基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体TaqMan检测方法的建立及其遗传演化分析

热休克蛋白70 (heat shock protein 70,Hsp70)是绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae, Movi)的重要膜蛋白,是机体内高度保守的生物分子,但在种间差异大,可作为分子生物学检测的候选靶区。为建立基于Hsp70基因的Movi通用型TaqMan实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,并进一步了解其遗传变异情况,本研究基于GenBank中Movi的Hsp70基因特征,设计特异性的引物及探针,建立了基于Hsp70基因的绵羊肺炎支原体qPCR检测方法。应用建立的检测方法对88份山羊鼻拭子样品及43份疑似羊支原体性肺炎(Mycoplasmal pneumonia of sheep and goats, MPSG)病料进行检测。将检测结果为Movi阳性的肺组织样品进行分离鉴定,并对分离株Hsp70基因进行序列分析。结果显示,建立的qPCR检测方法其相关系数为1.00,扩增效率为96.0%,斜率为-3.411,Y轴截距为37.29。特异性强,与丝状支原体山羊亚种(Mycoplasma mycoides subsp.capri, Mmc)、山羊支原体山羊肺炎亚种(Mycoplasma capricolum subsp.capripneumoniae, Mccp)、莱氏无胆甾原体(Acholeplasmalaidlawii, AL)、无乳支原体(Mycoplasma agalactiae, Maga)、伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis, CP)、羊口疮病毒(orf virus, ORFV)、牛支原体(Mycoplasma bovis, Mb)等牛羊常见病原均无交叉反应;敏感性高,最低检测限为5.72 copies·μL^(-1);重复性优,组内变异系数和组间变异系数均小于1.00%。6株Movi分离株Hsp70基因全长均为1 818 bp,与其它Movi参考株核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%~99.4%和98.0%~100.0%;进一步分析发现,山羊源Movi均比绵羊源多1个N-糖基化位点。遗传演化分析表明,其均处于ClusterⅠA亚分支(均为山羊源)。综上,本研究建立了特异性强、敏感性高、重复性优的基于Hsp70基因的Movi的qPCR检测方法。序列分析发现,不同来源Movi的Hsp70基因核苷酸同源性高;遗传演化分析证实,Movi福建株与山羊源分离株遗传关系较近。本研究不仅为Movi临床诊断提供了技术支持,更为进一步了解Movi遗传演化规律提供参考。

绵羊肺炎支原体GH3-3株全基因组测序及生物信息学分析

【目的】全面了解绵羊肺炎支原体GH3-3株的基因序列,研究其潜在的致病机制及其复制、转录、翻译过程的调控机制。【方法】采用体外培养,利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组DNA,进行全基因组测序。【结果】绵羊肺炎支原体GH3-3株基因组大小为1060772 bp,GC含量为29.66%,基因组组分分析后发现,GH3-3株的基因组含有730个编码基因,总长度为914379 bp,平均长度为1252.57 bp,占基因组全长的86.2%。串联重复序列共149个,总长为20926 bp,占基因组全长的1.97%。微卫星DNA序列102个,tRNA 30个,rRNA 3个。在NR、SwissProt、GOG、KEGG、GO、CARD、CAZy、PHI、TCDB、RMS数据库中,分别有719、459、473、394、449、33、5、180、113、59个基因被注释;在VFDB数据库中,共注释到了76个毒力因子相关的基因。将基因组序列提交至NCBI网站,获得登录号为:PRJNA1051969。【结论】获得了绵羊肺炎支原体GH3-3株完整的基因组信息,预测和注释了其基因的功能,明确了GH3-3株以及与国内外其他绵羊肺炎支原体菌株之间的遗传进化关系。

