n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1在人肺癌细胞H460内的表达

n-3多不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat-1来自于秀丽线虫(C.elegans)。为检测该基因在人肺癌细胞H460中的表达效果,本项研究构建了哺乳动物表达载体pcDNA3.1(+)myc-HisA-fat-1,以Xfet polymer介导法转染到人肺癌细胞H460中,RT-PCR检测到有效的异源基因表达,MTT法证实基因表达能有效地抑制肺癌细胞的增殖率(P<0.05),气相色谱分析基因表达前后细胞中n-6/n-3多不饱和脂肪酸比例降低(P<0.05),为将该基因用于癌症的转基因治疗奠定了基础。

血管性血友病因子、整合素β_3在人肺癌细胞H460中的表达及其与肿瘤转移的相关性

背景与目的:血管性血友病因子(von Willebr and factor,vWF)、整合素β3(integrinβ3)与肿瘤转移的机制目前研究不清楚。本研究目的是观察vWF与integrinβ3在人肺癌细胞H460中的表达,人肺癌细胞H460与vWF黏附的关系,两因子与肿瘤轻移的相关性及vWF与integrinβ3的相互关系。方法:①应用免疫组化技术观察vWF及integrinβ3在人肺癌细胞株H460的表达;②联合应用vWF黏附实验、抗体抑制实验及MTT法,观察vWF及integrinβ3与人肺癌细胞H460的黏附,及vWF与integrinβ3的相互关系。结果:①免疫组化结果显示H460细胞均表达vWF及integrinβ3。②vWF可以与H460细胞黏附,Anti-integrinβ3抑制后这种黏附降低,A值由1.59±0.06降到0.55±0.03,(P=0.01619),Anti-vWF抑制后这种黏附也降低,A值由1.60±0.06降到0.54±0.03,(P=0.01598),两者抑制黏附效果相同。结论:H460细胞表达vWF及integrinβ3,vWF可以与H460细胞黏附,vWF可能通过与integrinβ3结合发挥黏附作用,从而促进肿瘤细胞转移。

重楼皂苷Ⅶ抑制肺癌H460细胞增殖和迁移能力研究

为研究重楼皂苷Ⅶ(polyphyllin Ⅶ)抑制人肺癌H460细胞增殖、迁移能力和诱导凋亡的作用和机制。本实验采用MTT法检测重楼皂苷Ⅶ处理后H460细胞生长抑制率,Hoechst 33258染色观察细胞形态,细胞集落形成实验考察细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell小室实验研究H460细胞迁移和侵袭能力的改变,并通过western blot法检测在重楼皂苷Ⅶ处理前后细胞蛋白表达变化情况。结果发现,重楼皂苷Ⅶ可显著抑制H460细胞增殖,影响其集落形成,并使细胞形态发生变化,抑制细胞体外的迁移和侵袭能力,并可诱导凋亡的发生。重楼皂苷Ⅶ处理后,H460细胞中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9显著降低,凋亡相关蛋白剪切型caspase-3、Bax表达增加,ICAD、Bcl-2表达降低,提示重楼皂苷Ⅶ体外可能通过调节基质金属蛋白酶抑制H460细胞迁移和侵袭,同时诱导凋亡的发生。

非类固醇类抗炎药NS398对肺癌H460细胞MT1-MMP表达的影响

目的:探讨非类固醇类抗炎药NS398对肺癌H460细胞增殖及其膜型基质金属蛋白酶-1(mem-brane type 1-matrix metalloproteinase,MT1-MMP)表达的影响。方法:应用MTT法检测细胞生长抑制率,免疫荧光法检测MT1-MMP蛋白质表达,酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA)检测细胞培养液中活性基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2,MMP-2)的浓度。结果:NS398可抑制H460细胞的增殖及MT1-MMP蛋白质的表达,减少H460细胞培养液中活性型MMP-2的含量,并呈剂量依赖关系。结论:NS398可能通过抑制肺癌细胞MT1-MMP表达及MMP-2的激活而抑制肺癌细胞的侵袭转移。

