肺炎链球菌多糖结合物中游离蛋白含量测定方法的建立

目的建立肺炎链球菌多糖结合物中游离蛋白含量的测定方法。方法采用Lowry法与凝胶色谱法相结合的方法检测结合物中游离蛋白浓度,再计算出结合物中游离蛋白含量,并对建立的方法进行准确性和精密性验证。结果采用本方法测定3个浓度肺炎链球菌多糖结合物中游离蛋白含量的平均回收率分别为98.6%、98.5%和97.0%;检测同一批肺炎链球菌多糖结合物的试验间变异系数CV值为3.0%。结论该方法简便、易行,准确性和精密性较好,可准确检测出肺炎链球菌多糖结合物中游离蛋白的含量。

6型肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白A结合物的表征及免疫原性

目的:表征肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白A结合物,并研究其免疫原性。方法:采用凝胶色谱及电泳分析鉴定肺炎链球菌荚膜多糖-外膜蛋白A结合物,ELISA法检测小鼠血清中特异性IgG抗体水平及交叉反应。结果:结合物相对相对分子质量大于游离多糖或外膜蛋白A,结合物中荚膜多糖和外膜蛋白A的质量比为3.89∶1,结合物诱生的特异性IgG,IgG1和IgG2 a抗体滴度均增强,并且与3种血清型肺炎链球菌具有不同程度的交叉反应。结论:证实多糖和蛋白的有效交联,所制备的多糖-蛋白结合物具有良好的免疫原性。

不同剂量肺炎链球菌荚膜多糖与蛋白结合物的免疫原性比较

用肺炎链球菌 19F型、2 3F型的荚膜多糖 (C PS)分别和破伤风类毒素 (TT)蛋白结合 ,制备了两个型别的多糖 蛋白结合物 (19F TT ,2 3F TT)。为探讨结合物的最适免疫剂量 ,以 10 μg多糖和含 1μg、3 μg、9μg、2 7μg多糖的结合物经腹腔免疫NIH小鼠 ,ELISA方法检测小鼠血清中多糖和含不同多糖的结合物所产生的特异性IgG抗体。结果在不同的剂量免疫小鼠后 ,3 μg剂量组在免疫三针后可诱生高浓度的抗体 ,但随着免疫剂量的增加 ,9μg与 2 7μg诱生的抗体浓度较 3 μg诱生的抗体浓度之间并无显著性差异。含多糖 3 μg的 19F型和 2

改进的蒽酮法检测肺炎链球菌荚膜多糖结合物中多糖浓度

目的改进检测肺炎链球菌荚膜多糖结合物中多糖浓度的蒽酮法。方法分别对蒽酮法中蒽酮的浓度和处理温度进行优化,并对改进的方法进行验证和重复性检测。结果适宜的蒽酮浓度为0·3g/300ml,处理温度为40℃,在检测肺炎链球菌多糖结合物原液中的多糖浓度时,标准曲线回归系数高,方法稳定,重现性好。结论改进的蒽酮法可以有效、准确、稳定地检测肺炎链球菌结合物多糖原液中的多糖浓度。

单一内标定量核磁法测定肺炎链球菌多糖抗原中荚膜多糖、C-多糖和磷含量

肺炎糖疫苗在预防由肺炎链球菌引起的肺炎和脑膜炎等疾病中发挥关键作用。荚膜多糖、C-多糖和磷含量是疫苗研发和生产中多糖抗原质量控制的重要指标,研究发展了基于单一内标物六甲基磷酰三胺(hexamethylphosphoramide,HMPA)的定量1H NMR和31P NMR法,实现6A,6B,18C,19A,19F及23F型肺炎链球菌多糖抗原中荚膜多糖、C-多糖和磷含量的同步测定。利用内参物比较法,探究了多糖溶解性质对定量核磁测定的影响,发现定量1H NMR的测定结果受到多糖水溶液黏度和浓度的影响。发现高黏度多糖在3~15 mg/mL,低黏度多糖在5-25 mg/mL是最适检测液浓度范围。该“一内标三定量”NMR法具有良好的精密度、特异性和准确度,为肺炎链球菌疫苗的质量控制提供了一种有价值的新策略。

