肺炎链球菌表面蛋白A多价DNA疫苗交叉免疫保护作用评价

目的评价肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗抵御不同肺炎链球菌来源的异种PspA分子毒力作用的能力。方法以包含PspA抗原Fam1的Clade1亚类和Fam2的Clade3亚类DNA序列的T载体为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增具有高保护性抗体效价和强交叉反应的PspA优势家族亚类PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3片段,克隆至真核载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1-Clade1和pcDNA3.1-Clade3,免疫印迹(Western blot)及逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)检测重组质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达。重组肺炎链球菌PspA多价DNA疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)肌肉注射免疫小鼠,观察免疫小鼠鼻咽部PspA异家族来源的不同肺炎链球菌携带情况改变和腹腔攻击小鼠21d的生存情况。结果成功构建肺炎链球菌PspA优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗。疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)免疫组小鼠鼻咽部携带的PspA异家族来源的不同肺炎链球菌菌落计数无显著性差异(P>0.05),而明显少于空白质粒及PBS对照组小鼠(P<0.01);疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)免疫组小鼠针对PspA异家族来源的不同肺炎链球菌腹腔攻击后中位生存时间无显著差异(P>0.05),而明显长于空白质粒及PBS对照组小鼠(P<0.01)。结论 PspA优势家族亚类PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3的靶抗原组合形式能够有效解决PspA的抗原多样性问题,所构建的肺炎链球菌DNA疫苗有望针对PspA异家族来源的临床肺炎链球菌株感染。

肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定

目的探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式。方法分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA’和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply点突变减毒体),免疫印迹(Westernblot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA)。将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’,C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21d生存情况。结果成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01)。结论PspA’联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合。

以蛋白为基础的新型肺炎球菌疫苗的安全性、反应原性和免疫原性:Ⅰ/Ⅱ期随机临床研究

背景：含有高度保守的肺炎球菌蛋白,例如肺炎链球菌溶血素类毒素（d Ply）和三联组氨酸蛋白D（Pht D）都正被开发出来以期提供抗肺炎球菌病的保护。这项研究评价了不同的含肺炎球菌蛋白的疫苗配方制剂的安全性、反应原性和免疫原性。试验在成人中进行。方法：在Ⅰ期双盲临床试验中,健康成人（18~40岁）被随机（1∶2∶2∶2∶2∶2∶2）分组,按2个月间隔，接受6种待测疫苗配方制剂中的一种制剂。

肺炎链球菌毒力蛋白在侵入性感染中的免疫原性评价

目的观察肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)及肺炎链球菌溶菌素(Ply)激发自然途径感染肺炎链球菌机体保护性体液免疫应答的情况,评价这三种毒力蛋白作为治疗性肺炎链球菌疫苗候选抗原的免疫原性。方法采集侵入性肺炎链球菌感染患者(实验组)及同期确诊为侵入性其它细菌感染患者(对照第一组)和同期确诊为非感染性疾病患者(对照第二组)各36例急性期(第0+3天)及恢复期(第21±3天)血清样本,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中肺炎链球菌3种毒力蛋白抗原特异性抗体IgG水平变化。结果实验组与两组对照组间第(0+3)天血清的3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平无显著性差异(P>0.05)。第一组对照组恢复期较急性期血清中3种毒力蛋白特异性抗体水平无显著变化(P>0.05),而实验组恢复期血清3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平明显高于急性期血清抗体水平8～30倍(P<0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特异性抗体水平升高更明显,血清中针对PspA家族1(PspA-Faml)特异性抗体水平高于针对PspA家族2(PspA-Fam2)的特异性抗体水平(P<0.01)。结论 PsaA,PspA及Ply均为具有免疫原性的肺炎链球菌菌体成分,其中PspA和Ply特异性抗体在人体自然途径的肺炎链球菌感染中发挥更重要的保护性作用,可作为新一代治疗性肺炎链球菌疫苗理想的侯选抗原。

肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定

目的对肺炎链球菌表面蛋白C(PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定。方法根据Gen Bank中Psp C的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析。结果人工合成的Psp C基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30%以上,经两步纯化后纯度达到95%。重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论获得了重组肺炎链球菌蛋白Psp C,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础。

肺炎球菌表面蛋白A(PspA)及其荚膜多糖交联物的免疫原性和交叉保护作用

分别采用肺炎球菌表面蛋白A(PspA)和PspA-荚膜多糖交联物免疫小鼠,研究PspA及其交联物的免疫特性.用酶联免疫吸附法(ELISA)检测抗原的免疫原性,用动物保护试验检验抗原对肺炎球菌6B,5,1,23F,19F型的交叉免疫效果.实验结果表明:肺炎球菌表面蛋白A及其多糖交联物表现出一定的交叉保护作用,具有较好的应用前景.

