罗汉果提取物诱导肺癌细胞A549凋亡的研究

目的探讨罗汉果醇诱导肺癌细胞凋亡的作用及可能的分子机制。方法通过分离、纯化得到罗汉果醇单体,以肺癌细胞A549为对象,采用MTT法检测罗汉果醇对肺癌细胞的抑制作用;利用荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期;以蛋白印迹法检测罗汉果醇对p21、Bcl-2蛋白表达的影响。结果罗汉果醇能抑制肺癌细胞的增殖,具有促进细胞凋亡、阻滞细胞周期的作用;蛋白印迹检测表明,罗汉果醇可以促进p21表达升高,Bcl-2表达下降。结论罗汉果醇通过调节p21、Bcl-2的表达来诱导细胞凋亡和周期阻滞,从而促进肺癌细胞A549的凋亡。

桑黄粗多糖和蛹虫草粗多糖协同增效诱导肺癌细胞A549 S期阻滞及凋亡的研究

通过细胞抑制试验研究桑黄子实体粗多糖与蛹虫草子实体粗多糖混合后的粗多糖对肺癌细胞A549的抑制作用,为利用药用真菌开发抗肿瘤药物提供试验依据。采用MTT法检测0.8 mg/m L的桑黄粗多糖和蛹虫草粗多糖对肺癌细胞A549增殖均有一定的抑制作用,作用48 h后的抑制率分别为32.95%、41.93%;将0.8 mg/m L桑黄粗多糖和0.8 mg/m L蛹虫草粗多糖按1∶1体积比混合的粗多糖则表现出协同增效抑制A549细胞增殖作用,抑制率可达54.71%。用流式细胞计数法测试分析的结果是:0.8 mg/m L蛹虫草粗多糖可影响A549细胞周期各时相的分布,而0.8 mg/m L桑黄粗多糖则对细胞周期无明显作用,但0.8 mg/m L混合粗多糖对A549细胞周期各时相分布的影响显著增强,G0/G1期细胞比率从75.39%±2.49%降低至64.43%±2.12%(P<0.01),S期细胞比率从16.61%±0.87%升高至27.97%±2.82%(P<0.01);混合粗多糖作用48 h后,A549细胞的晚期凋亡率从正常组的1.92%±0.55%提高至20.75%±0.24%,坏死细胞率由正常组的1.88%±0.43%提高至9.64%±0.42%,表现出明显的协同增效诱导A549细胞凋亡的作用。荧光定量PCR检测结果表明,A549细胞分别用0.8mg/m L的桑黄粗多糖和蛹虫草粗多糖及其混合粗多糖处理后,细胞内周期调控相关蛋白基因Cyclin A、CDK4的mRNA转录水平均显著下调,Cyclin D1、CDK2的mRNA转录水平显著上调,凋亡相关基因Bid、Bak、Cyt-C、Caspase3的mRNA转录水平也显著上调。研究结果提示桑黄粗多糖和蛹虫草粗多糖混合使用,具有协同增效抑制肺癌细胞A549增殖的作用,推测其通过调控细胞周期和细胞凋亡相关基因的表达,导致Cyt-C释放及启动caspase级联反应,从而诱导细胞凋亡。