5型肺炎链球菌荚膜多糖与CRM197蛋白结合疫苗的制备及免疫原性的研究

目的:研制5型肺炎链球菌荚膜多糖(PN5PS)与白喉无毒突变体(CRM197)结合疫苗。方法:采用还原胺化法制备结合物,即以肺炎5型多糖的邻位羟基作为活化位点,用高碘酸钠进行氧化,形成的醛基与CRM197蛋白上的氨基生成席夫碱反应,在氰基硼氢化钠的作用下形成共价结合物,并将制备的结合物与两种不同铝佐剂吸附,用间接ELISA法检测大鼠血清中针对肺炎5型多糖的抗体效价,比较结合疫苗与不同佐剂吸附前后的免疫原性。结果:当多糖活化度为7. 3时,总糖及蛋白的回收率较高,游离糖含量较低,糖蛋白结合比在1. 2~2.7时结合疫苗具有较强的免疫原性,结合比为1. 9时结合疫苗的免疫原性最强;结合物吸附磷酸铝佐剂后所产生的抗体水平略高于氢氧化铝。结论:通过还原胺化法制备的PN5PSCRM197结合疫苗具有较好的免疫原性。

6A型肺炎链球菌荚膜多糖水解物的制备及其结合物在小鼠体内免疫原性研究

目的制备6A型肺炎链球菌荚膜多糖(PS6A)水解物及其结合物,研究结合物在小鼠体内的免疫原性。方法在60℃水解温度下,筛选出PS6A水解适宜的醋酸水解浓度和水解时间。通过水解物和原糖(PS6A)的核磁共振氢谱(1H NMR)和磷谱(31P NMR)比较验证水解物结构的正确性。以1-氰基-4-二甲胺基吡啶四氟硼酸盐(1-Cyano-4-(dimethylamino)pyridinium tetrafluoroborate,CDAP)活化水解物的羟基,并与破伤风类毒素己二酸酰肼衍生物(TTAH)结合,制备结合物PS6A-TTAH;并检测结合物的理化性质。通过抑制ELISA分析原糖、水解物和结合物的抗原性。将小鼠分为2组(PS6A组和PS6A-TTAH组),分别免疫3剂次,用间接ELISA分析原糖和结合物在小鼠体内的免疫原性。结果多糖经0.2 mol/L醋酸60℃水解8 h后,其相对分子质量大小(KD)由0.03升高为0.51,重均相对分子质量(Mw)由8.127×10~5g/mol降为1.175×10~5g/mol。核磁共振结果表明,各特征质子的化学位移相比原糖未发生改变。结合物的游离多糖质量分数为4.55%,游离载体蛋白质质量分数为1.08%。抑制ELISA结果显示,水解物、结合物的抑制曲线与原糖基本吻合。PS6A-TTAH组有剂次加强效应(P分别为0.001、0.004和0.001),其第1~3针免后IgG抗体水平均高于PS6A组,差异均具有统计学意义(P分别为0.001、0.002和0.001)。结论制备的PS6A水解物能有效的保留天然多糖的特异基团,以此水解物制备的结合物在小鼠体内具有良好的免疫应答。

肺炎链球菌18C型糖蛋白结合物的制备及其免疫原性

制备肺炎链球菌 18C型荚膜多糖 破伤风类毒素结合物 (CPS TT) ,测定结合物的理化性质、抗原特异性及其在动物中的免疫原性。结果显示 ,结合物能与相应的多糖和破伤风抗血清形成明显的沉淀线 ,蛋白 /多糖比率为 1.86 ,结合物分子大小 (Kd值 )为 0 .0 5 8。注射小鼠后可诱导明显的抗体应答 ,而且随着注射针次的增加 ,抗体反应水平明显增高 ,显示加强效应。结果表明 ,制备的肺炎链球菌糖蛋白结合物抗原性良好 ,具有胸腺依赖性抗原的特性 。

肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠抗体应答的比较

目的比较肺炎链球菌荚膜多糖-破伤风类毒素结合疫苗两种免疫途径对小鼠的抗体应答。方法选NIH小鼠,分别经皮下和腹腔途径免疫3次同等剂量的结合疫苗,每次间隔2周,用ELISA方法检测两种途径免疫小鼠的血清抗体滴度。结果结合疫苗经腹腔免疫后的抗体滴度优于皮下免疫。小鼠经腹腔免疫3次后,血清抗体的几何平均滴度分别是第1次免疫的6·6倍和3·5倍。结论结合疫苗经腹腔免疫较皮下免疫获得的抗体应答水平高。

