亡率高。使用具有高裂解能力的噬菌体治疗细菌感染是颇具前景的治疗方法。目的针对碳青霉烯耐药高毒力肺炎克雷伯菌分离一株新型裂解性T7噬菌体,对该分离株进行生物学特性测定和基因组学测序分析,为临床开展噬菌体治疗提供可应用的噬菌体资源。方法从肺部感染患者的痰液中分离出肺炎克雷伯菌,通过细菌鉴定、药敏分析、全基因组测序和PCR检测验证菌株的毒力基因与耐药基因,以此株肺炎克雷伯菌为宿主菌,在污水中分离出一株裂解性噬菌体,命名为PCCM_KpP1172。测定该噬菌体生物学特性,分析其基因组序列,并通过大蜡螟幼虫感染模型检测该噬菌体的治疗效果。结果该株肺炎克雷伯菌基因组分析存在耐药基因与毒力基因rmpA2、rmpA、iroN、icu。以此菌株为宿主菌分离到新型肺炎克雷伯菌噬菌体,命名为PCCM_KpP1172,在宿主菌菌苔上可形成完全透明的噬菌斑并伴晕圈;透射电镜下呈现有尾噬菌体目短尾病毒科病毒的典型形态特征;一步生长曲线显示其潜伏期为15 min,最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI)为0.0001,对ST11KL64型肺炎克雷伯菌有广泛裂解范围。基因组分析显示,该噬菌体为双链DNA(总长度为40222 bp),G+C含量为53%,基因组包含49个开放阅读框(open reading frames,ORF),无毒力或抗生素耐药性相关基因。基于系统发育分析,该噬菌体可归属于有尾噬菌体目Studiervirinae亚科Przondovirus属的一个新种。此外,噬菌体PCCM_KpP1172可在体外3 h内有效抑制碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌的生长,并能提高宿主菌感染的大蜡螟幼虫存活率(P<0.01)。结论本研究针对碳青霉烯耐药的高毒力肺炎克雷伯菌分离并鉴定了一株新的T7噬菌体PCCM_KpP1172,具有高裂解力,无耐药基因和毒力基因,对大蜡螟幼虫感染模型具有良好治疗效果。

肺炎克雷伯菌噬菌体的分离鉴定及vB_KpnS_Yuri1的生物学特性研究

分离并鉴定肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体,分析所分离肺炎克雷伯菌噬菌体的生物学特性。以肺炎克雷伯菌ATCC700603标准株作为宿主菌,从甘肃、宁夏、青海、四川等地多个养殖场污水中分离裂解性肺炎克雷伯菌噬菌体;分析肺炎克雷伯菌噬菌体Yuri1的生物学特性,用透射电子显微镜观察其形态;通过酶切分析核酸类型;采用双层平板法测定最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH稳定性及紫外线敏感性;通过点滴试验测定裂解谱;采用平板计数法评价噬菌体体外抗菌活性;基于全基因组测序分析其安全性。结果显示,共分离裂解性噬菌体6株,其中KlebsiellaphagevB_KpnS_Yuri1属有尾目长尾噬菌体,核酸类型为双链DNA,最佳感染复数为0.0001;一步生长曲线显示,KlebsiellaphagevB_KpnS_Yuri1的潜伏期为15min,裂解期为15min;在-20℃~60℃或pH值为5.0~10.0时,KlebsiellaphagevB_KpnS_Yuri1仍具有较高的滴度,且呈现紫外线耐受;点滴试验表明,KlebsiellaphagevB_KpnS_Yuri1对68株奶牛乳腺炎肺炎克雷伯菌中的7株具有裂解活性,而对粪肠球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均无裂解活性;在LB肉汤培养基和牛奶介质中,噬菌体在2h内的杀菌率均达到99.99%;基于全基因组分析,KlebsiellaphagevB_KpnS_Yuri1基因组全长50116bp,共有77个开放阅读框,未发现与耐药、毒力及溶原相关基因。分离的肺炎克雷伯菌噬菌体KlebsiellaphagevB_KpnS_Yuri1最佳感染复数低、潜伏期短,最适温度和pH范围广且耐受紫外线,体外抗菌活性强,在基因水平上具有安全性,可为进一步研究噬菌体鸡尾酒疗法及裂解酶治疗肺炎克雷伯菌引发的奶牛乳腺炎提供理论依据和技术支撑。

ST11肺炎克雷伯菌QL5株携带的质粒pQL5-NDM-KPC的研究

目的探讨肺炎克雷伯菌QL5株携带编码碳青霉烯酶基因的质粒及其特性。方法基于二代Illumina和三代Nanopore测序技术平台获得菌株的基因组和质粒序列,然后用一系列软件分析菌株的生物学信息。S1核酸酶切脉冲场凝胶电泳、质粒液相接合试验和稳定性试验检测菌株携带的质粒特性。结果生信分析显示:肺炎克雷伯菌QL5株携带的bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒上(命名为pQL5-NDM-KPC);QL5株携带的pQL5-NDM-KPC可发生bla_(NDM-1)基因所在区域的片段丢失。结论经检索,携带bla_(NDM-1)和bla_(KPC-2)基因位于同一个IncC/IncFII(PHN7A8)/IncR杂合质粒pQL5-NDM-KPC(GenBank序列号:OR253888)上,为国内外首次报道。

