肺炎球菌溶血素溶血活性致大鼠脑损伤机制研究

目的溶血活性是肺炎球菌溶血素(pneumolysin,PLY)的重要生物学特性之一。运用不同溶血活性的PLY建立脑损伤模型,探讨溶血活性对PLY致大鼠脑损伤的作用机制。方法 4周龄大鼠,经左侧颈内动脉注入等剂量溶血活性缺失的PLY[PLY(-)]及溶血活性正常的PLY[PLY(+)],观察脑组织神经损伤情况及炎症因子水平。结果 PLY(+)组脑组织神经元烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)[(122.495±4.852)%]及胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)水平[(135.697±2.727)%]较PLY(-)组及等渗盐水(NS)对照组[(80.467±2.460)%,(89.622±3.226)%]均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),PLY(-)组NSE[光度值(102.081±2.150)%]及GFAP水平[光度值(96.323±4.113)%]也高于对照组(NSE光度值80.467±2.460,GFAP光度值89.622±3.226),差异有统计学意义(P<0.05);PLY(+)组TNF-α及IL-6水平[(103.902±3.221)、(52.030±1.817)ng/mL]较PLY(-)组[(94.152±3.032)、(41.628±2.972)ng/mL]及NS对照组[(69.986±3.567)、(21.246±3.118)ng/mL]均明显升高,差异有统计学意义(P<0.05),PLY(-)组TNF-α[(94.152±3.032)ng/mL]及IL-6水平[(41.628±2.972)ng/mL]也较NS对照组[(69.986±3.567)ng/mL,(21.246±3.118)ng/mL]明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论溶血活性在肺炎链球菌造成脑损伤过程中具有重要作用,并且一定程度上可促进炎性因子释放。

肺炎球菌溶血素的纯化及其免疫效果

目的从6B、9V、14、19F型肺炎球菌培养物中纯化肺炎球菌溶血素(PLY),并检测其免疫原性和保护作用。方法采用自溶、硫酸铵沉淀及三步柱层析法纯化PLY,并检测PLY免疫NIH小鼠后血清抗体滴度及其保护效果。结果纯化的6B、9V、14、19F型PLY纯度依次为83.4%、99.2%、70.1%和76.6%;9V型PLY表观相对分子质量为52840,与文献报道的53000相一致。从4种血清型肺炎球菌中纯化的PLY均能诱导小鼠产生高且稳定持久的抗体滴度。各免疫组小鼠分别感染6B、9V、14、19F型肺炎球菌,存活率均显著高于对照组。结论4种血清型PLY均具有良好的免疫原性和保护作用。

肺炎球菌溶血素

肺炎球菌溶血素（PLY）是一种多功能肺炎球菌毒力因子,在肺炎球菌感染的早期发病机理中似能促进细菌肺内生长和扩散。PLY通过其对呼吸道上皮和内皮细胞的毒性,破坏肺组织屏障,促进肺炎球菌生长和扩散。由于PLY对免疫和炎症细胞的直接抑制作用及对补体的激活,因此能阻止从肺间质和血液中清除细菌。PLY能刺激局部和全身性免疫应答,并能增强肺炎球菌多糖（PS）的免疫原性,因此PLY-PS结合物可构成菌苗的基础,这种菌苗不仅能诱生针对肺炎球菌PS的保护性和持久性免疫应答,而且亦能产生使呼吸道粘膜免受毒性损害的中和性抗PLY抗体。

肺炎链球菌溶血素诱导THP-1细胞凋亡涉及MAPK1/3信号途径

目的探讨肺炎链球菌溶血素(pneumolysin,Ply)对人急性单核细胞白血病单核细胞株THP-1细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用及机制。方法 MTT法检测Ply对THP-1细胞的增殖抑制。瑞氏染色观察Ply对人THP-1细胞形态的影响。AnnexinV-FITC/PI双标法检测细胞凋亡。琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞DNA片段化现象。免疫组化和Western blot检测MAPK1/3蛋白表达的变化。结果将人THP-1细胞分别与0.05、0.1、0.5、1、2.5、5μg/ml Ply共同孵育后,在24、48、72、96 h用MTT法检测细胞增殖抑制率,发现Ply对人THP-1细胞具有明显的增殖抑制作用,并且呈剂量和时间依赖性,IC50(24 h)为1.31μg/ml;0.05μg/ml和0.1μg/ml Ply分别处理THP-1细胞12 h后,通过瑞氏染色法观察人THP-1细胞可见凋亡小体及核碎裂象等典型的凋亡形态学改变;用0.05μg/ml Ply和0.1μg/ml Ply作用THP-1细胞12 h后细胞早期凋亡率分别为11.83%和48.45%(P<0.05);提取凋亡THP-1细胞DNA,进行琼脂糖凝胶电泳可见典型的"梯状"条带;Ply作用于人THP-1细胞后,胞内MAPK1/3蛋白表达降低(P<0.05)。结论 Ply可诱导人THP-1细胞凋亡,此作用涉及MAPK1/3信号通路的参与。

