肺炎链球菌表面蛋白A多价DNA疫苗交叉免疫保护作用评价

目的评价肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗抵御不同肺炎链球菌来源的异种PspA分子毒力作用的能力。方法以包含PspA抗原Fam1的Clade1亚类和Fam2的Clade3亚类DNA序列的T载体为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增具有高保护性抗体效价和强交叉反应的PspA优势家族亚类PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3片段,克隆至真核载体pcDNA3.1(+),构建重组质粒pcDNA3.1-Clade1和pcDNA3.1-Clade3,免疫印迹(Western blot)及逆转录聚合酶连反应(RT-PCR)检测重组质粒在哺乳动物细胞BHK-21中的表达。重组肺炎链球菌PspA多价DNA疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)肌肉注射免疫小鼠,观察免疫小鼠鼻咽部PspA异家族来源的不同肺炎链球菌携带情况改变和腹腔攻击小鼠21d的生存情况。结果成功构建肺炎链球菌PspA优势家族亚类抗原的肺炎链球菌多价DNA疫苗。疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)免疫组小鼠鼻咽部携带的PspA异家族来源的不同肺炎链球菌菌落计数无显著性差异(P>0.05),而明显少于空白质粒及PBS对照组小鼠(P<0.01);疫苗(pcDNA3.1-Clade1+pcDNA3.1-Clade3)免疫组小鼠针对PspA异家族来源的不同肺炎链球菌腹腔攻击后中位生存时间无显著差异(P>0.05),而明显长于空白质粒及PBS对照组小鼠(P<0.01)。结论 PspA优势家族亚类PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3的靶抗原组合形式能够有效解决PspA的抗原多样性问题,所构建的肺炎链球菌DNA疫苗有望针对PspA异家族来源的临床肺炎链球菌株感染。

肺炎链球菌表面蛋白 A 的家族Ⅰ不同支系融合蛋白的制备及免疫原性研究

目的：构建肺炎链球菌家族Ⅰ中支系1和2肺炎链球菌表面蛋白A（ PspA）重组融合蛋白，分析融合蛋白的免疫原性。方法 PCR扩增目的基因片段，构建重组质粒并表达，ELISA检测抗体滴度和亲和度，以及抗蛋白血清特异性和免疫交叉性。结果成功构建重组质粒并原核表达。血清中抗体滴度可达到1×10^4，亲和度达到2×10^5，调理吞噬试验阳性，保护试验效果显著。结论肺炎链球菌家族Ⅰ中支系1和2肺炎链球菌表面蛋白A（ PspA）重组融合蛋白具有较高的免疫原性，能够诱导小鼠产生高滴度和高特异性的抗体，具有免疫交叉保护性。

肺炎链球菌表面蛋白A的研究进展

肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,Sp)是儿童社区获得性感染的主要病原菌。目前使用较多的7价结合疫苗及23价肺炎链球菌多糖疫苗在长期使用后会出现血清型替换,这可能会使接种疫苗的受益程度下降。寻找新的候选疫苗是有效预防Sp疾病的重要途径,蛋白质疫苗因此备受关注。本文就近年来研究较多的下一代Sp疫苗的重要的候选蛋白质抗原,肺炎链球菌表面蛋白A(pneumococcal surface protein A,PspA)的研究进展作一简要综述。