化州柚花挥发油的GC-MS分析及其对肺癌细胞A549增殖、迁移的影响研究

目的:提取化州柚花挥发油,鉴定其成分,并评价其对肺癌细胞A549增殖、迁移的体外抑制作用。方法:采用水蒸气蒸馏法提取化州柚花挥发油;采用气质联用法(GC-MS)分析其化学组成,以峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量;采用MTT法检测其对肺癌细胞A549增殖的抑制作用,计算细胞相对活力和增殖抑制率;采用细胞划痕实验评价其对肺癌细胞A549迁移能力的影响,计算相对迁移面积和迁移抑制率。结果:从100 g化州柚花中提取得到挥发油0.7 g,得率为0.7%。共从中分离得到了46个组分,鉴定了其中35个组分,占总峰面积的96.95%;相对百分含量较高的化合物包括D-柠檬烯(28.43%)、γ-萜品烯(20.74%)、β-月桂烯(11.97%)、芳樟醇(7.41%)等。与空白对照组比较,120 mg/L化州柚花挥发油可显著降低肺癌细胞A549的相对活力(P<0.05),增殖抑制率上升至21.72%;而1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L化州柚花挥发油对肺癌细胞A549的相对活力均无显著影响(P>0.05)。作用24、48 h时,60、120 mg/L化州柚花挥发油可显著缩小肺癌细胞A549的相对迁移面积(P<0.05),迁移抑制率分别为132.46%、125.08%(24 h)和124.54%、124.66%(48 h);而30 mg/L化州柚花挥发油对肺癌细胞A549的相对迁移面积均无显著影响(P>0.05)。结论:GC-MS法可用于鉴定化州柚花挥发油的化学组成。化州柚花挥发油以D-柠檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分为主,对肺癌细胞A549的增殖、迁移能力具有一定的体外抑制作用。

不同组分马尾藻岩藻聚糖硫酸酯对人肺癌细胞A549作用的研究

本研究采用不同组分马尾藻岩藻聚糖硫酸酯（sF）对人肺癌细胞A549细胞的抑制作用进行了研究。根据Mtt比色法检测不同细胞铺板数量及不同质量浓度sF对该细胞生长曲线的影响；不同组分sF在不同时间对该细胞的增殖抑制率；倒置显微镜下观察SF对该细胞形态的影响。研究结果表明，当SF的浓度在1-25mg／mL范围、细胞铺板数量为5×10个／mL时，细胞生长曲线线性良好；各组分sF对人肺癌细胞A549均有抑制作用，其中SF2一R对细胞的抑制效果较强，抑制率为61．06％。

温度对人肺癌细胞A549蛋白质表达的影响

肺癌蛋白质组的研究,有助于阐明其发病机制并对肺癌的防治有益。本文从研究人肺癌细胞热休克蛋白的表达情况出发,通过比较37℃、42℃和45℃培养条件下的人肺癌细胞A549总蛋白质的双向电泳图谱,获得3个温度敏感的差异蛋白点,依次命名为P_1、P_2、P_3。对差异蛋白进行MALDI-TOF-MS分析和采用SWISS-PROT数据库中的Peptident软件检索后,初步鉴定P_1与2种醛酮还原酶家族成员相匹配,P_2可能为一种新蛋白,P_3为锌指蛋白11A。

二冬汤含药血清对肺癌细胞A549的作用研究

目的:研究二冬汤含药血清对肺癌细胞A549的抑制作用、最佳给药方案及诱导细胞凋亡。方法:采用MTT法,观察不同给药天数、不同剂量、不同采血时间、不同培养时间的二冬汤血清对肺癌细胞A549的抑制效应,及应用FITC/PI流式细胞术检测最佳给药方案含药血清对A549细胞的凋亡率。结果:二冬汤含药血清对人肺癌细胞A549具有抑制作用,中剂量组[7.99g/(kg.d)]给药5天、10天,末次给药2h的含药血清与细胞培养48h后的抑制作用最明显,抑制率分别为42.27%和39.67%,与空白血清组比较,差异均有非常显著性意义(P<0.01);但从给药天数以及与肺癌细胞培养时间上来看,与空白血清组比较,差异无显著性意义(P>0.05);FITC/PI双染法显示二冬汤含药血清对A549的凋亡总计为(28.45±0.68)%,与空白血清组(6.75±0.46)%比较,差异有非常显著性意义(P<0.01)。结论:二冬汤最佳给药方案为给药5天,末次给药2h后取血,此时制备的含药血清能诱导细胞发生凋亡。

