肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白的筛选及验证

目的筛选肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis related protein 1,LCMR1)的相互作用蛋白并进行验证。方法以人肺癌95D细胞RNA作为模板,构建95D细胞c DNA文库。将LCMR1质粒及人肺癌95D细胞c DNA文库共转化酵母菌AH109,初步筛选LCMR1相互作用蛋白。应用融合蛋白沉降技术和免疫共沉淀技术对酵母双杂交结果进行验证,确定蛋白质相互作用。结果成功构建了人肺癌95D细胞的c DNA文库。应用酵母双杂交技术筛选出6种LCMR1相互作用蛋白,选取其中DEK原癌基因进行验证。使用融合蛋白沉降技术及免疫共沉淀技术证实,LCMR1蛋白与DEK蛋白在体外及细胞内均可以特异结合,特异结合发生在DEK蛋白N端功能区。结论 LCMR1与DEK为相互作用蛋白,DEK蛋白N端功能区与细胞凋亡密切相关,为LCMR1基因功能研究提供线索和相应分子基础。

酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与肺癌转移相关蛋白作用的蛋白

目的采用酵母双杂交系统从人肝cDNA文库筛选肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)的相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1功能提供线索。方法构建酵母双杂交诱饵质粒(pGBKT7-LCMR1),转化至AH109感受态酵母菌,在融合蛋白表达、自激活活性及宿主毒性检测后,应用酵母双杂交筛选与LCMR1相互作用的蛋白。除去阳性克隆中多余质粒后,用PCR和酶切方法减少重复克隆,并经共转化重复检测相互作用后得到真阳性克隆。对真阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果成功构建pGBKT7-LCMR1诱饵质粒,融合蛋白成功表达且无自激活和毒性作用。初步筛选获得72个阳性克隆,去除多余质粒、经共转化重复验证后,得到阳性克隆14个。经基因和蛋白质测序得到编码序列7个:核糖体蛋白L29、核糖体蛋白S15a、铁调素抗菌肽、补体C3、线粒体ND4L、线粒体ND1、细胞色素P450,其余7个为非编码序列。结论利用酵母双杂交技术在人肝cDNA文库中成功筛选出与LCMR1相互作用的蛋白7个,为进一步研究LCMR1功能提供了新线索。

人肺癌转移相关蛋白1重组慢病毒载体的构建和病毒包装及其鉴定

目的构建人肺癌转移相关蛋白1（LCMR1）重组慢病毒载体，并包装慢病毒颗粒，为进一步研究该基因在人肺癌发生发展中的功能提供实验基础。方法将人肺癌转移相关基因LCMR1扩增后，酶切连接构建人pLVX—IRES—Neo病毒载体，转化DH5a大肠杆菌，挑取阳性克隆测序鉴定，将重组质粒与慢病毒系统一起转染Lenti—X293T病毒包装细胞，并将收集的病毒感染肺癌细胞系95C，即时定量聚合酶链反应（q—PCR）及蛋白质印迹法验证其表达情况。结果DNA测序结果证实成功构建人LCMR1重组慢病毒载体，包装后的病毒浓缩液浓度可达2．5×10^8IFU／ml以上。包装后的病毒颗粒感染95C细胞系，LCMR1的mRNA水平提高9．98倍（P〈0．05），蛋白水平的表达也明显增强。结论本研究成功构建了pLVX—IRES—LCMR1-Neo慢病毒载体，获得的慢病毒颗粒有效感染肺癌细胞系95C，为研究该基因在肺癌中的功能建立了模型。

应用合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1多克隆抗体的研究

目的应用人工合成多肽技术制备肺癌转移相关蛋白1(Lung Cancer Metastasis-Related Protein1,LCMR1)的多克隆抗体。方法运用生物信息学技术和人工合成多肽方法制备LCMR1特异性多肽,鉴定纯度后与牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白进行偶联制备多肽抗原,然后免疫新西兰雄性白兔,获得抗血清,经亲和层析法纯化后,用ELISA法鉴定抗体效价,用Western Blot鉴定特异性。结果成功获得了LCMR1的多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1:100 000,Western Blot免疫印迹结果显示其具有抗原特异性识别。结论应用免疫原性肽抗体技术成功制备了LCMR1的多克隆抗体,为今后深入了解LCMR1基因的生物学功能提供了有用的研究工具。

酵母双杂交技术筛选人95D细胞中肺癌转移相关蛋白1相互作用蛋白及其验证

目的通过酵母双杂交实验、免疫共沉淀及GST pull down技术筛选并验证肺癌细胞系95D细胞中与肺癌转移相关蛋白1(lung cancer metastasis-related protein 1,LCMR1)相互作用蛋白,为进一步研究LCMR1在肺癌发生发展中的作用提供科学依据。方法将诱饵质粒p GBKT7-LCMR转化AH109,应用酵母双杂交系统筛选出95D细胞中与LCMR1相互作用的候选克隆;应用反复划线法、X-α-Gal显色法和共转化回复验证法排除假阳性克隆,对真阳性克隆进行测序及生物学分析;构建含Myc标签的LCMR1融合蛋白的重组载体p CMV-Myc-LCMR1载体,以及带flag标签的目标相互作用蛋白载体,共转染细胞,利用免疫共沉淀技术验证LCMR1与相互作用蛋白之前的相互作用;融合蛋白沉降(GST pull-down)法进一步体外验证LCMR1与相互作用蛋白之间的作用。结果诱饵质粒p GBKT7-LCMR1与95D细胞c DNA文库共转化AH109,初步获得20个候选克隆;重复划线法后获得16个阳性克隆,X-α-Gal显色法获得12个蓝色阳性克隆,进一步将文库质粒与诱饵质粒共转化酵母菌回复验证,最终获得6个真阳性克隆;成功构建含标签重组载p CMV-Myc-LCMR1、pc DNA3.0-flag-RPL29及pc DNA3.0-flag-GNG5载体,经免疫共沉淀验证LCMR1与RPL29在细胞内有相互作用,与GNG5在细胞内无相互作用;GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29在体外有相互作用,与GNG5在细胞外无相互作用。结论酵母双杂交技术筛选出95D细胞中相互作用蛋白6个,经免疫共沉淀和GST pull-down实验验证LCMR1与RPL29体内体外均有相互作用。

Med19基因与肿瘤关系的研究进展

中介体(Mediator)是真核生物转录起始过程中的基因特异调控蛋白和RNA聚合酶Ⅱ重要的转录组成部分,最早发现于酵母菌中,是由多个蛋白质亚基组成的生物大分子复合物,属于RNA聚合酶Ⅱ通用转录装置的基本组分,在真核生物mRNA合成的活化和抑制中发挥关键作用,对RNA聚合酶Ⅱ活力进行调节。Med19基因在酵母中又名ROX3(或SSN7、RMR1等),最初是在研究CYC7基因突变体中发现的。野生型ROX3基因的克隆序列表示,它编码一个220个氨基酸的蛋白质。Med19基因在人体又称肺癌转移相关蛋白(LCMRI),定位于染色体chr11q12.1,蛋白由244个氨基酸组成,基因全长1605bp。Med19(Rox3)是中介体的一个亚单位,构成了酵母RNA聚合酶Ⅱ的头部组件,在转录激活和抑制中发挥重要作用。本文就Med19基因的特点、功能及其与肿瘤等关系的最新研究进展作一综述。