肺炎链球菌细胞壁表面粘附相关蛋白的初步鉴定

通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ将肺炎链球菌细胞壁表面蛋白质转移到ＰＶＤＦ膜上，然后与生物素标记的巨噬细胞在膜上进行粘附实验，初步鉴定出六条细胞壁表面粘附相关蛋白，它们的分子量分别是２０、３０、３７、５９、６６、８５ｋＤ，其生物学特性、功能有待进一步研究确定。这为进一步研究肺炎链球菌致病机理，发展新一代多价疫苗和开发抗菌药物奠定了一定的基础。

肺炎链球菌表面粘附素A蛋白抗原表位的预测筛选及确定

【目的】确定肺炎链球菌表面粘附素A(Psa A)蛋白抗原的B细胞、CD4 T细胞和CD8 T细胞表位。【方法】通过生物信息学方法预测肺炎链球菌Psa A蛋白分子小鼠B细胞线性表位、MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)及MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)并人工合成相应肽段;克隆重组质粒BL21/p ET/Psa A并得到纯化的r Psa A蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组和对照组小鼠的血清分别与人工合成的候选B细胞表位肽段进行间接ELISA检测,筛选B细胞表位;分离小鼠脾及淋巴结细胞并分别与人工合成的T细胞候选表位肽段体外共培养,取上清进行双夹心ELISA检测IFN-γ的量进行初步筛选。用初筛到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式检测,确定Psa A蛋白分子T细胞表位。【结果】分析Psa A蛋白分子的B细胞表位及MHC-Ⅰ结合肽、MHC-Ⅱ结合肽;得到候选B细胞表位肽10条,MHC-Ⅰ结合肽21条,MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了r Psa A蛋白并成功免疫了小鼠。间接ELISA结果显示:肽段PB2、PB6,PB7与r Psa A免疫小鼠的血清发生反应,其OD450nm读数比相应的阴性对照小鼠显著升高;双夹心ELISA结果初步提示:肽段PⅠ10、PⅠ14、PⅠ17、PⅠ18、PⅠ21以及肽段PⅡ2、PⅡ5、PⅡ6刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高。细胞流式结果进一步确定:经肽段PⅡ2、PⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性细胞百分比较对照小鼠细胞显著升高;经肽段PⅠ14、PⅠ17、PⅠ21刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性细胞的百分比较对照小鼠细胞显著升高。【结论】确定了肺炎链球菌Psa A蛋白分子的3个B细胞线性表位;2个CD4 T细胞表位;3个CD8 T细胞表位。

肺炎链球菌表面蛋白A多价DNA疫苗交叉免疫保护作用评价

目的评价肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗抵御不同肺炎链球菌来源的异种PspA分子毒力作用的能力。方法以包含PspA抗原Fam1的Clade1亚类和Fam2的Clade3亚类DNA序列的T载体为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增具有高保护性抗体效价和强交叉反应的PspA优势家族亚类PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3片段,克隆至真核载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1-Clade1和pcDNA3.1-Clade3,免疫印迹(Western blot)及逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)检测重组质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达。重组肺炎链球菌PspA多价DNA疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)肌肉注射免疫小鼠,观察免疫小鼠鼻咽部PspA异家族来源的不同肺炎链球菌携带情况改变和腹腔攻击小鼠21d的生存情况。结果成功构建肺炎链球菌PspA优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗。疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)免疫组小鼠鼻咽部携带的PspA异家族来源的不同肺炎链球菌菌落计数无显著性差异(P>0.05),而明显少于空白质粒及PBS对照组小鼠(P<0.01);疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)免疫组小鼠针对PspA异家族来源的不同肺炎链球菌腹腔攻击后中位生存时间无显著差异(P>0.05),而明显长于空白质粒及PBS对照组小鼠(P<0.01)。结论 PspA优势家族亚类PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3的靶抗原组合形式能够有效解决PspA的抗原多样性问题,所构建的肺炎链球菌DNA疫苗有望针对PspA异家族来源的临床肺炎链球菌株感染。