发展粘膜免疫B族链球菌荚膜多糖结合物疫苗

育龄妇女直肠和阴道B族链球菌(GBS)带菌是引起新生儿侵袭性感染的最主要原因.有效的疫苗预防应该能够诱导机体产生全身和粘膜局部两方面的免疫力.为了有效地预防新生儿GBS感染的发生,本项目制备了粘膜免疫的B族链球菌荚膜多糖(GBS CPS)结合物疫苗.它应该能够诱导机体产生全身(系统)和粘膜局部两方面的免疫力.

哮喘患儿和非哮喘儿童血中抗肺炎链球菌荚膜多糖IgG水平的差异

目的探讨哮喘患儿对侵袭性肺炎链球菌疾病(IPD)易感性的体液免疫机制。方法收集43例哮喘患儿和20例非哮喘择期手术患儿的血浆标本,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定并比较两组血中抗肺炎链球菌荚膜多糖(PPS)IgG水平。结果哮喘患儿血中抗PPS-14、19A及23F 3种血清型IgG水平均高于非哮喘儿童,差异有统计学意义(P均<0.05);其3型IgG水平达到保护性抗体水平(≥0.2μg/ml)以上的比例均为100%。结论哮喘患儿体内防御IPD的抗PPS-IgG免疫功能正常,但哮喘患儿可能比非哮喘儿童更容易发生肺炎链球菌感染或定植。

硫酸-咔唑微孔板法检测肺炎链球菌荚膜多糖中糖醛酸含量

目的利用微孔板检测肺炎链球菌荚膜多糖中糖醛酸含量,并对该方法进行验证及初步应用。方法以微孔板为反应容器,对常规硫酸-咔唑法的咔唑质量浓度和加热时间进行优化;并对建立的方法进行线性范围、精密度以及准确度的验证及初步应用。结果最佳的咔唑质量浓度为0.10 mg/m L,加热时间为20 min。标准品D-葡萄糖醛酸在4~40μg/m L范围内,其质量浓度与校正后吸光值呈良好的线性关系,r2>0.99;批内及批间CV值分别为1.54%~3.02%及4.53%~7.75%;加入5μg/m L、10μg/m L、20μg/m LD-葡萄糖醛酸的8-160502、9V-160102、22F-160103荚膜多糖,D-葡萄糖醛酸的回收率为92.21%~110.47%。微孔板法校正前与常规方法在测定肺炎链球菌荚膜多糖中糖醛酸含量时差异无统计学意义(P>0.05),与校正后结果差异有统计学意义(P<0.05)。微孔板法测定分子质量分布与常规方法有较好的一致性。结论硫酸-咔唑微孔板法可有效检测肺炎球菌荚膜多糖中糖醛酸含量,操作简便快捷,精密度和准确度良好,可用于肺炎链球菌荚膜多糖疫苗的质量控制。

18C型肺炎球菌荚膜多糖-TT结合物中多糖片段长度对其免疫原性的影响

目的研究18C型肺炎球菌荚膜多糖-破伤风类毒素(TT)结合物中多糖片段的大小对其免疫原性的影响。方法采取乙酸水解多糖,Sephacryl S-300(XK-50)柱纯化多糖片段,ADH法制备结合物,免疫小鼠,检测血清的ELISA抗体滴度、亲和力以及调理吞噬能力。结果得到重复单位数分别为27、25、19、12、10、9和8的多糖片段。与TT制备的结合物在小鼠体内均能诱导产生IgG型抗体,并存在加强免疫效应,表现出T-细胞依赖型抗体免疫反应。随着链长度的缩短,血清GMT有增加的趋势,但只有8RUPn18C-TT与27RUPn18C-TT组之间差异有显著意义。当吞噬率为50%时,血清的稀释倍数分别为35.10、39.60、45.71、104.71、117.00、145.50和478.60。此趋势与抗体滴度呈正相关,但各组间亲和力差异无显著意义。结论较短多糖片段制备的结合物免疫原性高,血清GMT高,调理吞噬能力也强。