绵羊肺炎支原体核糖体蛋白30S rpsE基因的原核表达及多克隆抗体的制备

旨在了解绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)30S rpsE蛋白的生物学特性及其蛋白免疫原性。用在线分析软件预测30S rpsE蛋白的理化性质、B细胞抗原表位、糖基化位点、二级结构及三级结构等;采用PCR方法从病羊鼻拭子样品中扩增得到30S rpsE基因片段,经NdeⅠ、XhoⅠ酶切纯化后,将其连接到pET-42b载体上,构建原核表达载体pET-42b-30S rpsE,使用不同浓度IPTG诱导蛋白在大肠杆菌BL21中表达;重组蛋白通过SDS-PAGE和Western blot进行鉴定,用镍层析法纯化蛋白后,与弗氏佐剂1∶1混合注射免疫家兔,然后采取全血,检测血清抗体效价及特异性。结果:经预测30S rpsE蛋白是亲水无信号肽的膜外蛋白,无跨膜结构域,有一个糖基化位点;成功构建了原核表达载体pET-42b-30S rpsE,表达的重组蛋白分子量约为25.9 ku,以包涵体和可溶性的形式存在;免疫家兔后血清抗体效价为1∶25 600,证实30S rpsE蛋白具有较好的免疫原性。

郑州地区2832例肺炎支原体感染患儿耐药基因突变检测结果分析

分析郑州地区2832例肺炎支原体感染患儿耐药基因突变检测结果。方法 选取本院2023年9月期间收治的肺炎支原体感染患儿2832例,均进行肺炎支原体抗体半定量、肺炎支原体血清学试验、肺炎支原体-DNA检测、肺炎支原体耐药位点检测,并收集数据统计分析。结果 2823例肺炎支原体感染患儿肺炎支原体抗体半定量检测结果56.50%为<1:40,其次是1:40占比36.83%,1:80占比26.59%,3岁以上的患儿肺炎支原体血清学试验阳性率最高,占比15.16%,肺炎支原体血清学试验的阳性率随着儿童年龄段的增长而增高,2832例患儿肺炎支原体-DNA检测以及肺炎支原体耐药位点检测阳性有1149例,占比40.57%,肺炎支原体-DNA检测阳性,而肺炎支原体耐药位点检测阴性仅有127例占比4.48%,两项均为阴性例数1556例,占比54.94%。结论 郑州地区2832例肺炎支原体感染患儿1149例出现耐药基因突变,肺炎支原体血清学试验随患儿年龄增加阳性率增加。

小儿支原体肺炎肺泡灌洗液病原体基因拷贝数和临床表型的关系

肺炎支原体已成为儿童社区获得性肺炎十分重要的病原,近年来重症肺炎支原体肺炎（MPP）及难治MPP报道日益增多,多合并胸腔积液、肺实变、肺不张甚至肺坏死等肺部严重病变,可遗留支气管扩张、闭塞性支气管炎、单侧透明肺等肺部后遗症。

基于多交叉置换扩增和纳米生物传感技术快速检测肺炎支原体方法的建立

目的建立一种简单、灵敏、快速的肺炎支原体(MP)检测方法,并对其应用性进行验证和评价。方法利用多交叉置换扩增(MCDA)技术对肺炎支原体特异基因CARDS毒素基因进行扩增,利用侧流免疫层析生物传感(LFB)技术读取扩增结果,命名该方法为MP-MCDA-LFB。分析扩增反应在60~67℃(间隔1℃)的扩增效率,筛选最适反应温度;分析分别扩增10、20、30、40 min时能够检测到的最低核酸浓度,筛选最佳反应时间。利用10倍系列稀释的肺炎支原体核酸分析MP-MCDA-LFB方法的灵敏度和检测限,利用35株非肺炎支原体菌株分析MP-MCDA-LFB方法的特异性。利用MP-MCDA-LFB方法检测80份疑似MP感染的临床样本,并与RT-PCR法检测结果进行比较,分析MP-MCDA-LFB方法的临床应用性。结果MP-MCDA-LFB能够实现对肺炎支原体CARDS毒素基因的快速检测。其最佳反应温度为63℃,最短反应时间为40 min,整个检测过程可在1 h内。MP-MCDA-LFB方法具有较高的灵敏度和特异性,其检测限低至45 ng/L,与其他临床表现相似的病原体无交叉反应,特异性为100%。MP-MCDA-LFB方法从80份临床样本中检出45份阳性样本(56.3%),检出率与RT-PCR方法一致。结论本研究建立的以CARDS毒素基因为靶标的MP-MCDA-LFB检测方法具有简单、快速、灵敏度高、特异性强的优点,在基层医疗机构和现场检测具有较好的应用潜力。