野生型肺炎链球菌溶血素通过PI3K-I/Akt/mTOR途径诱导A549细胞自噬

目的:研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)诱导人肺上皮细胞自噬发生的现象及其机制。方法:常规培养人肺上皮A549细胞与野生型Sp;将GFP-LC3真核载体转染A549细胞,分为实验组(Sp,MOI=30∶1)、阴性对照组[渥曼青霉素(wortmannin,WT),2μmol/L 2 h,自噬抑制剂]、阳性对照组[雷帕霉素(rapamycin,Rapa),1 mmol/L 10 h,mTOR抑制剂]和参照组(WT和Sp共同处理),各组处理时间均为1、2、3和4 h;荧光显微镜观察各组自噬点形成,透射电镜观察各组细胞自噬体结构,Western blot检测各组微管相关蛋白轻链-Ⅰ/Ⅱ(microtuble-associated protein light chain 3-Ⅰ/Ⅱ,LC3-Ⅰ/Ⅱ)、磷酸化UNC-51-K激酶1(phosphorylated UNC-51-like kinase1,P-ULK1)和螯体1(sequestosome 1,P62)的表达;将溶血素表达载体RFP-PLY(red fluorescent protein-pneumolysin)、GFP-LC3或(和)RFP-PLY转染/共转染A549细胞,Western blot检测各组磷酸肌醇3-激酶-Ⅰ/Ⅲ(phosphoinositide 3-kinase-Ⅰ/Ⅲ,PI3K-Ⅰ/Ⅲ)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、Beclin-1蛋白(Beclin 1 protein,Beclin-1)和哺乳动物雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)的表达。结果:处理A549细胞3 h后,与阴性对照组(WT)相比,Sp感染后,自噬点明显增多(t=41.313,P=0.001),电镜观察到典型的自噬体结构,LC3-Ⅱ蛋白表达明显上调(t=121.592,P=0.000);A549细胞转染RFP-PLY处理3 h后,与阴性对照组(WT)相比,Sp感染同样观察到明显的自噬现象,PI3K-I、Akt蛋白和mTOR表达下调(tPI3K-I=16.544,PPI3K-I=0.004;tAkt=22.679,PAkt=0.002;tmTOR=19.503,PmTOR=0.003),而PI3K-Ⅲ和Beclin-1水平无明显差异(tPI3K-Ⅲ=3.572,PPI3K-Ⅲ=0.070;tBeclin-1=0.799,PBeclin-1=0.508)。结论:野生型Sp诱导A549细胞自噬可能通过PI3K-I/Akt/mTOR信号途径。

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。

肺炎球菌荚膜多糖和溶血素结合疫苗的制备及其免疫原性的研究

目的研制肺炎球菌荚膜多糖(PS)与肺炎球菌溶血素(蛋白)偶联结合疫苗。方法用PCR扩增肺炎球菌溶血素(Pn)基因,将其克隆入表达载体pET-28a质粒中,然后转化大肠杆菌JM109(DE3)宿主细胞,并以IPTG诱导进行蛋白质表达,对所得蛋白质用固相Ni-NTA树脂作纯化,再用SDS-PAGE鉴定表达的纯化蛋白(rPn)。以福尔马林脱毒rPn,去除其溶血活性,然后用氨基还原法将脱毒的rPn与PS(19F血清型)偶联结合,加入铝佐剂制备成疫苗。以该疫苗腹腔注射接种小鼠,用ELISA法检测小鼠血清中抗PS及抗Pn的抗体水平。结果成功扩增和克隆了Pn基因,经诱导表达得到rPn蛋白,纯化后纯度达90％以上。PS与Pn结合物经凝胶层析柱分离,其洗脱峰较PS与Pn二峰明显前移。用该结合疫苗免疫的小鼠血清中抗PS(19F)抗体及抗Pn抗体的效价均明显高于阴性对照组(P＜0．01)。结论用基因工程技术制备的肺炎球菌溶血素作为蛋白载体,脱毒后与肺炎球菌多糖偶联而成的结合疫苗能在小鼠体内诱导出明显的免疫应答反应。