衢州市单中心儿童肺炎链球菌感染流行及血清型分布特征研究

目的探讨衢州市儿童肺炎链球菌感染流行及血清型分布特征,为指导该地区的疫苗应用和研发提供依据。方法收集2020年1月至2022年6月衢州市人民医院肺炎链球菌感染患儿的临床资料及不同来源标本中分离的肺炎链球菌,进行系列菌株鉴定实验,并通过乳胶凝集试验、荚膜肿胀试验对所有菌株进行血清型鉴定,分析相关感染性疾病和血清型分布的流行特征。结果共收集到107株肺炎链球菌,除2株不能明确分型外共鉴定出21种血清型,排名前5位的血清型为19F、6B、14、19A和3。肺炎链球菌多糖结合疫苗(PCV)7、PCV13和PCV20的血清型覆盖率分别为56.1%(60/107)、71.0%(76/107)、78.5%(84/107)。肺炎链球菌引起儿童支气管肺炎是主要感染类型,不同PCV覆盖血清型肺炎链球菌引起支气管肺炎病例数的比较表明,PCV7覆盖血清型与非PCV7血清型无明显差异;但PCV13(P=0.008)和PCV20(P=0.002)覆盖血清型明显高于非该类疫苗覆盖血清型引起肺炎病例数。结论引起衢州市儿童肺炎链球菌疾病的主要流行血清型为19F、6B、14、19A和3,其中支气管肺炎为最主要感染类型;PCV13和PCV20对该地区儿童感染肺炎链球菌支气管肺炎有保护力,建立肺炎球菌疾病发病状况的监测系统,针对肺炎链球菌血清型分布和感染性疾病进行长期流行病学监测是非常必要的。

核磁共振氢谱对6群肺炎链球菌荚膜多糖的结构分析

目的对6群型肺炎链球菌荚膜多糖进行结构分析。方法应用分子生物学方法将6群肺炎链球菌分为6A型、6B型、6C型和6D型,提纯其荚膜多糖,并采用核磁共振氢谱(1H NMR)对6群肺炎链球菌荚膜多糖的结构进行分析,比较6A型、6B型、6C型和6D型多糖结构1H NMR谱的端基质子区和环质子区化学位移的差异。结果 6A型谱图中,三个特征质子峰化学位移值分别为δ5.62、δ5.13和δ5.05;6C型谱图中,三个特征质子峰化学位移值分别为δ5.59、δ5.13和δ5.05;6B型谱图中,三个特征质子峰化学位移分别为δ5.62、δ5.17和δ5.15;6D型谱图中,三个特征质子峰化学位移分别为δ5.59、δ5.17和δ5.15。6A、6B、6C和6D型的环质子区(δ4.40~3.30)化学位移表现出不同的位移特性。结论获得6A型、6B型、6C型和6D型肺炎链球菌荚膜多糖1H NMR谱图,其端基质子区和环质子区化学位移存在差异,为荚膜多糖质量控制提供基础。

11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,研究7株11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)。方法根据11群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因设计合成5对特异性引物,以7株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行序列测定及基因序列比对,确定其血清型。多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术分析7株11群肺炎链球菌序列型(ST)。采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和cps基因分别绘制系统发育树。结果根据wcw C、gct和wcj E等3个基因产物确定5株原11A型肺炎链球菌为11A型,无11E型;根据wcwR和gct等2个基因产物确定2株原11B型肺炎链球菌为11B型。获得7株不包括4个合成调控基因(wzg、wzh、wzd和wze)的11群肺炎链球菌cps loci,长度为11～12 kb,11A型具有12个开放式阅读框(ORF),11B型具有11个ORF。5株11A型肺炎链球菌部分cps基因序列差异较大; 2株11B型肺炎链球菌部分cps基因序列相似性高于99%。根据MLST分析发现3种新的ST型。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树和cps基因绘制的系统发育树差异很大。结论从分子水平上确定了11A和11B血清型。获得了5株11A型和2株11B型肺炎链球菌ST型和部分荚膜多糖合成相关基因(cps loci),完善了11群肺炎链球菌的菌种档案。