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。

肺炎链球菌胆碱结合蛋白A在社区获得性肺炎诊断中的应用

目的:探索以肺炎链球菌胆碱结合蛋白A(pneumococcal choline binding protein A,rCbpA)为抗原的酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)反应模型在肺炎球菌性社区获得性肺炎患者(community acquired pneumonia,CAP)检测中的应用价值。方法:设计合成cbpA基因序列引物,通过PCR扩增,构建克隆质粒PGM-T/cbpA和表达质粒。经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl phosphorothioate,IPTG)诱导表达重组蛋白rCbpA;构建ELISA反应模型(rCbpA作为抗原),检测健康组及肺炎球菌性CAP患者组血清中相应的IgM和IgG抗体。并与痰培养、血培养结果相比较。运用卡方检验分析结果差异。结果:成功获得肺炎链球菌重组蛋白rCbpA,建立rCbpA-ELISA模型。以rCbpA-IgM模式检测肺炎球菌性CAP患者组的敏感性为22.5%,与血培养及痰培养法检测的敏感性无统计学差异(χ^(2)=3.529,P=0.060;χ^(2)=0.075,P=0.785);但其特异性为100%,明显高于痰培养(χ^(2)=12.754,P=0.000)。rCbpA-IgG模式检测肺炎球菌性CAP患者组的敏感性为50%,与血培养、痰培养检测的敏感性差异具有统计学意义(χ^(2)=17.635,P=0.000;χ^(2)=7.912,P=0.005)。结论:血清重组蛋白rCbpA对IgM类抗体有高特异性、对IgG类抗体有高敏感性,且该检测方法快,判定结果更准确客观,可以有效提高肺炎球菌感染性肺炎的诊断价值。

肺炎链球菌疫苗候选抗原PspA异家族亚类间交叉反应评价

目的:观察肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)在临床肺炎链球菌自然感染情况下家族分布及异家族亚类间抗原抗体交叉反应情况,探索肺炎链球菌PspA核酸疫苗的抗原组成形式。方法:采集我院42例临床侵入性肺炎链球菌感染菌株,及患者恢复期(第21±3天)的血清样本,同期确诊为非感染性疾病患者36例血清样本为对照组,细菌基因组特异性PCR及测序比对鉴定PspA家族分布,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应情况。结果:42株肺炎链球菌中以PspA家族Fam1-Clade2(31.0%)和Fam2-Clade3(47.6%)的菌株为优势分布,所有侵入性肺炎链球菌感染患者血清中针对PspA-Fam1特异性抗体水平高于针对PspA-Fam2的特异性抗体水平,血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应发现异家族各亚类间交叉反应弱,但同家族亚类间显著交叉反应以Fam1-Clade1和Fam2-Clade3为优势。结论:肺炎链球菌PspA核酸疫苗靶抗原的组成时应同时包括产生高保护性抗体效价和强交叉反应的Fam1及Fam2的优势Clade亚类成分才能有效针对广泛的临床致病肺炎链球菌菌株感染的保护。

肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价。方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达。与前期构建的肺炎链球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA’核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况。结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA’组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P<0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P<0.01),但是与pcDNA3.1-PspA’组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P>0.05)。小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P<0.01),但与pcDNA3.1-PspA’组比较中位生存时间无显著差异(P>0.05),生存曲线相似。结论:LytA联合PspA’的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA’的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究。

肺炎链球菌相关毒力因子及其作用的研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S.pn)是导致黏膜疾病(如中耳炎、肺炎)和系统性疾病(包括败血症和脑膜炎)等严重疾病的主要病原体之一。肺炎链球菌毒力因子分为荚膜多糖、S.pn相关蛋白、细胞壁及细胞壁多糖三大类,其中荚膜多糖为最主要的毒力因子,也是疫苗中最有效的成分。毒力因子在S.pn入侵机体及引发疾病的过程中起着重要的作用。因此,毒力因子及作用的研究,不仅对预防和治疗肺炎链球菌的感染有着重要的意义,并为研发安全、有效的多糖疫苗提供一定的技术支持。现就肺炎链球菌毒力因子及其作用作一综述。