珠海地区儿童急性下呼吸道肺炎支原体感染流行病学及肺炎支原体耐药基因检测的多中心调查与研究

目的调查珠海地区儿童急性下呼吸道感染中肺炎支原体(MP)感染现状及大环内酯类耐药基因检出率,评价阿奇霉素在MP感染中的临床治疗效果。方法选取2021年3月至2022年2月珠海市妇幼保健院、珠海市人民医院、中山大学附属第五医院、珠海市中西医结合医院、遵义医科大学第五附属医院、广东省人民医院珠海医院、广东省中医院珠海医院、珠海市第五人民医院、珠海市高新区人民医院9家医院儿科门诊或住院的急性支气管炎、社区获得性肺炎患儿1178例,分析不同性别、年龄、季节及温湿度条件下MP感染情况。难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)病例进行MP耐药基因检测。结果1178例患儿中MP感染率为24.1%(284/1178),MP感染率以10月份最高。19份耐药基因检测中94.7%(18/19)存在耐药基因位点突变。婴儿组、幼儿组、学龄前组、学龄组患儿的MP-IgM阳性率分别为6.90%、21.89%、31.95%、59.21%;男性、女性阳性率分别为19.09%、30.98%;春、夏、秋、冬四季阳性率分别为20.33%、25.33%、29.31%和21.53%;患儿年龄、性别、季节差异均有统计学意义(P<0.05)。MP感染率与月平均气温、月相对湿度均呈正相关(P<0.05)。经阿奇霉素口服或静脉注射治疗后284例MP感染患儿的治疗有效率为87.0%(247/284),平均住院时间为(6.90±0.87)d,肺部并发症发生率为2.8%(8/284)。结论调查期间珠海地区儿童MP感染率较低,秋季为感染高峰期,性别、年龄、气温、湿度等因素跟儿童MP感染有关。MP耐药基因检出率较高,但临床选用阿奇霉素口服或静脉注射进行抗感染治疗效果尚佳。

难治性支原体肺炎MP-DNA拷贝数与激素疗效的关联研究

目的探讨难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)患儿支气管肺泡灌洗液(BALF)中肺炎支原体基因(MP-DNA)拷贝数与甲泼尼龙常规剂量疗效的关系,以期为早期识别常规剂量甲泼尼龙治疗无效的病例提供依据。方法选取2018年1月至2019年12月于西安市儿童医院呼吸一科住院治疗的72例RMPP患儿为研究对象,对其临床资料进行回顾性分析。甲泼尼龙1~2mg·kg^(-1)·d^(-1)为常规剂量组,该剂量不能控制体温或者初始量即为4 mg·kg^(-1)·d^(-1)定义为高剂量组。MP-DNA拷贝数<1.0×10^(7)/mL为中低拷贝组,≥1.0×10^(7)/mL为高拷贝组。结果72例患儿的BALF中,MP-DNA拷贝数最低为4.6×10^(3)/mL,最高为1.93×10^(8)/mL,当BALF中MP-DNA拷贝数≥10^(7)/mL时,使用高剂量甲泼尼龙的比例明显上升,差异有统计学意义(χ^(2)=4.753,P<0.05);高拷贝组及中低拷贝组患儿性别、年龄、热程、入院后热程、呼吸困难比例及发病至采集灌洗液检测的时间比较差异无统计学意义(P>0.05),但高拷贝组住院时间长于中低拷贝组(t=2.871,P<0.05),出现胸腔积液比例高于中低拷贝组,差异有统计学意义(P_(Fisher)<0.05);实验室检查方面,高拷贝组的血清铁蛋白、D-二聚体均高于中低拷贝组,而外周血Ts细胞比例低于中低拷贝组,差异均有统计学意义(t值分别为2.408、2.450、-6.002,P<0.05)。结论RMPP患儿BALF中MP-DNA拷贝数达10^(7)/mL及以上时,甲泼尼龙初始剂量应考虑提高到4 mg·kg^(-1)·d^(-1)。