人工合成变形链球菌表面蛋白多肽体外抗粘附实验

目的 :观察一种人工合成变形链球菌表面蛋白多肽体外抗粘附作用。方法 :H3标记细菌羟磷灰石法观察多肽体外抗粘附作用。结果 :对于S .mutansIngbritt和S .sobrinus 6 715 ,1pmol%D 1μmol均有抑制作用 ,抑制作用随多肽浓度增加而增加。多肽浓度在 1μmol有较强抑制作用。 结论 :人工合成变形链球菌表面蛋白多肽具有体外抗粘附 ,降低变形链球菌的粘附于羟磷灰石的作用 ,并且该多肽无直接抑菌作用 ,有可能成为一种新的生物防龋制剂。

钙对变形链球菌MT6R(血清型c)表面蛋白P1粘附的影响

目的 :测定变形链球菌MT6R菌株 (血清型c)表面蛋白P1在钙溶液中对唾液包被的羟磷灰石 (S HA)的粘附量 ,探讨钙对蛋白P1粘附的影响。方法 :将变形链球菌MT6R菌株 (血清型c)表面蛋白P1经13 1碘标记 ,分别测定其在钙浓度为 0、0 1、0 2 5、0 5、1 0、1 5以及 2 0mmol L的溶液中标记物13 1碘 -蛋白P1对唾液包被的羟磷灰石(S HA)的粘附量。结果 :13 1碘 -蛋白P1在不同钙离子浓度的溶液中粘附量不同 (P <0 0 1) ,当钙浓度从 0 1mmol L增加到 1 0mmol L时 ,蛋白P1在S HA上粘附量迅速提高 ;当钙浓度在 1 0～ 2 0mmol L时 ,蛋白P1粘附量增加不明显。结论 :钙参与了变形链球菌MT6R(血清型c)表面蛋白P1对S HA的粘附 。

变链球菌表面蛋白分子结构中粘附功能区的研究

变链球菌表面蛋白与牙面获得性膜上唾液蛋白成份结合,促进了变链球菌在牙面的附着。粘附功能区可能主要位于表面蛋白分子N端包含A区的片段中,亦可能存在于中间区域的P区及附近氨基酸顺序中,但不能排除分子C端参与粘附的可能。对表面蛋白粘附功能区的研究,有助于从分子水平阐明变链球菌在牙面粘附的机理,为龋病的防治提供理论依据。

含C型变形链球菌表面蛋白P_1抗体的唾液膜对两种变形链球菌粘附的影响

用提纯的S．mutansMT6R（遗传Ⅰ型，血清c型）细胞表面蛋白P1加弗氏佐剂通过局部唾液腺和背部皮下注射免疫BALB／C鼠，得到含高效价民抗体的大鼠唾液。用含P1抗体的唾液包被羟磷灰石激珠（HA），观察含在唾液膜中的c型变链P1抗体对S．mutansMT6R和S．sobrinus6715在HA表面粘附的影响。结果发现唾液膜中的P1抗体可明显抑制S．mutansMT6R和S.so－brinus6715在HA表面的粘附（P＜0．05），且抗体对这两种菌的粘附抑制作用无统计学差异（P＞0．05）。提示P1抗体可以抑制S．mutans和S．sobrinus对牙面的粘附和定居．

变形链球菌Ⅰ型Mutans表面蛋白P_1的粘附作用

对变形链球自Ｉ型Ｓ．ｍｕｔａｎｓＭＴ，Ｒ（血清型Ｃ）菌株表面蛋白Ｐ１分离、纯化、鉴定，经１３１Ⅰ标记后，研究其对无龋成人腮腺唾液膜的粘附性，共观察２２例。结果显示，蛋白Ｐ１能直接粘附于唾液膜，在唾液膜上的粘附量显著大于牛血清白蛋白膜和缓冲液处理的羟磷灰石组（Ｐ＜０．０１），提示蛋白Ｐ１可能是变形使球菌遗传Ⅰ型、血清Ｃ型的重要粘附素之一。

肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定

目的探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式。方法分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA’和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply点突变减毒体),免疫印迹(Westernblot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA)。将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’,C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21d生存情况。结果成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01)。结论PspA’联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合。

