9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量检测方法的建立

目的建立测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量的检测方法。方法对9V型肺炎球菌多糖溶液进行不同浓度的脱氧胆酸钠(NaDOC)酸沉处理,选择仅沉淀结合物而不沉淀多糖的最佳处理条件,筛选出所能沉淀蛋白的最大浓度;对建立的方法进行准确度、精密度、专属性及线性验证。结果 9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液的最佳NaDOC酸沉处理条件为2%NaDOC-0. 05 mol/L HCl;蛋白浓度低于200μg/m L时,NaDOC酸沉处理条件沉淀蛋白的效果最佳。准确度试验的回收率在90%～99%之间;实验内及实验间均具有良好的精密度(CV均小于10%);在10～100μg/mL范围内采用蒽酮硫酸法测定糖浓度的曲线,线性良好,r^2> 0. 998;NaDOC的终浓度在0. 25%以下,对蒽酮硫酸法检测无干扰。结论 NaDOC酸沉淀法能很好地分离结合物原液中的结合物与游离多糖,具有良好的重复性和准确性,可用于测定9V型肺炎球菌多糖蛋白结合物原液中的游离多糖含量。

6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物中游离多糖测定方法的建立

目的:建立6B型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合物(PS6B-TT)中游离多糖的测定方法,并对方法进行验证。方法:采用脱氧胆酸钠-盐酸沉淀法(NaDC/HCl),取不同浓度的载体蛋白破伤风类毒素(TT),加入1%NaDC溶液混匀,离心后用Lowrry法检测上清中蛋白含量,以确定载体蛋白沉淀范围;用不同离子强度的氯化钠溶液稀释游离多糖对照品与TT的混合物,NaDC沉淀并离心后以蒽酮-硫酸法测定上清中多糖含量、计算回收率,确定游离多糖的最佳分离条件;以NaDC/HCl沉淀6B型多糖测定标准品并绘制标准曲线,与未经NaDC/HCl沉淀的标准品相比较,确定NaDC对蒽酮硫酸法测定结果的影响;由此建立NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法测定6B型结合物中游离多糖含量的方法,并对方法的专属性、准确度及精密度进行验证。结果:此方法沉淀载体蛋白浓度应控制在500μg·mL^(-1)以下;选择终浓度0.3 mol·L-1氯化钠溶液作为6B型肺炎球菌结合物中游离多糖测定的稀释液;NaDC/HCl沉淀法对蒽酮硫酸法测定多糖含量基本无影响;游离多糖对照品与载体蛋白TT混合物经建立的NaDC/HCl法沉淀后多糖及蛋白回收率分别为98.25%及0;游离糖添加试验回收率均在90%~100%;3批结合物游离糖含量测定值其试验内及试验间CV值均在10%以下。结论:本试验建立的NaDC/HCl沉淀法结合蒽酮硫酸法可有效分离6B型游离多糖与多糖蛋白结合物,并能够准确、稳定地测定结合物中的游离多糖含量。