CIK细胞对人肺癌细胞A549凋亡作用的影响

目的观察细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer cell,CIK)对人肺癌细胞A549凋亡作用的影响,并探讨机制。方法常规方法体外诱导生成CIK细胞,CIK细胞为效应细胞,人肺癌细胞A549为靶细胞,比较观察人肺癌细胞A549的凋亡情况。结果电镜法观察CIK细胞能诱导人肺癌细胞A549出现凋亡的超微结构变化,annexinV/PI流式细胞分析法检测早期凋亡率发现CIK实验组明显高于对照组。结论体外培养的CIK细胞可明显诱导人肺癌细胞A549凋亡。

碳离子辐照对人肺癌细胞A549细胞周期进程的影响

选取对数生长期人肺癌细胞A549接受0—6.0 Gy碳离子照射,用克隆形成法检测细胞的存活率;并于照射后12和24 h收集细胞,用流式细胞术检测细胞周期各时相的细胞百分比,观察不同剂量碳离子辐照对A549细胞周期进程的影响。结果显示:0—6.0 Gy碳离子照射后细胞存活率显著下降;照射后12 h细胞发生G0/G1期阻滞,而照射后24 h,1.0 Gy照射组细胞在G0/G1期阻滞,2.0—6.0 Gy照射组细胞在G2/M期阻滞。上述结果表明,在A549细胞接受碳离子照射后的12和24 h内,1.0 Gy照射可持续激活细胞G1期检查点,而2.0—6.0 Gy碳离子照射后其细胞周期进程是随时间变化的。

秦皮甲素通过抑制Ras/ERK通路诱导人肺癌细胞A549凋亡

目的探讨秦皮甲素通过抑制Ras/ERK通路诱导人肺癌细胞A549凋亡的作用。方法 MTT法检测肺癌细胞A549的增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,分光光度法检测半胱氨酸蛋白酶caspase3、8、9的活性,免疫印迹法检测K-Ras、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)蛋白表达的变化。结果秦皮甲素可抑制人肺癌细胞A549的增殖,IC50值为0.4 mmol/L,并诱导凋亡;caspase3和caspase9表达增强,caspase8表达无明显改变。p-ERK1/2和K-Ras蛋白表达减弱,而ERK1/2蛋白表达无明显变化。结论秦皮甲素通过显著抑制K-Ras的表达和ERK1/2的磷酸化水平诱导人肺癌细胞A549凋亡。

多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶过表达对肺癌细胞A549增殖和凋亡的作用及其机制

目的:探讨多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)过表达对肺癌细胞A549增殖和凋亡的作用及其机制。方法:将A549细胞分为Control组、Vector组和PARP组:Control组不进行转染,Vector组进行空载pcDNA3.1转染,PARP组进行pcDNA3.1-PARP转染。通过CCK-8法检测细胞增殖活性,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Western blot检测细胞凋亡蛋白caspase-3、FAK和FAS蛋白的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测细胞程序性死亡受体1(PD-1)mRNA和细胞程序性死亡配体1(PDL1)mRNA的表达。结果:CCK-8检测结果显示,与Control组和Vector组比较,PARP组细胞数量显著增加(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示,与Control组和Vector组比较,PARP组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);Western blot检测结果显示,与Control组和Vector组比较,PARP组细胞凋亡蛋白caspase-3、FAK和FAS蛋白表达明显降低(P<0.05);qPCR结果显示,与Control组和Vector组比较,PARP组细胞PD-1 mRNA和PD-L1 mRNA的表达明显升高(P<0.05)。进一步的研究表明,细胞转染siPD-1后逆转了p-PARP对细胞增殖的促进作用以及对细胞凋亡的抑制作用。结论:过表达PARP能够提高A549细胞的增殖活性,抑制细胞凋亡,其作用机制可能是通过激活PD-1/PD-L1免疫抑制信号通路来实现的。