黄芩苷对肺癌H460细胞生物学特性及Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的探讨中药单体黄芩苷对人肺癌H460细胞增殖、凋亡、上皮间质转化(EMT)、侵袭和迁移生物学特性及Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测不同浓度的黄芩苷对H460细胞细胞增殖的影响,并计算半数抑制浓度(IC50)。通过流式细胞术检测黄芩苷对H460细胞凋亡的影响,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中上皮性钙黏附素(E-cadherin)、神经性钙黏附素(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)基因表达量,划痕实验检测黄芩苷对H460细胞迁移能力的影响,Transwell实验检测黄芩苷对H460细胞侵袭能力的影响,Western印迹检测H460细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及Wnt/β-catenin信号通路Wnt1、β-连环蛋白(β-catenin)等关键蛋白表达情况。结果黄芩苷可抑制H460细胞增殖,且呈浓度依赖性关系,对H460细胞的IC50为(188.1±11.52)μmol/L;黄芩苷以浓度依赖性促进H460细胞凋亡,抑制H460细胞侵袭和迁移;qRT-PCR结果发现黄芩苷能够促进H460细胞中E-cadherin基因表达,抑制N-cadherin和Vimentin基因表达;黄芩苷可下调PCNA、MMP-2和MMP-9蛋白表达,上调Bax蛋白表达,且能够抑制Wnt/β-catenin信号通路中Wnt1和β-catenin蛋白表达。结论黄芩苷可抑制人肺癌H460细胞增殖、EMT、侵袭和迁移,促进细胞凋亡,该过程的分子机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。

单核细胞与肺癌H460细胞及肺成纤维细胞三维立体混合培养IL-1β与TNF-α的表达

目的:探讨外周血单核细胞和肺癌H460细胞及肺成纤维细胞相互作用对产生IL-1β与TNF-α的影响。方法:三维胶原立体培养条件下,分为单核细胞、H460细胞、肺成纤维细胞单独培养组,单核细胞和H460细胞共同培养组,单核细胞和肺成纤维细胞共同培养组,H460细胞和肺成纤维细胞共同培养组,单核细胞、H460细胞和肺成纤维细胞共同培养组。培养24、72、96h,收集上清液,用酶联免疫法检测不同时间点各组IL-1β与TNF-α的含量。结果:各组细胞在三维立体胶原培养条件下生长良好,单独培养时,仅单核细胞组分泌少量IL-1β和TNF-α,而H460细胞组、肺成纤维细胞组没有检测到IL-1β和TNF-α。单核细胞和H460细胞共同培养组分泌IL-1β与TNF-α量增高,单核细胞和肺成纤维细胞共同培养组分泌IL-1β与TNF-α量也有轻微增高,而H460细胞和肺成纤维细胞共同培养组仅检测到少量IL-1β与TNF-α的表达,单核细胞、H460细胞和肺成纤维细胞共同培养组分泌IL-1β与TNF-α量明显高于其它组。结论:单核细胞和肺癌H460细胞及肺成纤维细胞相互作用可以促进IL-1β与TNF-α的表达。

秦皮乙素对人肺癌H460细胞体外增殖与凋亡的影响

目的探讨秦皮乙素对人肺癌H460细胞体外增殖与凋亡的影响。方法将体外培养人肺癌H460细胞分为4组:空白对照组、秦皮乙素0.2 mg/ml组、秦皮乙素0.4 mg/ml组、秦皮乙素0.8 mg/ml组。给药干预48 h后,MTT法观察细胞增殖抑制率;流式细胞仪分析细胞凋亡率和周期;比色法检测Caspase-3的活性。结果不同浓度的秦皮乙素均能抑制人肺癌细胞H460的体外增殖,并使细胞阻滞于S期,Caspase-3的活性上升,上述结果均呈剂量依赖性。结论秦皮乙素能抑制人肺癌H460细胞的体外增殖,并能诱导H460细胞的凋亡,具有良好的抗肿瘤作用。