肺炎链球菌溶血素致脑损伤中细胞凋亡及凋亡诱导因子的变化及意义

目的探讨肺炎链球菌溶血素（PLY）致感染性脑损伤中细胞凋亡及凋亡诱导因子（AIF）的表达及意义。方法SD大鼠80只按随机数字表法分为PLY组颈内动脉注射0．2mL（7μg）PLY]和生理盐水（NS）组（颈内动脉注射等体积NS），每组40只。每组按观察时间点分为6h、12h、24h、48h4个亚组，每亚组10只，其中5只注射EB，甲酰胺法测定脑组织EB含量判断血脑屏障（BBB）的破坏程度。5只不注射EB，取脑组织切片，应用免疫组化和TUNEL染色分别检测脑组织神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）、AIF蛋白含量和细胞凋亡。结果与NS组比较，造模后各时间点PLY组大鼠脑组织EB、NSE、GFAP、AIF蛋白含量均较高。细胞凋亡较多，差异均有统计学意义（P〈0．05）；PLY组大鼠脑组织凋亡细胞数与AIF蛋白的表达呈正相关关系（r=0．959，P=0．000）。结论细胞凋亡参与了PLY诱导的脑损伤的发展过程，A1F可能介导了神经细胞的凋亡。

褪黑素对肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤细胞凋亡的影响

目的探讨褪黑素(MT)对肺炎链球菌溶血素(PLY)致脑损伤细胞凋亡的影响。方法幼鼠84只随机分成3组:9 g.L-1盐水组(NS组)28只,颈内动脉注射9 g.L-1盐水;PLY组28只,颈内动脉注射0.2 mL(7μg)PLY;MT组28只,腹腔注射(1 g.L-1)MT 10 mg.kg-1,15 min后颈内动脉注射0.2 mL(7μg)PLY。每组按照注射后不同的时间点(24 h、48 h)分为2个亚组。预定时间点处死动物,制备脑组织标本。干湿质量法测定其脑组织含水量(BWC),甲酰胺法测定伊文思兰(EB)水平,免疫组织化学技术测定凋亡诱导因子(AIF)表达,原位末端标记法检测细胞凋亡。结果 HE染色光镜下可见PLY组血管间隙增宽,大脑皮质炎性细胞浸润,胶质细胞和神经元细胞有不同程度肿胀、空泡变性。NS组无上述病理变化。MT组大鼠脑组织改变较PLY组轻。PLY组各时间点脑组织BWC水平、EB水平、AIF水平明显增加,24 h高于48 h,差异有统计学意义。PLY组各时间点凋亡细胞数明显增加,48 h高于24 h,差异有统计学意义。各时间点PLY组与对照组比较均有统计学差异。予以MT干扰后各时间点脑组织各指标以及凋亡细胞数均降低,与PLY组比较,差异有统计学意义。结论 MT能够降低AIF表达,减少神经细胞凋亡,保护脑组织。

肺炎链球菌溶血素致大鼠脑损伤模型髓样细胞触发受体1的动态变化及意义

目的 探讨髓样细胞触发受体1（TREM-1）在肺炎链球菌溶血素（PLY）致大鼠脑损伤中的动态变化及意义.方法 将64只SD大鼠按简单随机法均等分为PLY组和对照组,分别经左侧颈内动脉注射0.1mL PLY和等体积灭菌9g/L盐水;观察注射后4h、6h、12 h和24 h不同时间点脑组织大体和组织学变化,并应用免疫组织化学法检测脑组织中神经细胞损伤标志物胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）蛋白表达水平,同时应用酶联免疫吸附法检测TREM-1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及白细胞介素6（IL-6）表达水平.结果 PLY组脑组织大体和组织学结果提示大鼠脑损伤存在,且脑组织中GFAP和NSE蛋白表达及TNF-α和IL-6表达在4h开始增加,随注射时间点推移,其表达水平动态增加,与相应时间点对照组相比,差异均有统计学意义（P均＜0.05）.PLY组脑组织TREM-1蛋白表达在4h明显增加,在6h有所下降,但仍高于对照组,差异均有统计学意义（P均＜0.05）,12 h与24 h TREM-1蛋白表达水平明显下降,与对照组相比差异无统计学意义（P均＞0.05）.结论 TREM-1蛋白表达在PLY诱发的大鼠脑损伤早期明显上调,可能通过促进炎性因子TNF-α和IL-6的表达而参与脑损伤的病理发展过程.