BALF-mNGS在难治性肺炎支原体肺炎中的应用1例

难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)是肺炎支原体感染的一种严重状态。该病以发热持续时间长、住院时间长和易出现肺外并发症为特点。本文收治1例快速进展的肺炎支原体肺炎患儿,怀疑合并肺炎克雷伯菌感染。通过宏基因组二代测序(mNGS)确诊,使用头孢哌酮舒巴坦联合米诺环素抗感染及纤维支气管镜下肺泡灌洗治疗后,病情转归良好。病原mNGS在病原学混合感染诊断中具有重要的意义,对于RMPP患者,积极早期应用纤维支气管镜下肺泡灌洗治疗,可以明确诊断同时获得良好的治疗效果。

绵羊肺炎支原体EF-Tu蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

[目的]克隆绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)EF-Tu基因,原核表达获得EF-Tu蛋白,制备抗EF-Tu蛋白的兔源多克隆抗体,为研究肺炎支原体EF-Tu蛋白的结构和功能奠定基础。[方法]采用重叠延伸PCR方法将pET-28a-EF-Tu质粒中EF-Tu基因中间的TGA密码子突变为TGG,并对测序结果与其他支原体参考株进行相似性比对和遗传进化分析,利用在线软件对其推测的蛋白序列进行生物信息学分析。将突变后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行原核表达,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定,利用镍柱亲和层析法纯化,以纯化的EF-Tu融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA和Western blotting检测多克隆抗体效价及免疫反应性。[结果]试验成功突变了EF-Tu基因中TGA位点,并构建了融合表达His标签pET-28a-EF-Tu′原核表达载体。生物信息学分析表明,克隆的EF-Tu基因与绵羊肺炎支原体MoGH3-3菌株相似性最高,亲缘关系最近;编码387个氨基酸,无N-糖基化位点和跨膜区域,存在10个丝氨酸、20个苏氨酸、4个酪氨酸磷酸化位点,二级结构由无规则卷曲(35.14%)、α-螺旋(26.87%)、延伸链(26.87%)及β-转角(11.11%)构成。SDS-PAGE和Western blotting结果显示,目的蛋白大小约为43 ku,蛋白纯化浓度为0.615 g/L。ELISA和Western blotting结果显示,制备的多克隆抗体效价可达1∶128 000,能够特异性识别EF-Tu融合蛋白,具有良好的免疫反应性。[结论]本研究成功突变了EF-Tu基因的TGA密码子,原核表达并纯化获得EF-Tu融合蛋白,制备其多克隆抗体效价为1∶128 000,为后续研究肺炎支原体EF-Tu蛋白结构和生物学功能及其疫苗研发提供了试验基础。

猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗不同免疫程序的免疫效果比较分析

为了评估不同免疫策略对猪场免疫效果和经济效益的影响,以确定最佳的疫苗免疫程序,本试验将处于产前1个月的四胎次健康三元母猪随机分为2个组,A组(联合免疫组)母猪于产前27 d联合免疫猪圆环病毒2型基因工程疫苗、猪肺炎支原体灭活疫苗和猪瘟活疫苗(圆柯欣+柯喘宁+稳柯健),其所产仔猪于21日龄联合免疫圆柯欣、柯喘宁和稳柯健;B组(对照组)母猪于产前34和27 d分别免疫稳柯健、猪圆环病毒疫苗和猪肺炎支原体疫苗二联疫苗(圆-支二联疫苗),其所产仔猪于14日龄免疫圆-支二联疫苗,28日龄免疫稳柯健。统计和分析免疫各组临床指标、生产性能和持续性抗体水平。结果显示,免疫疫苗后,2个组的母猪采食情况均正常;2个组的仔猪整体精神状态良好,哺乳情况正常,均未出现咳嗽和喘气等呼吸道疾病。在试验期间内,2个组的母猪的窝产健仔数和仔猪出生健仔均重并无差别。A组和B组的出生至23日龄死淘率、出生至50日龄死淘率分别为3.77%、5.11%和4.07%、5.43%,A组略优于B组。抗体监测结果显示,A组母猪的CSFV和PCV2抗体水平较B组无显著差异(P>0.05);A组仔猪的CSFV抗体阳性率与B组无明显差异(P>0.05),而PCV2抗体水平在免疫早期阶段(21日龄)明显高于B组(P<0.05)。结果表明,猪圆环病毒2型、猪肺炎支原体和猪瘟疫苗可以联合免疫,且免疫后相互之间不干扰。该联合免疫策略在确保免疫效果的同时,简化了疫苗免疫程序,为确定最佳的疫苗免疫程序提供了有价值的临床应用参考。

耐药基因23SrRNA的A2063G基因位点突变肺炎支原体肺炎62例临床分析

目的总结耐药基因23Sr RNA的A2063G基因位点突变肺炎支原体肺炎的临床特点,提高儿科医师的临床诊疗水平。方法对2022年7月至2023年7月广州市白云区第二人民医院儿科收治的62例耐药基因23Sr RNA的A2063G基因位点突变肺炎支原体肺炎患儿的临床资料进行回顾性分析,其中女28例,男34例,年龄(6.36±4.15)岁。呼吸道感染病原体及耐药基因的检测采用多重靶向扩增-高通量测序法(tNGS)。结果62例患儿中以学龄前期儿童多见[42例(67.7%)],秋季高发[30例(48.4%)],临床表现以咳嗽[62例(100.0%)]、发热[48例(77.4%)]为主,部分伴有喘息,大部分肺部体征早期不明显,随着病情进展可闻及干、湿啰音,肺外并发症主要有皮肤黏膜、血液系统、消化系统、心血管系统等;呼吸道多种病原体靶向测序:肺炎支原体、耐药基因23SrRNA的A2063G基因位点突变,血清肺炎支原体特异性抗体IgM均阳性,胸部X线表现以支气管肺炎、间质性肺炎、大叶性肺炎为主,4例患儿有胸腔积液;50例(80.6%)用阿奇霉素治疗有效,12例(19.4%)更换多西环素治疗有效,部分联合使用了糖皮质激素及免疫球蛋白,所有病例均好转或治愈出院。结论儿童肺炎支原体肺炎临床表现多样,病程较长,可累及多个系统。耐药肺炎支原体肺炎的治疗仍可首选大环内酯类抗菌药物,大部分是有效的,如无效可在权衡利弊下选择四环素类或氟喹诺酮类,部分病例需要联合使用糖皮质激素及免疫球蛋白。耐药基因的检测对评估肺炎支原体肺炎的疗效有一定意义。

肺泡灌洗液宏基因组对重症支原体肺炎患儿的诊断和治疗分析

目的探讨纤维支气管镜肺泡灌洗液宏基因组分析(metagenomics next generation sequencing,mNGS)对重症支原体肺炎患儿的临床价值。方法选取2020年4月—2021年4月于阳光融和医院儿科住院的300例重症支气管肺炎患儿,随机分为两组,每组150例患儿。观察组150例患儿行肺泡灌洗液mNGS检测,对照组150例患儿行血清支原体免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)抗体检测。两组患儿行血清支原体IgM抗体检测和mNGS支原体分析,比较两组支原体检出率和病原体检出率。两组病原体阳性患儿在常规治疗的基础上给予阿奇霉素静脉滴注。观察两组患儿治疗效果及并发症发病率。结果mNGS肺炎支原体阳性患儿共120例,检出率为80%,高于IgM抗体检出率。观察组混合感染病原菌检出率较高。通过对肺泡灌洗液样本的mNGS检测,观察组共检测出20例混合病原感染。相比于对照组常规病原体检测出的9例,mNGS检出率高。治疗后,观察组患儿退热,咳嗽消退,肺部影像好转和平均住院时间均显著缩短,且肺外并发症发病率低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论相比于血清支原体IgM抗体检测,纤维支气管肺泡灌洗液宏基因组分析检出率高,准确度高,对重症支原体肺炎患儿治疗有临床指导意义。