肺炎链球菌表面蛋白A的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

目的 原核表达、纯化肺炎链球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A,PspA）,并制备多克隆抗体。方法 应用ANTHEWIN、DNAstar等分子生物学软件,对PspA氨基酸序列进行分析,筛选出抗原表位富集区（第33-109个氨基酸）,选用原核生物偏爱的密码子优化基因序列,化学合成全新的基因序列pspa,插入质粒pGEX-4T-2和pET28a（＋）中,构建重组表达质粒pGEX-4T-2-pspa和pET28a（＋）-pspa,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达。分别纯化带有GST标签和His标签的PspA重组蛋白GST-PspA和His-PspA,以His-PspA作为免疫原,经背部多点免疫新西兰大耳白兔,间接ELISA法检测血清抗体效价,Western blot法检测血清抗体特异性。结果 两种重组表达质粒pGEX-4T-2-pspa和pET28a（＋）-pspa经双酶切鉴定构建正确;表达的两种重组蛋白GST-PspA和His-PspA相对分子质量分别〈为33 000和18 000,均为可溶性表达,纯化后目的蛋白条带均无降解,纯度〈为95%,蛋白浓度分别为2和0.2 mg/ml;制备的兔抗血清效价较高,可达1：200 000,且特异性较好。结论 原核表达并纯化了肺炎链球菌PspA融合蛋白,并制备了特异性良好的高效价兔抗血清,为下一步建立肺炎链球菌快速检测技术奠定了基础。

一株广谱抗肺炎链球菌表面蛋白A单克隆抗体的筛选、制备及鉴定

目的筛选并制备一株广谱的抗肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)的单克隆抗体,并探讨其应用。方法将筛选后的杂交瘤细胞接种于BALB/c小鼠腹腔,制备腹水抗体。经过硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析纯化获得单克隆抗体。SDS-PAGE和Western blot鉴定单克隆抗体,并对其特异性、亚型和体外杀伤活性进行测定。结果获得了一株广谱的识别PspA亚类2、3、4的抗PspA单克隆抗体,对肺炎链球菌的体外杀伤率达40.3%。结论成功制备了能特异性结合PspA的广谱单克隆抗体,具有较强的体外杀伤活性,为肺炎链球菌相关疾病的临床诊断、肺炎链球菌疫苗的质量检定和单克隆抗体药物的进一步研究提供参考。

肺炎链球菌毒力蛋白DNA疫苗优势抗原组合筛选及鉴定

目的探讨肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原联合免疫的优势抗原组合方式。方法分子克隆肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)N端及肺炎链球菌溶血素(Ply)基因序列,构建重组质粒pcDNA3.1-PspA’和pcDNA3.1-PBD(PBD为Ply点突变减毒体),免疫印迹(Westernblot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达(包括前期工作中构建的重组质粒pcDNA3.1-PsaA)。将3种重组基因疫苗以不同方式组合肌肉注射免疫150只BALB/c小鼠(B组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’,C组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PBD,D组:pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PBD,E组:pcDNA3.1-PsaA+pcDNA3.1-PspA’+pcDNA3.1-PBD),检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,观察免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌D39携带改变和D39腹腔攻击小鼠21d生存情况。结果成功构建3种重组真核表达载体,ELISA检测结果显示B组小鼠血清特异性IgG抗体水平与E组相似(P>0.05),均明显高于A、C、D组[A组:对照空质粒组pcDNA3.1(+)]小鼠(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部D39携带菌落计数提示B组小鼠相似于E组小鼠(P>0.05),并明显少于C、D组和阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01),并且D39腹腔攻击小鼠21d生存时间分析亦提示其中位生存时间明显长于C组及阴性对照组(A组和PBS组,P<0.01)。结论PspA’联合PsaA的抗原组合方式具有高效的协同保护效能,可作为肺炎链球菌DNA疫苗的优势候选抗原组合。