PM2.5暴露对肺癌细胞A549自噬和凋亡的影响

目的研究PM2.5暴露对人肺癌细胞A549的自噬影响探讨自噬与凋亡的关联效应。方法 100μg/mL PM2.5分别处理A549细胞0、2、4、12、24 h,采用免疫荧光观察处理PM2.5 24 h对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测PM2.5对肺癌细胞自噬和凋亡重要基因的表达的影响,运用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理细胞进一步明确自噬通路对细胞凋亡的作用。结果细胞自噬标志物LC3-Ⅱ蛋白表达均明显著增强,LC3-Ⅱ/LC3-I比值升高,而凋亡蛋白Bax逐渐下调(均P<0.05);免疫荧光显示,PM2.5组细胞的绿色荧光增强;但运用细胞自噬抑制剂(3-MA)会抑制LC3Ⅱ/LC3I的转化,促进Bax的表达。结论PM2.5可诱导肺癌细胞保护性自噬的发生,抑制自噬能够促进PM2.5对肺癌细胞的凋亡诱导。

反义端粒酶RNA对肺癌细胞A549抑制作用研究

目的探讨反义人端粒酶RNA (humantelomericRNA ,hTR)对肺癌细胞A5 49端粒酶活性和细胞增殖的抑制作用 ,研究以端粒酶为靶的肺癌基因治疗的可能性。方法将端粒酶hTR的cDNA反向插入到逆转录病毒载体 pLXRN中 ,转染包装细胞PT6 7后获得反义hTR重组病毒 ,感染肺癌细胞A5 49。处理前后采用TRAP法检测端粒酶活性 ,光镜观察细胞形态 ,DNA电泳观察凋亡情况。结果作用后端粒酶活性和细胞增殖受到明显抑制 ,并出现明显的细胞凋亡。结论反义hTR对肺癌细胞A5 49端粒酶活性具有明显的抑制作用 ,使肺癌细胞A5 49生长抑制 ,促进细胞凋亡。

重组金属蛋白酶组织抑制因子-3与顺铂联合应用对肺癌细胞A549生长抑制与凋亡的影响

目的探讨重组金属蛋白酶组织抑制因子-3(rhTIMP-3)和顺铂(cis-platinum,DDP)联合应用对肺癌细胞株A549生长和凋亡的影响。方法分别或联合应用不同浓度的rhTIMP-3、DDP作用于A549细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法分析细胞生长抑制作用,流式细胞术测定细胞周期分布和凋亡率。结果 rhTIMP-3与DDP均可抑制A549细胞的增殖,rhTIMP-3作用结果呈时间、浓度依赖性,DDP的作用结果呈浓度依赖性,二者都可以诱导A549细胞凋亡。rhTIMP-3使细胞阻滞在S和G2/M期,DDP可造成细胞S期的阻滞,当两者联合应用时对A549细胞的生长抑制作用明显加强,对诱导凋亡有明显协同作用。结论 rhTIMP-3、DDP均可抑制A549细胞的增殖,并可诱导其凋亡;二者联合应用不仅能增加细胞生长的抑制作用,而且有协同诱导细胞凋亡作用。

靶向MDM2反义寡核苷酸增强肺癌细胞A549的辐射敏感性

放射治疗在肺癌的治疗中起着重要的作用。然而,提高肺癌的治愈率是一个重要的课题。MDM2基因在肿瘤的形成和增殖过程中起着重要的作用,可能是一个重要的靶基因。本研究自行设计了针对MDM2的反义核酸药物,通过RT-PCR和Westernblotting检测其抑制效率,然后通过流式细胞仪观察转染细胞受5Gy照射后的细胞死亡情况,MTT观察细胞照射后的增殖能力。结果发现通过反义治疗的策略成功降低了MDM2在肺癌细胞中A549中的表达,这导致了A549细胞辐射敏感性的增加。表明MDM2参与了A549的辐射抗性的形成,靶向MDM2的反义寡核苷酸可以增强肺癌细胞A549的辐射敏感性。