鼻咽抽吸物MP-DNA拷贝数与肺炎支原体肺炎临床表现的关系

目的探讨鼻咽抽吸物肺炎支原体基因MP-DNA拷贝数与肺炎支原体肺炎(MPP)临床表现的关系。方法回顾分析294例MPP住院患儿的临床资料,根据其MP-DNA拷贝数分为低拷贝组(MP-DNA拷贝数≤10~3/mL)21例、中拷贝组(10~4～10~6/mL)156例、高拷贝组(> 10~6/mL)117例。对三组患儿的临床表现、实验室检查结果、胸部X线变化进行比较分析;并用ROC曲线分析鼻咽抽吸物MP-DNA拷贝数对难治性肺炎支原体肺炎(RMPP)的诊断价值。结果与低、中拷贝组相比,高拷贝组的热程延长,热峰、C反应蛋白、乳酸脱氢酶增高,大片肺实变或肺不张、胸腔积液、肺外多器官受累以及RMPP发生率也增高,差异均有统计学意义(P<0.05)。MP-DNA拷贝数判断RMPP的ROC曲线下面积(AUC)为0. 701;当临界值为4. 83×10~6时,灵敏度和特异度分别为80.8%和55.4%。结论鼻咽抽吸物MP-DNA拷贝数与MPP炎症反应及肺内外损害可能相关,高MP-DNA拷贝数对早期诊断RMPP有一定参考意义。

绵羊肺炎支原体p113基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.

不同猪支原体肺炎活疫苗菌株P46和P97基因序列差异性分析

对我国用于生产的3种猪支原体肺炎活疫苗菌株(168株、RM48株、Z株)进行P46和P97R1R2基因序列分析,考察其保守性和差异。提取来源于四家猪支原体肺炎活疫苗生产企业的疫苗株基因组DNA,以其为模板进行PCR扩增、测序;利用DNAStar序列分析软件对测序结果和国际标准株J株、232株、7448株、7422株一起进行比对,分析3种疫苗菌株和4个标准株之间核苷酸及氨基酸差异。结果发现,疫苗株Z株、RM48株、168株的P46基因序列相似性为100%,与J株、232株相似性为99.1%,与7422株、7448株相似性为98.9%。疫苗株RM48株和Z株的P97R1R2基因序列相似性为100%;而与疫苗株168株相似性为97.5%;三个疫苗株与J株、232株、7448株、7422株的P97R1R2基因相似性仅为90.1%~93.6%,差异主要发生在R1区重复序列的次数上。本研究为临床猪支原体肺炎活疫苗菌株的检测及不同菌株之间的差异鉴定研究奠定了基础。

肺炎支原体23SrRNA基因突变及其所致肺炎的临床分析

目的了解肺炎支原体23SrRNA基因突变现状,提高对肺炎支原体大环内酯类抗生素耐药基因突变所致肺炎的临床认识和诊治水平。方法对2009年5月至2009年10月我院住院的肺炎支原体肺炎患儿咽试子标本,应用巢式PCR扩增23SrRNA基因并进行电泳检测及DNA测序分析,筛选突变株;并进行总结和分析临床特点。结果应用巢式PCR扩增23SrRNA测出基因序列45例,均存在大环内酯类抗生素耐药基因突变。且变异基因位点均为2063位A→G的点突变,其中2例为2063位点A/G双峰;临床特点表现为91.1%患儿持续性发热伴咳嗽,以中、高度热为主。68.9%外周血白细胞总数正常;45例患儿肺部影像资料显示,双肺炎症14例,大叶性肺炎7例,伴胸腔积液6例。20例有肺外合并症;45例应用红霉素静注治疗有效率91.1%。结论肺炎支原体大环内酯类抗生素作用位点之一23SrRNA 2063普遍存在突变,其所致肺炎的临床表现无特异性;应用大环内酯类抗生素治疗91.1%有效,肺炎支原体此位点突变与其在体内是否耐药尚需进一步研究。