1株肺炎克雷伯菌噬菌体kp6的生物学特性及全基因组分析

【目的】探究从污水样品中分离到的1株肺炎克雷伯菌噬菌体的生物学特性及全基因组特征,为临床肺炎克雷伯菌感染的防控和开发噬菌体相关新型替抗产品提供基础。【方法】以肺炎克雷伯菌TJAU-K11为宿主菌,采用双层平板法从污水样品中分离纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌体。通过透射电镜观察噬菌体形态,测定噬菌体宿主谱、最佳感染复数(MOI)、一步生长曲线,评估噬菌体稳定性,探究其对肺炎克雷伯菌TJAU-K11的生物被膜形成的影响以及裂解效果,同时进行全基因组测序,了解噬菌体的生物学特性及全基因组特征。【结果】从污水样品中成功分离获得3株肺炎克雷伯菌噬菌体,分别命名为kp4、kp5和kp6,透射电镜观察结果显示,噬菌体kp6是具有正二十面体形态的短尾噬菌体。一步生长曲线结果显示,噬菌体kp6的潜伏期为20 min,爆发期为30 min。该噬菌体在―20~50℃、pH 4.0~10.0和紫外照射12 min内噬菌体效价保持稳定。单一噬菌体的体外抑菌试验结果显示,不同MOI噬菌体kp6组的D 600 nm值在7 h内始终<0.4;噬菌体鸡尾酒制剂的体外抑菌试验结果显示,MOI为1、100时,噬菌体kp6在12 h内的D 600 nm值<0.1。不同MOI噬菌体kp6组宿主菌生物被膜形成量均极显著低于阳性对照组(P<0.01),单一噬菌体kp6与噬菌体鸡尾酒制剂均能裂解宿主菌生物被膜。全基因组测序表明噬菌体kp6基因组为双链环状DNA,全长40971 bp,GC含量为53.13%,49个编码序列中有23个编码已知功能的蛋白,其中包括短尾噬菌体吸附和注入作用的尾纤蛋白gp12、裂解功能蛋白内溶酶等。【结论】本研究分离获得的肺炎克雷伯菌裂解性噬菌体kp6,其基因组中存在1个内溶酶,以其制备的噬菌体鸡尾酒制剂在12 h内能完全抑制宿主菌生长,试验结果为后续裂解酶和噬菌体制剂的开发奠定基础。

重症医学科产KPC-2肺炎克雷伯菌的耐药情况分析及同源性研究

目的 探究重症医学科产碳青霉烯酶-2(Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase,KPC-2)肺炎克雷伯菌的耐药状况并分析其同源性情况。方法 回顾性选取2020年10月—2022年9月睢宁县人民医院收治的46例重症医学科患者的临床资料,从中提取46株耐青霉烯类肺炎克雷伯菌菌株,进行药敏性试验、mCIM及eCIM联合试验,并采用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增法检测待测菌的耐药基因,实施序列检测,使用脉冲场凝胶电泳(Pulsed field Gel Electrophoresis,PFGE)实施同源性分析。结果 待测菌对替加环素、复方新诺明、阿米卡星、妥布霉素及庆大霉素有敏感性;mCIM及eCIM试验结果显示46株耐青霉烯类肺炎克雷伯菌均产丝氨酸碳青霉烯酶;待测菌株携带肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因阳性率达100.00%。结论 产丝氨酸碳青霉烯酶是造成ICU分离耐青霉烯类肺炎克雷伯菌的耐药机制,酶基因为KPC-2型,且本院重症医学科存在耐青霉烯类肺炎克雷伯的克隆传播。

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌致血流感染风险预测模型的构建

目的构建碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)致血流感染(BSI)风险预测模型。方法回顾性分析秦皇岛市第一医院2019年1月-2022年6月253例肺炎克雷伯菌致BSI患者的临床资料,将2019年1月-2021年12月收治的患者(223例)作为模型组,2022年1-6月收治的患者(30例)作为验证组。根据是否检出CRKP将模型组患者分为CRKP亚组(56例)和碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(CSKP)亚组(167例),对两亚组患者性别、年龄、合并基础疾病等基本信息进行单因素分析和多因素Logistic分析,筛选CRKP致BSI的独立危险因素并构建风险预测模型;以验证组患者为对象,对所建模型进行验证。结果患者入住重症监护病房(ICU)、使用免疫抑制剂和经验性抗感染治疗中使用碳青霉烯类抗菌药物、抗革兰氏阳性球菌药物是CRKP致BSI的独立危险因素(比值比分别为3.749、3.074、2.909、9.419,95%置信区间分别为1.639~8.572、1.292~7.312、1.180~7.717、2.877~30.840,P<0.05);所建风险预测模型的P值为0.365,模型受试者工作特征曲线的曲线下面积(AUC)为0.848(95%置信区间为0.779~0.916,P<0.001),分值临界值为6.5。用于验证组患者时,模型预测的总体准确率为86.67%,其生存曲线的AUC为0.926(95%置信区间为0.809~1.000,P<0.001)。结论患者入住ICU、使用免疫抑制剂和经验性抗感染治疗中使用碳青霉烯类抗菌药物、抗革兰氏阳性球菌药物是CRKP致BSI的独立危险因素;基于上述因素所建的CRKP致BSI风险预测模型的预测准确性良好。