二氢青蒿素对肺癌H460细胞放疗敏感性及miR-219a-5p、CD164表达的影响

目的:探讨二氢青蒿素对肺癌H460细胞放疗敏感性及微小RNA-219a-5p(miR-219a-5p)、钙黏蛋白164(CD164)表达的影响。方法:CCK-8法检测不同浓度(0.01,0.1,1,10,100μmol·L^(-1))二氢青蒿素处理的肺癌H460细胞的增殖抑制率,将肺癌H460细胞设为4组:空白对照组、单纯放疗组、二氢青蒿素组和二氢青蒿素+放疗组,其中空白对照组不进行处理;单纯放疗组采用X射线照射源进行一次性照射,照射剂量为5 Gy,剂量率为1 Gy·min^(-1);二氢青蒿素组加入23.74μmol·L^(-1)二氢青蒿素的培养基;二氢青蒿素+放疗组加入23.74μmol·L^(-1)二氢青蒿素的培养基并采用照射剂量为5 Gy,剂量率为1 Gy·min^(-1)的X射线照射;CCK-8检测细胞增殖活性,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布情况,实时荧光定量PCR法检测细胞miR-219a-5p、CD164 mRNA表达水平,蛋白免疫印迹法检测细胞CD164蛋白表达水平。结果:随着二氢青蒿素浓度的升高,肺癌H460细胞增殖抑制率逐渐升高(P<0.05);与空白对照组比较,单纯放疗组、二氢青蒿素组、二氢青蒿素+放疗组肺癌H460细胞吸光度(A)值、细胞增殖率、S期比例、CD164 mRNA和蛋白表达水平降低,凋亡率、G0/G1期比例、G2/M期比例、miR-219a-5p表达水平升高(P<0.05);与单纯放疗组和二氢青蒿素组比较,二氢青蒿素+放疗组肺癌H460细胞A值、胞增殖率、S期比例、CD164 mRNA和蛋白表达水平降低,凋亡率、G0/G1期比例、G2/M期比例、miR-219a-5p表达水平升高(P<0.05)。结论:二氢青蒿素能够增强肺癌细胞系H460的放疗敏感性,这可能与其通过促进miR-219a-5p的表达来抑制CD164的活性有关。

可替宁对穿孔素/粒酶B诱导的NCI-H460肺癌细胞凋亡的抑制作用

目的探讨可替宁对穿孔素/粒酶B(perforin/granzyme B)诱导的NCI-H460非小细胞肺癌细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法以人肺癌细胞株NCI-H460为研究对象,采用四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)比色检测细胞生长增殖活性,吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染荧光显微镜下观察细胞凋亡形态学变化,异硫氰酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)染色后流式细胞仪定量检测细胞凋亡率,RT-PCR及Western blot法检测凋亡抑制蛋白XIAP及Survivin的表达量。结果 (1)不同浓度可替宁单独作用NCI-H460细胞时未见明显诱导凋亡现象,可显著抑制细胞生长,其抑制率与作用时间和剂量呈正相关。(2)0.25μg/ml浓度穿孔素作用NCI-H460细胞(1×106个)时,PI染核率可达到90%以上。而当加入1.5μl粒酶B(1μg/ml)孵育6h时,穿孔素/粒酶B组细胞可呈现90%以上的凋亡现象。(3)166ng/ml浓度可替宁作用穿孔素/粒酶B预处理的细胞6h时可见明显凋亡抑制现象,当检测其凋亡抑制蛋白XIAP、survivin表达量时,发现穿孔素/粒酶B组表达量明显降低,可替宁组表达量较高,而当可替宁联合穿孔素/粒酶B时表达量最高。结论可替宁可明显抑制穿孔素/粒酶B诱导的NCI-H460肺癌细胞凋亡现象,这种作用可能与凋亡抑制蛋白XIAP、survivin的表达上调有关。

全反式维甲酸对非小细胞肺癌侵袭转移的干预作用

目的:采用肺癌H460细胞三维立体培养技术,直接观察全反式维甲酸对肺的主要成分之一胶原组织降解的干预作用。方法:在肺癌H460细胞三维立体培养过程中加入细胞因子(TNF-α和IL-1β)来诱导MMPs的表达,同时加入RA干预MMPs的表达;用明胶酶谱法测定MMP-2、MMP-9,同时在培养5天后测定胶原含量大小。结果:TNF-α和IL-1β诱导培养在立体胶原内的肺癌H460细胞产生大量MMP-2和MMP-9,并促进其的活化,引起大量胶原降解(P<0.05),RA抑制了MMP-2及MMP-9的表达及活化,进而抑制了胶原的降解,对抗了细胞因子(TNF-α和IL-1β)对胶原的降解作用。结论:炎性介质(TNF-α和IL-1β)可促进MMPs的表达,肺内的胶原可以被基质金属蛋白酶分解,这一作用可以使肺癌的侵袭或转移能力得到加强;全反式维甲酸(ATRA)通过抑制MMPs的表达与活化对抗MMPs对肺组织的破坏作用,进而抑制了肺癌的侵袭与转移。