肺炎链球菌内肽酶O及表面黏附素A联合蛋白疫苗免疫保护作用研究

目的原核表达肺炎链球菌内肽酶O(PepO)及肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA),评价其作为疫苗候选蛋白的免疫保护效果。方法设计pepO,psaA目的基因片段的特异性引物,经PCR扩增,构建重组质粒pET28a(+)-pepO,pET28a(+)-psaA,重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)诱导表达,经纯化后获得高纯度目的蛋白PepO及PsaA。经黏膜免疫BALB/c小鼠制备其特异性抗血清,ELISA检测抗体效价,Western blot分析验证目的蛋白抗血清的特异性。将BALB/c小鼠随机分为阴性对照组、PepO组、PsaA组及PepO+PsaA联合免疫组,每组18只。构建不同血清型肺炎链球菌感染模型,评估目的蛋白单用及联合使用的免疫保护效果。结果成功制备并获得目的蛋白PepO及PsaA,经Western blot验证目的蛋白抗血清特异性好。PepO组和联合免疫组小鼠唾液中IgA及血清中IgG效价比较差异无统计学意义(P>0.05),但均高于PsaA组(P<0.05)。PepO组、PsaA组及联合免疫组对鼻腔感染肺炎链球菌D39及CMCC31436小鼠的保护率高于阴性对照组(P<0.05),且PepO组及联合免疫组对鼻腔感染肺炎链球菌D39小鼠的保护率高于PsaA组(P<0.05)。抗定植实验结果显示,与对照组比较,PepO组、PsaA组及联合免疫组均能有效降低肺炎链球菌CMCC31693及CMCC31207在小鼠鼻咽部和肺部的定植(P<0.05),且联合免疫组对降低肺炎链球菌CMCC31207在小鼠肺部的定植效果更好(P<0.05)。结论 PepO+PsaA联合疫苗经黏膜途径免疫小鼠后,较单用对小鼠有更好的保护作用,能有效抵抗肺炎链球菌在鼻咽部、肺部的定植,是一组较有开发潜力的蛋白疫苗。

肺炎链球菌表面蛋白 A 的家族Ⅰ不同支系融合蛋白的制备及免疫原性研究

目的：构建肺炎链球菌家族Ⅰ中支系1和2肺炎链球菌表面蛋白A（ PspA）重组融合蛋白，分析融合蛋白的免疫原性。方法 PCR扩增目的基因片段，构建重组质粒并表达，ELISA检测抗体滴度和亲和度，以及抗蛋白血清特异性和免疫交叉性。结果成功构建重组质粒并原核表达。血清中抗体滴度可达到1×10^4，亲和度达到2×10^5，调理吞噬试验阳性，保护试验效果显著。结论肺炎链球菌家族Ⅰ中支系1和2肺炎链球菌表面蛋白A（ PspA）重组融合蛋白具有较高的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体，具有免疫交叉保护性。

成人接种13价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗与23价肺炎球菌多糖疫苗的免疫原性及安全性差异的Meta分析

目的评价成人接种13价肺炎球菌多糖结合蛋白疫苗(PPCV13)与23价肺炎球菌多糖疫苗(PPSV23)的免疫原性与安全性差异。方法检索美国国家医学图书馆数据库(NCBI)和Cochrane协作网图书馆等数据库,将比较PPCV13和PPSV23的免疫原性和安全性的随机对照研究(RCT)纳入分析。合并计算抗菌调理吞噬活性的几何平均滴度(GMT)的比值(GMTR)和各类不良反应发生的相对危险度(RR)。结果共纳入5篇RCT文献,PPCV13组在接种1个月后针对10个血清型(1、4、5、6A、6B、9V、18C、19A、19F、23F)的GMT水平显著高于PPSV23组(P均<0.05);接种PPCV13和PPSV23,14 d后总体局部反应发生率并无显著差异(RR=1.08,95%CI:0.95~1.24),总体全身反应发生率并无显著差异(RR=0.97,95%CI:0.91~1.04)。结论成人接种PPCV13与PPSV23的安全性无显著差异,但接种PPCV13可以产生更好的免疫应答效果。