肺炎链球菌毒力蛋白在侵入性感染中的免疫原性评价

目的观察肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎链球菌表面黏附素A(PsaA)及肺炎链球菌溶菌素(Ply)激发自然途径感染肺炎链球菌机体保护性体液免疫应答的情况,评价这三种毒力蛋白作为治疗性肺炎链球菌疫苗候选抗原的免疫原性。方法采集侵入性肺炎链球菌感染患者(实验组)及同期确诊为侵入性其它细菌感染患者(对照第一组)和同期确诊为非感染性疾病患者(对照第二组)各36例急性期(第0+3天)及恢复期(第21±3天)血清样本,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清中肺炎链球菌3种毒力蛋白抗原特异性抗体IgG水平变化。结果实验组与两组对照组间第(0+3)天血清的3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平无显著性差异(P>0.05)。第一组对照组恢复期较急性期血清中3种毒力蛋白特异性抗体水平无显著变化(P>0.05),而实验组恢复期血清3种肺炎链球菌毒力蛋白特异性抗体水平明显高于急性期血清抗体水平8～30倍(P<0.01),其中PspA和Ply蛋白抗原特异性抗体水平升高更明显,血清中针对PspA家族1(PspA-Faml)特异性抗体水平高于针对PspA家族2(PspA-Fam2)的特异性抗体水平(P<0.01)。结论 PsaA,PspA及Ply均为具有免疫原性的肺炎链球菌菌体成分,其中PspA和Ply特异性抗体在人体自然途径的肺炎链球菌感染中发挥更重要的保护性作用,可作为新一代治疗性肺炎链球菌疫苗理想的侯选抗原。

肺炎链球菌蛋白PspC的制备与鉴定

目的对肺炎链球菌表面蛋白C(PspC)进行全基因合成、重组表达、纯化制备和鉴定。方法根据Gen Bank中Psp C的基因序列和氨基酸序列,通过密码子优化和全基因合成的方式获得目的蛋白基因,构建无标签、高效重组表达菌株,建立重组蛋白的纯化制备方法,并进行抗原鉴定及免疫原性检测分析。结果人工合成的Psp C基因序列经鉴定与预期一致,目的蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达,表达量在30%以上,经两步纯化后纯度达到95%。重组蛋白能与肺炎链球菌阳性血清产生特异性抗原抗体反应,免疫小鼠后可诱导产生较高水平的蛋白特异性抗体。结论获得了重组肺炎链球菌蛋白Psp C,其具有与天然抗原相似的抗原性和免疫原性,为今后开展疫苗研制、载体蛋白应用等研究奠定基础。

肺炎链球菌融合蛋白疫苗研究进展

肺炎链球菌是一种对人类健康危害较大的条件致病菌,目前其疫苗研究已取得了巨大突破,但既往研究主要集中在荚膜多糖疫苗上,存在诸多局限性。近年来,随着生物学技术及基因工程技术的飞速发展,由肺炎链球菌毒力因子及表面蛋白制作的蛋白疫苗研发迅速。其中,将肺炎链球菌不同的表面蛋白质作为免疫原组分构建的融合蛋白疫苗,极大地增强了疫苗的免疫原性,且已取得一定的试验效果,未来进一步研究将有望取代荚膜多糖疫苗。

肺炎链球菌疫苗候选抗原PspA异家族亚类间交叉反应评价

目的:观察肺炎链球菌DNA疫苗候选抗原肺炎链球菌表面蛋白A(PspA)在临床肺炎链球菌自然感染情况下家族分布及异家族亚类间抗原抗体交叉反应情况,探索肺炎链球菌PspA核酸疫苗的抗原组成形式。方法:采集我院42例临床侵入性肺炎链球菌感染菌株,及患者恢复期(第21±3天)的血清样本,同期确诊为非感染性疾病患者36例血清样本为对照组,细菌基因组特异性PCR及测序比对鉴定PspA家族分布,酶联免疫吸附法(ELISA)检测患者血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应情况。结果:42株肺炎链球菌中以PspA家族Fam1-Clade2(31.0%)和Fam2-Clade3(47.6%)的菌株为优势分布,所有侵入性肺炎链球菌感染患者血清中针对PspA-Fam1特异性抗体水平高于针对PspA-Fam2的特异性抗体水平,血清PspA抗体与PspA蛋白6种亚类抗原的交叉反应发现异家族各亚类间交叉反应弱,但同家族亚类间显著交叉反应以Fam1-Clade1和Fam2-Clade3为优势。结论:肺炎链球菌PspA核酸疫苗靶抗原的组成时应同时包括产生高保护性抗体效价和强交叉反应的Fam1及Fam2的优势Clade亚类成分才能有效针对广泛的临床致病肺炎链球菌菌株感染的保护。