肺炎链球菌溶血素致幼鼠感染性脑损伤动物模型的建立

目的探讨经颈内动脉注射肺炎链球菌溶血素（PLY）建立感染性脑损伤动物模型的方法和可行性。方法采用颈内动脉注射PLY制作幼年大鼠感染性脑损伤动物模型。选取健康普通级1月龄SD大鼠160只,体质量100~120 g,雌雄不限,随机分为PLY组和对照组,其中PLY组（实验组）80只,颈内动脉注射PLY0.2 mL（7μg）;对照组80只,颈内动脉注射等体积9 g.L-1盐水。根据不同观察时间点（注射后6 h、12 h、24 h及48 h）,将PLY组SD大鼠分为4个亚组,每个亚组中分别有10只注射伊文思蓝（EB）,测定不同时间点脑组织EB水平;注射EB组经右颈外静脉近心端注入20 g.L-1EB（2 mL.kg-1）,推注时间1~2 min。各组处理后,待观察至相应时间点,将大鼠麻醉行心脏灌注后断头取脑,用于制作脑组织标本,以备观察。采用干湿质量法检测其脑组织含水量（BWC）,甲酰胺法测定其脑组织EB水平,利用免疫组织化学法检测其脑组织神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果与对照组相比,HE染色光镜下观察,PLY组脑组织可见血管扩张、血管周围间隙增宽、炎细胞浸润、神经元空泡变性、星形胶质细胞体积增大肿胀、细胞核固缩等改变。各时间点PLY组BWC、EB水平、NSE及GFAP表达量均明显高于对照组,差异均有统计学意义（Pa〈0.01）。结论经幼鼠颈内动脉注射PLY可以成功建立幼鼠感染性脑损伤模型。

肺炎链球菌溶血素的研究进展

肺炎链球菌溶血素(Pneumolysin,PLY)是肺炎链球菌的一种重要毒力因子,包含4个结构域,是胆固醇依赖性细胞溶血素(CDCs)的家族成员之一。PLY可广泛作用于宿主组织细胞,发挥细胞毒性作用。PLY可活化补体经典途径,诱导巨噬细胞和单核细胞等产生细胞因子,介导机体免疫应答过程。PLY是肺炎链球菌蛋白疫苗和相关小分子药物研制的重要靶标。本文就PLY的结构、功能及相关疫苗的最新研究进展进行综述。

肺炎链球菌蛋白PLYd和PsaA的制备与鉴定

目的:对2种肺炎链球菌蛋白肺炎链球菌脱毒溶血素(detoxified pneumolysin,PLYd)和肺炎链球菌表面黏附素(pneumococcal surface adhesin A,Psa A)进行全基因合成、重组表达、制备和鉴定。方法:根据Gen Bank中PLYd,Psa A的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得2种蛋白的基因,在PLY基因中引入多位点突变保证表达的蛋白无毒性,构建无标签、高效重组表达菌株,建立2种重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测。结果:人工合成的PLYd,Psa A基因序列经鉴定与预期一致。2种蛋白在大肠杆菌中均获得了高效表达,表达量在40%以上,经2步纯化其纯度均达到95%。2种蛋白均能与阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后均可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论:成功制备2种无标签肺炎链球菌蛋白PLYd,Psa A,且具备与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为开展应用研究奠定基础。

溶血素的定点突变及与表面蛋白A的表达

目的利用基因定点突变技术扩增Ply突变基因△Ply,基因重组技术构建△Ply与PspA基因的串联融合表达蛋白PspA-△Ply。方法根据肺炎链球菌TIGR4型表面蛋白A和溶血素基因序列设计引物,定点突变法扩增Ply突变基因,PCR法扩增PspA基因。运用基因重组技术构建pET32a-PspA-△Ply表达载体,双酶切与测序验证重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度、不同浓度IPTG诱导表达融合蛋白,Western免疫印迹鉴定表达产物。结果 Ply突变基因测序证实ply基因的△A146R147碱基成功突变,双酶切与测序证实pET32a-PspA-△Ply构建正确,Western免疫印迹见重组质粒转化菌在120×103现特异性条带。结论成功实现Ply基因的定点突变,构建PspA-△Ply融合蛋白表达载体,为研究新型抗肺炎链球菌蛋白疫苗奠定基础。

肺炎链球菌核酸疫苗在恒河猴体内的免疫原性研究

目的研究肺炎链球菌溶血素（pneumolysin，PN）核酸疫苗在恒河猴体内的免疫原性。方法将肺炎链球菌溶血素全长基因和切去羧基端33个核苷酸的基因分别插入到质粒pVAX1载体中，构建成Ppn和Ppnd两种核酸疫苗。采用体内电转染初免结合相应蛋白质抗原加强的策略免疫恒河猴。结果切去肺炎链球菌溶血素基因羧基端33个核苷酸，表达的重组截短溶血素蛋白保留了抗原性但去除了溶血活性，从而保证了疫苗的安全性。给恒河猴肌肉内注射500μg核酸疫苗加电转染能诱导出特异性抗体免疫应答，用相应蛋白质加强免疫后血清抗体几何平均滴度提高了约4倍。结论采用电转染技术结合蛋白质加强免疫的策略，能增强肺炎链球菌溶血素核酸疫苗在恒河猴体内的特异性抗体水平。