肺炎链球菌表面蛋白A的研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,Sp)是儿童社区获得性感染的主要病原菌。目前使用较多的7价结合疫苗及23价肺炎链球菌多糖疫苗在长期使用后会出现血清型替换,这可能会使接种疫苗的受益程度下降。寻找新的候选疫苗是有效预防Sp疾病的重要途径,蛋白质疫苗因此备受关注。本文就近年来研究较多的下一代Sp疫苗的重要的候选蛋白质抗原,肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)的研究进展作一简要综述。

肺炎球菌表面蛋白A的原核表达及其作为多糖结合疫苗载体的可行性

目的原核表达肺炎球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA),并探讨其作为多糖结合疫苗候选载体的可行性。方法合成PspA基因,定向克隆至pET-30a(+)载体,构建重组表达质粒pET-30a-rPspA,转化E.coli Sta(rDE3)菌株,IPTG诱导表达。表达产物经Ni离子亲和层析纯化后,经Western blot鉴定。取破伤风类毒素(Tetanus toxoid,TT)及纯化的rPspA,分别与A群脑膜炎球菌多糖(Group A meningococcal capsular polysaccharide,GAMP)通过溴化氰活化法进行偶联,获得rPspA-GAMP与TT-GAMP多糖蛋白结合物,对其进行纯化及检定。多糖结合物分别以滴鼻和肌肉注射途径免疫BALB/c小鼠,评价其诱发的体液免疫和黏膜免疫水平。结果重组表达质粒经双酶切及测序鉴定构建正确;表达产物主要以可溶形式存在,表达量约占菌体总蛋白的20%,经纯化后纯度可达90%,可与His单抗特异性结合;肌肉注射途径显示,两种蛋白载体的结合物均能诱发较高水平的体液免疫,不同载体间差异无统计学意义(P>0.05);滴鼻途径显示,载体蛋白rPspA的结合物刺激产生sIgA的能力优于传统载体TT,差异有统计学意义(P<0.05)。结论原核表达并纯化了rPspA,其具有新型多糖蛋白载体的潜力,也可作为黏膜投递型多糖结合疫苗的候选载体。

肺炎球菌表面蛋白A(PspA)的克隆表达及交叉免疫作用

本工作从中国临床最常见的5种荚膜血清型肺炎链球菌(FY01,FY05,FY6B,FY19F,FY23F)克隆获得编码PspA蛋白N端α-螺旋区的基因片段。分别将5种PspA基因片段克隆到表达载体pET-27b(+)上,成功构建重组质粒pET-pspA,转化大肠杆菌BL21(DE3)。经乳糖诱导表达和亲和层析分离,获得高纯度重组蛋白。通过家族专属引物PCR的方法鉴定这5种荚膜血清型肺炎球菌的PspA蛋白所属家族,并进一步根据基因测序结果通过生物信息学方法鉴定了所属支系。FY01 rPspA、FY6B rPspA、FY19F rPspA同属于家族Ⅰ支系1,FY05 rPspA属于家族Ⅰ支系2,FY23F rPspA属于家族Ⅱ支系3。以FY01 rPspA免疫小鼠,在20μg/mL免疫剂量时抗体滴度达到1:210000,显示了重组蛋白较好的免疫原性。Western blotting交叉免疫反应性研究表明,抗FY01 rPspA抗血清与FY01 rPspA、FY6B rPspA和FY19F rPspA反应性较好,而与另外两种重组蛋白几乎无反应,提示PspA交叉免疫作用仅限于本支系内。动物保护实验表明,FY01 rPspA免疫的小鼠对FY6B、FY01两种菌的攻击具有较好的保护作用,对FY05、FY23F的攻击未见明显的保护作用。本研究成果对于研制高效肺炎球菌疫苗具有重要的指导意义。

肺炎球菌表面蛋白的制备及免疫原性评价

目的：获得PspA4蛋白，并检验其免疫原性。方法通过基因合成获得PspA4基因，通过体外重组技术构建重组质粒，并使用大肠杆菌表达PspA4蛋白，免疫后通过ELISA测定小鼠血清中特异性IgG的效价研究PspA4蛋白的免疫原性。结果获得了纯度90％以上的PspA4蛋白，抗体效价检测的实验结果显示PspA4免疫组的抗体滴度与空白组有明显提高，说明重组的PspA4蛋白在大肠杆菌的表达产物具有高免疫原性。结论该研究为以肺炎球菌表面蛋白为基础的疫苗研究奠定了基础，结合PspA蛋白的多亚型特点，PspA4作为肺炎疫苗的备选蛋白之一有待进一步研究。