肺炎链球菌溶菌酶作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价

目的:肺炎链球菌溶菌酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase,LytA)作为肺炎链球菌多价核酸疫苗候选抗原的保护效能评价。方法:PCR技术从肺炎链球菌R6标准株扩增LytA基因序列,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-LytA,免疫印迹(western-blot)检测重组质粒在哺乳动物BHK-21细胞中的表达。与前期构建的肺炎链球菌表面蛋白A(Pneumococcal surface protein A,PspA)N端序列基因构建的质粒pcDNA3.1-PspA’核酸疫苗联合或单独肌肉注射免疫BABL/c小鼠,检测各组小鼠血清特异性抗体IgG水平,并观察免疫小鼠肺炎链球菌D39腹腔攻击21d生存情况。结果:ELISA检测发现3组(pcDNA3.1-LytA组,pcDNA3.1-PspA’组,pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组)实验组小鼠特异性IgG水平较空质粒对照组显著升高(P<0.001),pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组小鼠抗LytA特异性抗体IgG水平较pcDNA3.1-LytA组明显升高(P<0.01),但是与pcDNA3.1-PspA’组比较抗PspA特异性抗体IgG水平无显著差异(P>0.05)。小鼠攻击试验提示pcDNA3.1-LytA+pcDNA3.1-PspA’组小鼠中位生存时间较pcDNA3.1-LytA组及空质粒对照组显著延长(P<0.01),但与pcDNA3.1-PspA’组比较中位生存时间无显著差异(P>0.05),生存曲线相似。结论:LytA联合PspA’的肺炎链球菌多价核酸疫苗免疫效能并不优于单一抗原PspA’的肺炎链球菌核酸疫苗,LytA作为肺炎链球菌多价核酸疫苗的优势候选抗原组分之一有待进一步研究。

一种肺炎链球菌重组蛋白PsaA-PspA23原核表达载体的构建及表达

目的优化肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23的同源区序列,阻止该基因的组氨酸标签(His-tag)融合表达,对突变后的目的基因进行表达及鉴定。方法以肺炎疫苗重组蛋白基因Psa A-Psp A23为模板,设计2对具有重叠区的特异性引物,并分别对该重组基因进行扩增,得到Psa A-Psp A2和Psp A3的CDR区(亚类决定区)基因片段。利用重叠延伸PCR(Overlap PCR)技术,将Psa A-Psp A2基因片段和Psp A3的CDR区基因片段连接,得到同源区优化后的基因片段。利用PCR技术扩增同源区优化后的基因片段,使该基因3′末端引入终止密码子,阻止Psa APsp A23基因表达载体上His-tag的融合表达。将得到的片段同源区优化且无His-tag融合表达的目的基因连接至p ET20b载体后,转入大肠埃希菌(E.coli)中进行表达,表达产物进行Western blot分析。结果重组表达质粒p ET20b-Psa A-Psp A23经双酶切和测序鉴定,证明构建正确;转化E.coli中,37℃,IPTG终浓度1 mmol/L诱导5 h,获得可溶性表达的重组蛋白,且无His-tag。结论 Psa A-Psp A23蛋白基因同源区优化及His-tag成功去除,并在原核表达系统E.coli中可溶性表达,可为Psa A-Psp A23蛋白疫苗的进一步研究奠定基础。