抗氧化肽对人肺癌细胞A549,红细胞和肝组织氧化性损伤的抑制作用

研究了抗氧化肽A对人肺癌细胞A549,红细胞溶血和肝组织氧化性损伤的抑制作用。结果表明抗氧化肽A能够有效地抑制体外培养的人肺癌细胞A549的增殖,同时也能抑制红细胞的溶血和肝组织氧化性损伤的发生。

养肺控瘤方通过Beclin-1促进自噬并抑制肺癌细胞A549转移

目的研究养肺控瘤方(yangfeikongliu formula,YKF)在肺癌A549细胞自噬和转移中的作用。方法大鼠的YKF的给药剂量将通过对人体临床的剂量换算后得出,给大鼠灌服人体等效剂量的5倍、10倍和15倍的YKF,并收集它们的血液以制备5×、10×和15×的含药血清。使用含有10%YKF含药血清的培养基对A549细胞进行培养。通过电子显微镜、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例和自噬流串联mRFP-GFP-LC3来评估A549细胞自噬情况。通过Transwell测定法评估细胞迁移和侵袭,并使用CCK-8测定细胞活性。结果3种剂量YKF含药血清均抑制了肿瘤细胞活性,增加了A549细胞的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值和p62及Beclin-1表达水平,表明YKF可促进A549细胞自噬死亡。支持本结果的指标为,5×YKF含药血清诱导的LC3点状点的增加在3-MA抑制自噬后被消除。此外,研究观察到沉默Beclin-1可以废除YKF诱导的LC3Ⅱ/Ⅰ比值和p62表达的增加,以及细胞活性、迁移和侵袭的减少。结论养肺控瘤方具有促进肺癌细胞A549自噬和抑制转移的抗肿瘤活性,且Beclin-1是其抗肿瘤活性的关键分子。

MERS-CoV调控非小细胞肺癌细胞A549补体系统抑制因子C4BPA的机制

目的探讨关于中东呼吸综合征-冠状病毒(middle east respiratory syndrome-coronavirus,MERS-CoV)调控非小细胞肺癌细胞A549补体系统抑制因子补体成分4结合蛋白Alpha(complement component 4 binding protein alpha,C4BPA)的机制。方法以是否MERS-CoV感染非小细胞肺癌细胞A549分为感染组和对照组,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹和实时荧光定量PCR(qPCR)分别检测2组细胞C4BPA的蛋白和mRNA表达情况。TargetScanHuman预测与C4BPA结合的miRNA,实时荧光定量PCR和荧光素酶报告试验确定靶向C4BPA的miRNA。在MERS-CoV感染的情况下,过表达或敲低靶向C4BPA的miRNA,ELISA或qPCR检测C4BPA的表达和分泌情况。同时分析人肺成纤维细胞和小鼠感染MERS-CoV后,C4BPA和miR-451b的表达情况。结果非小细胞肺癌细胞A549感染MERS-CoV后,其分泌的C4BPA增加(P<0.05)。通过TargetScanHuman在线分析和qPCR发现MERS-CoV抑制非小细胞肺癌细胞A549 miR-451b的表达(P<0.05),并且miR-451b靶向C4BPA的3‘UTR(P<0.05)。过表达miR-451b后,C4BPA的表达和分泌受到抑制(P<0.05)。敲低miR-451b后,C4BPA的表达和分泌受到促进(P<0.05)。同时,MERS-CoV感染人肺成纤维细胞和小鼠后,miR-451b的表达受到抑制(P<0.05),C4BPA的表达增强。并且,MERSCoV感染引起的C4BPA增多能够抑制补体经典系统的溶血活性。结论MERS-CoV通过下调miR-451b促进C4BPA的分泌。