肺炎链球菌培养及其荚膜多糖的制备

肺炎链球菌荚膜多糖是肺炎疫苗的有效组分,采用自制培养基以15L立瓶和100L发酵罐对流行肺炎链球菌进行培养,探讨其生长和荚膜多糖产生情况.结果表明肺炎链球菌以上述两种方式大量培养均生长良好.采用7～9h的培养物上清液经超滤浓缩,以乙醇沉淀法制备荚膜多糖,所获多糖基本符合《欧洲药典》规定要求.立瓶培养的6B、18C、19F及23F荚膜多糖产量分别达112mg/L、123mg/L、115mg/L及103mg/L,这些数据均高于欧洲专利Yavordios所述72mg/L的产量.用立瓶培养时多糖收量较低的1、5和14型(收量分别为40mg/L、43mg/L及25mg/L)肺炎链球菌进行发酵罐培养的多糖收量与立瓶培养的相似.

肺炎链球菌荚膜多糖加重C57BL/6小鼠中耳炎的炎症应答和中耳组织损伤

目的:研究肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,S.pn)荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)对C57BL/6小鼠急性中耳炎的炎症应答和组织损伤的作用。方法:首先通过同源重组的方式构建TIGR4Δcps菌株,然后经鼓膜穿刺,分别接种5μl/耳的TIGR4和TIGR4Δcps于C57BL/6小鼠的双侧中耳腔,对照组采用相同方法接种等体积无菌磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)。观察小鼠发病情况,分别于感染后1、3、5 d制备中耳组织切片,HE染色观察中耳组织损伤及炎性细胞浸润变化,同时收集中耳灌洗液(middle ear lavage fluids,MELF),检测MELF中细菌载量、炎性细胞数量和细胞因子含量。结果:成功构建了TIGR4Δcps菌株。与TIGR4组相比,TIGR4Δcps组小鼠中耳上皮的损伤更轻,中性粒细胞募集减少(第1天时P=0.004;第3天时P=0.000;第5天时P=0.000),MELF中细胞因子TNF-α和IL-6水平更低(第1天时P=0.076、P=0.000;第3天时P=0.002、P=0.003;第5天时P=0.000、P=0.000),但细菌清除更快(第1天时t=2.659,P=0.029;第3天时t=3.717,P=0.006)。结论:在S.pn TIGR4致小鼠急性中耳炎过程中,CPS具有加重炎症应答和组织损伤,并导致宿主对S.pn的清除减慢的作用。

6群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因的分子生物学研究

目的利用分子生物学方法,对25株6群肺炎链球菌荚膜多糖合成相关基因(cps loci)进行研究。方法采用多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)技术,对25株6群肺炎链球菌进行分型;依据Gen Bank中收录的6群肺炎链球菌cps loci设计合成引物,以25株肺炎链球菌基因组DNA作为模板进行PCR扩增,并对扩增产物进行基因测定及分析;采用相邻合并分析(neighbour-joining analysis),根据MLST的7个管家基因和wciP、wzy、wzx这三个cps loci的代表基因分别绘制出系统发育树。结果根据MLST技术分析发现7株新的ST型菌株。25株6群肺炎链球菌cps loci的G+C含量为35.4%~35.5%,均属于I类;所有6C型wzy基因均有6个碱基的缺失。根据MLST的7个管家基因绘制的系统发育树,并根据cps loci的3个代表基因wciP、wzy和wzx绘制的系统发育树,差异很大。3个代表基因绘制的系统发育树,6C型为进化距离比较远的分枝,6A型和6B型的分枝进化距离相对较近;6D型与6B型在同一分枝内。结论获得了25株6群肺炎链球菌ST型和全长cps loci,完善了6群肺炎链球菌的菌种档案。

1H-NMR用于肺炎链球菌荚膜多糖质量控制的尝试

纯化的6B、18C血清型肺炎链球菌荚膜多糖用生化试验和免疫学试验检测分析后再用一维氢谱核磁共振波谱(1H-NMR)法分析。生化检测其相应多糖的主要化学基团含量是否合格,免疫学检测旨在了解多糖纯化工艺是否影响了多糖的抗原活性,并间接佐证纯化多糖的生化特性是否正确。在此基础上进行1H-NMR分析,可以对纯化多糖的特性有进一步的了解。结果表明,常规的生化检测试验和免疫学检测试验并联合应用1H-NMR分析法后可更好地控制纯化肺炎链球菌荚膜多糖的质量。