减毒沙门菌为载体的PspA优势抗原组合DNA疫苗对肺炎链球菌定植的防御作用评价

目的评价以减毒沙门菌为载体携带PspA不同家族亚类优势抗原的肺炎链球菌DNA疫苗对不同侵袭性肺炎链球菌定植的防御作用,探讨优化肺炎链球菌DNA疫苗增强鼻咽部黏膜免疫的策略。方法应用分子克隆技术,在前期研究基础上,制备携带PspA不同家族亚类优势抗原(PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3)的减毒沙门菌为宿主菌的非抗性基因筛选的真核质粒-宿主致死平衡系统,应用RT-PCR和免疫印迹技术检测优势抗原的表达情况,并在含或不含DAP的SOB培养基中传代培养,抽提质粒PCR检测疫苗携带抗原的稳定性。以PBS为对照,口服免疫接种BABL/c小鼠,ELISA检测鼻咽部sIgA的水平;应用小鼠鼻咽部定植模型检测疫苗对不同侵袭性肺炎链球菌定植的防御作用。结果成功构建出携带PspA不同家族亚类优势抗原(PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3)的减毒沙门菌为宿主菌的非抗性基因筛选的真核质粒-宿主致死平衡系统,且稳定性好;免疫小鼠鼻咽部抗PspA-Fam1-Clade1和PspA-Fam2-Clade3的特异性sIgA的水平显著高于对照组(P<0.01);免疫小鼠鼻咽部肺炎链球菌定植模型的菌落计数较对照组明显减少(P<0.01)。结论以减毒沙门菌为载体携带PspA不同家族亚类优势抗原是增强肺炎链球菌DNA疫苗鼻咽部黏膜免疫的优化策略。

轻型链球菌临床分离株psaA基因敲除株的构建及其毒力影响的初步研究

目的构建轻型链球菌(S.mitis)临床分离株S.mitis008肺炎链球菌表面蛋白A(psaA)基因敲除菌株S.mitis00801,并检测其生长及毒力影响,为进一步分析轻型链球菌属细菌间psaA基因水平转移的功能学意义奠定基础。方法采用长臂同源多聚酶链反应技术(LFH-PCR)构建含红霉素耐药基因(erm)片段及psaA基因上、下游同源序列的连接片段,并转化至S.mitis008中,在含红霉素的平板上筛选psaA基因敲除菌株,并采用PCR鉴定;进一步观察psaA基因敲除株S.mitis00801体外生长情况,并利用小鼠模型观察S.mitis008和S.mitis00801鼻咽部定植能力的差异。结果 PCR结果均证实轻型链球菌psaA基因敲除菌株S.mitis00801构建成功;S.mitis008和S.mitis00801体外生长情况比较无差异;在轻链球菌CBA/n小鼠鼻咽部定植模型中,psaA基因敲除菌株S.mitis00801定植能力较未敲除株S.mitis008明显减少,存在统计学差异(P<0.01)。结论 LFH-PCR技术构建psaA基因敲除菌株S.mitis00801方法切实可行,psaA基因的敲除对细菌的体外生长无影响,但降低了细菌在体内鼻咽部定植的能力。

溶血素的定点突变及与表面蛋白A的表达

目的利用基因定点突变技术扩增Ply突变基因△Ply,基因重组技术构建△Ply与PspA基因的串联融合表达蛋白PspA-△Ply。方法根据肺炎链球菌TIGR4型表面蛋白A和溶血素基因序列设计引物,定点突变法扩增Ply突变基因,PCR法扩增PspA基因。运用基因重组技术构建pET32a-PspA-△Ply表达载体,双酶切与测序验证重组质粒;重组质粒转化入大肠埃希菌BL21(DE3),经不同时间、不同温度、不同浓度IPTG诱导表达融合蛋白,Western免疫印迹鉴定表达产物。结果 Ply突变基因测序证实ply基因的△A146R147碱基成功突变,双酶切与测序证实pET32a-PspA-△Ply构建正确,Western免疫印迹见重组质粒转化菌在120×103现特异性条带。结论成功实现Ply基因的定点突变,构建PspA-△Ply融合蛋白表达载体,为研究新型抗肺炎链球菌蛋白疫苗奠定基础。