变形链球菌表面蛋白V区、P区及C末端遗传多态性与龋病发生关系的研究

目的 了解变形链球菌表面蛋白 V区、P区及 C末端遗传多态性与其粘附性能的关系。方法 实验菌株选自本实验室前期工作所获得的粘附力较强和较弱的血清 c型变形链球菌临床分离株 ,提取全菌 DNA ,经PCR分别扩增表面蛋白 V区、P区编码基因 spa P- pv(2 0 6 0～ 315 7bp)、C末端编码基因 spa P- c(4 0 0 3～ 4 85 1bp)后 ,用限制性内切酶 Alu 进行限制性片段长度多态性分析。结果 两组不同粘附力的变形链球菌 (血清 c型 )临床分离株全菌 DNA扩增产物 spa P- pv经 Alu 酶切后 ,出现了两种基因型 a、b。两种基因型在不同粘附力菌株的分布不同 (P<0 .0 5 ) ,a型在低粘附力菌株中的比例高于高粘附力菌株 ,而 b型在高粘附力菌株中的比例高于低粘附力菌株。 spa P- c经 Alu 酶切后 ,共呈现两种基因型 c、d。 d型在高、低粘附力的菌株中各占 1例 ,其分布无统计学差异。结论 spa P-

肺炎链球菌毒力蛋白在侵入性感染中的免疫原性评价

目的观察肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)及肺炎链球菌溶菌素(Ply)激发自然途径感染肺炎链球菌机体保护性体液免疫应答的情况,评价这三种毒力蛋白作为治疗性肺炎链球菌疫苗候选抗原的免疫原性。方法采集侵入性肺炎链球菌感染患者(实验组)及同期确诊为侵入性其它细菌感染患者(对照第一组)和同期确诊为非感染性疾病患者(对照第二组)各36例急性期(第0+3天)及恢复期(第21±3天)血清样本,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中肺炎链球菌3种毒力蛋白抗原特异性抗体IgG水平变化。结果实验组与两组对照组间第(0+3)天血清的3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平无显著性差异(P>0.05)。第一组对照组恢复期较急性期血清中3种毒力蛋白特异性抗体水平无显著变化(P>0.05),而实验组恢复期血清3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平明显高于急性期血清抗体水平8～30倍(P<0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特异性抗体水平升高更明显,血清中针对PspA家族1(PspA-Faml)特异性抗体水平高于针对PspA家族2(PspA-Fam2)的特异性抗体水平(P<0.01)。结论 PsaA,PspA及Ply均为具有免疫原性的肺炎链球菌菌体成分,其中PspA和Ply特异性抗体在人体自然途径的肺炎链球菌感染中发挥更重要的保护性作用,可作为新一代治疗性肺炎链球菌疫苗理想的侯选抗原。

肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定

目的对肺炎链球菌表面蛋白C(PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定。方法根据Gen Bank中Psp C的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析。结果人工合成的Psp C基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30%以上,经两步纯化后纯度达到95%。重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论获得了重组肺炎链球菌蛋白Psp C,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础。

变形链球菌表面蛋白A区遗传多态性的研究

目的:探讨变形链球菌表面蛋白A区遗传多态性与其粘附性能的关系。方法:分别选取本实验室前期工作所获得的粘附能力较强和较弱的血清c型变形链球菌临床分离株,提取全菌DNA,经PCR扩增表面蛋白A区编码基因spaP-a后,用限制性内切酶HaeⅢ进行限制性片段长度多态性分析。结果:经HaeⅢ酶切后,两组血清c型变形链球菌均出现了4种基因型,且4种基因型在两组菌株的构成情况不同。结论:血清c型变形链球菌临床分离的spaP-a具有遗传多态性,粘附能力较强的菌株比粘附能力较弱的菌株具有更明显的异质性。

变形链球菌表面蛋白多肽片段在转基因番茄中的表达

目的在获得含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄原代种子的基础上,应用分子生物学的方法检测外源基因在转基因植株中的表达。方法用CTAB法提取子代番茄总DNA,PCR筛选含变形链球菌PAc基因唾液粘附区片段的转基因番茄子代植株;用Trizol提取番茄总RNA,RT-PCR检测外源基因的转录情况;提取番茄果实总蛋白,用Bradford法测定番茄果实总蛋白含量;通过Western blot检测外源蛋白的表达情况,并用ELISA法对外源蛋白含量进行定量测定。结果获得植物细胞染色体上整合有外源基因并发生表达的转基因番茄子代植株;Western blot和ELISA分析表明含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白,该蛋白含量占番茄可溶性总蛋白的1.2%。结论含编码变形链球菌表面蛋白唾液粘附区片段基因的转基因番茄子代植株能有效表达外源蛋白。