蚓激酶抗肺癌细胞A549增殖作用及其机制

目的研究蚓激酶对肺癌细胞A549的增殖及细胞周期的影响,初步探讨蚓激酶抗肺癌的作用机制。方法通过MTT法检测不同浓度的蚓激酶作用于A549细胞24 h后对细胞增殖的影响;通过显微镜观察细胞形态变化;流式细胞仪检测蚓激酶对A549的细胞周期阻滞情况;RT-PCR检测蚓激酶对P53基因表达影响。结果蚓激酶对A549有明显抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性,其半数抑制浓度(IC50)为(54.35±2.112)U/mL;A549经蚓激酶作用后形态变化显著,细胞边缘皱缩,漂浮细胞的数目随着药物浓度的增高而增大;蚓激酶阻滞A549细胞周期于S期;RT-PCR检测表明,蚓激酶能明显上调P53基因的表达。结论蚓激酶在体外能明显抑制肺癌细胞A549的增殖,并阻滞细胞周期于S期,其机制可能与上调P53基因表达有关。

丁酸钠至少部分通过NF-Y依赖的TXNIP表达诱导人肺癌细胞A549死亡

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)抑制剂丁酸钠调节细胞分化、增殖和抑制肿瘤发生。硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)通过负性调控硫氧还蛋白的活性,调控细胞内的氧化还原平衡,抑制细胞生长。本研究证明,丁酸钠可通过激活依赖于转录因子NF-Y的TXNIP表达,诱导人非小细胞肺癌细胞A549死亡。MTT法显示,5 mmol/L丁酸钠处理A549细胞72 h可显著诱导其死亡;流式细胞分析发现,其中大部分细胞以凋亡形式死亡。表达芯片分析表明,在丁酸钠处理的A549细胞中,TXNIP的mRNA水平显著提高30~50倍;实时定量PCR、免疫细胞化学和蛋白质印迹结果进一步证明,丁酸钠可显著上调TXNIP表达。荧光素酶报告基因分析证明,与对照细胞比较,丁酸钠刺激的细胞内报告酶活性可提高约10倍,提示丁酸钠可激活TXNIP启动子的转录活性。TXNIP启动子删除突变分析显示,删除NF-Y结合的DNA序列显著降低丁酸钠对TXNIP启动子的激活能力,表明NF-Y转录因子参与丁酸钠介导的TXNIP基因转录激活。为分析TXNIP在A549细胞中的定位和部分功能,在A549细胞中过表达GFP-TXNIP融合蛋白及其截短突变体融合蛋白;结果显示,野生型和保留N端1-281aa的截短突变体定位在细胞核,而删除N端1-200aa时,其定位在细胞核和细胞质,提示N端1-200aa可调节该蛋白质的定位。然而,丁酸钠刺激未发现表达的GFP-TXNIP在细胞内定位改变。以上结果表明,丁酸钠可通过激活转录因子NF-YC依赖的TXNIP激活,诱导A549细胞死亡,但不能改变TXNIP蛋白在细胞内的定位。上述结果还提示,TXNIP的N端1-200aa可能在调节TXNIP的细胞定位中发挥作用。是否丁酸钠刺激TXNIP表达导致的细胞死亡系通过改变细胞氧化压力,以及TXNIP在细胞中定位的详尽调节机制尚待进一步研究证明。

基于内吞作用途径的三叶青黄酮抗肺癌细胞A549的miRNA调控作用

目的:探讨三叶青黄酮抑制肺癌细胞A549增殖、侵袭及诱导凋亡的机理。方法:通过miRNAseq结合生物信息学技术,分析三叶青黄酮处理肺癌细胞A549后细胞miRNA参与调控增殖抑制、侵袭抑制和凋亡诱导的作用途径。结果:三叶青黄酮处理肺癌细胞A549后,差异表达已知miRNA靶基因KEGG聚类分析显示细胞内吞作用途径显著富集,且该途径中靶基因与肿瘤细胞发生与发展存在密切关系。结论:基于内吞作用途径的miRNA调控作用是三叶青黄酮抑制肺癌细胞A549增殖和侵袭及诱导凋亡的重要机理之一。