银莲花素A对非小细胞肺癌H460的抑制作用

通过溶剂萃取与重结晶等方法从银莲花属植物多被银莲花Anemone raddeana Regel根茎中提取三萜皂苷银莲花素A,研究银莲花素A对非小细胞肺癌H460癌细胞的增殖、凋亡与细胞周期的影响及分子机制.结果表明:银莲花素A能显著地抑制H460癌细胞的增殖,且这种抑制效应呈明显的时间量效关系;能诱导H460癌细胞凋亡,并诱导其细胞周期阻滞于G2-M期;能抑制Akt激酶活性、下调Bcl-2蛋白表达以及激活PARP活性,从而导致其对H460癌细胞的增殖抑制作用.结果显示银莲花素A对非小细胞肺癌的预防与治疗可能具有潜在价值.

非类固醇类抗炎药NS398对肺癌H460细胞RECK及MT1-MMP表达的影响

目的 探讨非类固醇类抗炎药 NS398对肺癌 H460细胞增殖及其 Kazal基序逆向诱导 半胱氨酸丰富蛋白 （RECK）及膜型基质金属蛋白酶1 （MT1-MMP）表达的影响。方法 应用 MTT 方法检测 H460细胞生长的抑制率,用免疫荧光法、Westernblot法检测 RECK 及 MT1-MMP蛋白的 表达。结果 NS398可抑制 H460细胞的增殖,促进 RECK 蛋白的表达,减少 MT1-MMP 蛋白的含 量,并呈剂量依赖关系。结论 NS398可通过促进肺癌细胞 RECK 的表达并减少 MT1-MMP的含量, 进而抑制肺癌 H460细胞的生长,这可能是肺癌侵袭转移的一个重要机制。

miR-645调控干扰素诱导蛋白2对肺癌细胞增殖和侵袭的作用及机制

目的探讨miR-645对干扰素诱导蛋白2(interferon inducible protein 2, IFIT2)的表达以及对肺癌细胞增殖、侵袭的影响。方法采用反转录PCR法检测肺癌组织和细胞以及配对的正常组织和细胞中miR-645相对表达量。对数生长期人肺癌细胞H460分为对照组和转染组,分别转染NC mimic和miR-645 mimic,采用CCK-8法检测2组细胞增殖率,采用Transwell小室实验检测2组细胞侵袭率;采用荧光素酶报告基因实验检测2组细胞miR-645和IFIT2的结合活性;采用反转录PCR法检测2组细胞miR-645和IFIT2 mRNA相对表达量。结果肺癌组织(3.25±0.25)和肺癌细胞(2.85±0.22)miR-645相对表达量均高于正常肺组织(1.00±0.12)和正常肺上皮细胞(1.00±0.08)(P<0.05);转染组细胞增殖率[(220±12)%]、细胞侵袭率[(65.6±5.2)%]均高于对照组[(100±8)%、(25.9±3.2)%](P<0.05);转染组野生型3’UTR(WT-IFIT2)相对荧光素酶活性(0.48±0.06)低于对照组(1.00±0.12)(P<0.05),突变型3’UTR(MUT-IFIT2)相对荧光素酶活性(1.12±0.09)与对照组(1.00±0.08)比较差异无统计学意义(P>0.050);转染组细胞IFIT2 mRNA相对表达量(0.32±0.05)低于对照组(1.00±0.10)(P<0.05),miR-645在肺癌细胞中表达水平与IFIT2呈负相关(r=-0.743,P<0.001)。结论 miR-645可促进肺癌细胞H460的增殖和侵袭,其作用机制是通过调控IFIT2的表达而实现。