肺炎链球菌重组PrtA蛋白克隆与表达的相关研究

目的构建携带PrtA基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组PrtA融合蛋白。方法根据GenBank中肺炎链球菌表面蛋白细胞壁相关丝氨酸蛋白酶A(PrtA)蛋白基因序列,设计合成了一对特异性引物,扩增目的片段,建立了RT-PCR检测方法。应用RT-RCR方法扩增得到PrtA蛋白基因,并克隆到pMD18-T载体上,筛选、鉴定阳性重组子pMD18-T-PrtA,然后克隆到原核表达载体pET-30a(+)上,经双酶切、PCR鉴定,获得重组表达质粒pET-30a-PrtA。将含有pET-30a-PrtA的重组菌,经终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导后,重组PrtA蛋白获得高效表达。通过Westernblot检测结果,检测表达的重组PrtA蛋白的反应原性。结果所获PrtA基因与GenBank的基因序列同源性为99%;重组质粒经IPTG诱导,不同浓度的IPTG均能诱导重组蛋白表达,且IPTG终浓度为0.6mmol/L时,目的蛋白的表达量最高,约占菌体总蛋白的18%。通过抗-His标签单克隆抗体在IPTG诱导6h的重组菌蛋白中检测到一条大小约为40×103的特异性清晰条带,与预期结果相符,表明表达的蛋白为肺炎链球菌重组PrtA蛋白。结论成功地克隆和表达了肺炎链球菌表面蛋白细胞壁PrtA,为进一步研究以PrtA蛋白作为免疫原预防和治疗由肺炎链球菌引起的疾病奠定基础。

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。

肺炎链球菌疫苗候选抗原PspA异家族亚类间交叉反应评价

目的:观察肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)在临床肺炎链球菌自然感染情况下家族分布及异家族亚类间抗原抗体交叉反应情况,探索肺炎链球菌PspA核酸疫苗的抗原组成形式。方法:采集我院42例临床侵入性肺炎链球菌感染菌株,及患者恢复期(第21±3天)的血清样本,同期确诊为非感染性疾病患者36例血清样本为对照组,细菌基因组特异性PCR及测序比对鉴定PspA家族分布,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应情况。结果:42株肺炎链球菌中以PspA家族Fam1-Clade2(31.0%)和Fam2-Clade3(47.6%)的菌株为优势分布,所有侵入性肺炎链球菌感染患者血清中针对PspA-Fam1特异性抗体水平高于针对PspA-Fam2的特异性抗体水平,血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应发现异家族各亚类间交叉反应弱,但同家族亚类间显著交叉反应以Fam1-Clade1和Fam2-Clade3为优势。结论:肺炎链球菌PspA核酸疫苗靶抗原的组成时应同时包括产生高保护性抗体效价和强交叉反应的Fam1及Fam2的优势Clade亚类成分才能有效针对广泛的临床致病肺炎链球菌菌株感染的保护。

肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价。方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达。与前期构建的肺炎链球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA’核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况。结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA’组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P<0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P<0.01),但是与pcDNA3.1-PspA’组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P>0.05)。小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P<0.01),但与pcDNA3.1-PspA’组比较中位生存时间无显著差异(P>0.05),生存曲线相似。结论:LytA联合PspA’的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA’的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究。

变形链球菌母子传播与其对牙面初始粘附关系的研究

目的:探索变形链球菌母子传播与其对牙面初始粘附能力的关系.方法:首先以AP-PCR检测Mutans streptococci(MS)在20对3～4 岁儿童和母亲之间的传播,并从母亲口腔中筛选出传播株和非传播株;再采用同位素标记法,检测传播株和非传播株对SHA的粘附差异,同时对其表面蛋白粘附功能区spap-a和spap-pv分别用限制性内切酶haeⅢ和AluⅠ进行RFLP分析.结果:传播株较非传播株具有较弱的粘附力 (P<0.01),spap-a和spap-pv经酶切后分别呈现的3 种和2 种基因型在传播和非传播人群的MS中分布不同(P<0.01).结论:初始粘附能力弱的菌株被传播的可能性较大,不同MS株传播能力的差异可能与其表面蛋白A区,PV区的基因多态性有关.