猪肺炎支原体P97基因抗原决定簇R1区的克隆与表达

通过引物定点突变PCR法,扩增了猪肺炎支原体(Mhp)168株黏附因子P97基因抗原决定簇R1区基因片段,并将该基因片段插入表达载体pET-32 a(+)中构建重组质粒,再将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)。DNA序列分析结果表明所构建的重组质粒含有正确的目的基因。经0.1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)37℃诱导4 h,重组质粒表达的目的蛋白量可达到总蛋白的23%。W estern b lotting和ELISA试验结果证明所表达的重组蛋白具有猪肺炎支原体抗原性。

猪Toll样受体基因的变异及其与支原体肺炎感染的关系

Toll样受体(TLRs)作为重要的模式识别受体,在动物的天然免疫中发挥重要作用,是机体抵抗感染的第一道屏障;TLRs基因变异会改变机体对病原的抗性或易感性,本试验旨在探讨TLR2、TLR4基因突变与支原体肺炎感染的关系。试验以国外引进猪品种(长白、大白、皮特兰)、中国地方猪品种(梅山、二花脸、姜曲海、金华)以及江苏省培育猪品种(苏钟猪)为材料,通过PCR-SSCP技术检测实验猪群TLR2、TLR4基因SNPs分布,结合动物攻毒实验及文献报道,对其中部分SNP不同基因型猪的肺部巨噬细胞做LPS感染实验,借助RT-PCR跟踪不同时间点猪TLR2、TLR4基因以及促炎性因子TNF-α、IL-1β的表达变化,揭示猪Toll样受体基因的变异与支原体肺炎感染的关系。结果表明,本实验猪群TLR4基因存在4个SNP位点:T611A、G960A、G962A、C1027A,其中G960A为同义突变,其余为有义突变;位点C1027A在中、外猪品种间呈现明显的碱基分布差异。LPS诱导下的猪肺部巨噬细胞TLR2、TLR4基因及促炎性因子TNF-α、IL-1β均表现不同程度的表达上调;其中,位点C1027A的CC型猪TLR2、TLR4基因表达水平及增速均显著高于AC型猪(P<0.01),TNF-α、IL-1β的表达水平则显著低于AC型猪(P<0.01),提示C等位基因极可能是猪抗支原体肺炎感染的优势基因。

儿童肺炎支原体23S rRNA基因位点突变检测分析

目的了解儿童肺炎支原体(MP)大环内酯类耐药基因(23SrRNA)位点突变,以及与临床资料的相关性。方法收集该院354份肺炎患儿的呼吸道标本,采用实时荧光定量PCR法检测MP及23SrRNA位点突变(A2063G或/和A2064G)情况,并将MP阳性患儿分成位点突变组和未突变组,比较两组之间的临床资料。结果 354份呼吸道标本中,166份检测为MP阳性(46.9%),且135份MP阳性标本中存在23SrRNA基因位点突变(阳性检出率81.3%),31份未检测到23SrRNA基因位点突变。分析突变组和非突变组的临床资料发现两组在年龄和性别方面比较差异无统计学意义(P>0.05),但突变组的重症肺炎和肺外并发症发生率高于未突变组(P<0.05),且平均住院时间和平均发热时间均较未突变组长(P<0.05)。结论 MP 23SrRNA基因位点突变的较高检出率提示MP对大环内酯类耐药率较高,这为临床MP的感染、治疗提供一定的参考依据。