基于转录组学分析自然感染绵羊肺腺瘤病毒患羊肺肿瘤组织中转录差异基因及病毒致瘤机制的研究

绵羊肺腺瘤病(OPA)是由绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)引起的绵羊传染性肺肿瘤疾病。为探究JSRV对绵羊肺脏的致瘤机制,本研究从自然感染JSRV的羊(OPA患羊)肺肿瘤组织和健康羊肺组织中提取总RNA,构建二者的cDNA文库后采用Illumina Hi Seq 4000高通量测序平台进行转录组学测序(RNA-Seq),采用DESeqR筛选健康绵羊与患病绵羊肺组织中的转录差异基因,并以P<0.05和log2(Fold change)≥1筛选转录显著差异基因。通过GO和KEGG数据库对转录显著差异基因进行GO功能和KEGG信号通路的富集分析,并采用RT-qPCR对随机选择的10个转录显著差异基因进行验证。结果显示,与对照组相比,OPA羊肺肿瘤组织中共筛选到1 360个转录上调基因和783个转录下调基因,其中154个转录显著上调基因,212个转录显著下调基因。GO功能分析显示,转录显著差异基因显著富集在178个GO条目中,包括114个生物过程(BP)、19个细胞成分(CC)和45个分子功能(MF),主要涉及生长因子活性、复制后修复、NAD^(+)二磷酸酶活性、核苷代谢过程和鸟苷核苷酸交换因子活性等生物学功能。KEGG分析显示转录显著差异基因主要富集在细胞增殖、分化和肿瘤生成,如PI3K/Akt、MAPK和Hippo等信号通路。RT-qPCR结果显示,10个转录显著差异基因与RNA-Seq筛选结果均一致。本研究进一步通过RT-qPCR、western blot检测Hippo信号通路核心蛋白哺乳动物STE20样蛋白激酶1/2 (MST1/2)、大肿瘤抑制因子1/2 (LATS1/2)、YES相关蛋白1/2 (YAP1)在两组绵羊肺组织样品中的转录及表达水平和YAP1的磷酸化水平(p-YAP1);采用免疫组化试验(IHC)检测Hippo信号通路中上述核心蛋白在两组绵羊肺组织中的表达及定位。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,OPA羊肺组织中MST1和YAP1 mRNA的转录水平均极显著上调(P<0.01、P<0.001),LATS1 mRNA的转录水平显著上调(P<0.05)。Western blot结果显示,MST1/2蛋白在59 ku、YAP1和p-YAP1蛋白在65 ku、LATS1/2蛋白在140 ku处分别出现特异性条带;与对照组相比,OPA绵羊肺肿瘤组织中MST1/2和p-YAP1的表达水平显著上调(P<0.05),LATS1/2和YAP1的表达水平极显著上调(P<0.01)。IHC结果显示,在OPA组和对照组羊肺组织中MST1/2、LATS1/2及p-YAP1均定位于肺组织细胞质中,且与对照组相比,OPA组羊肺组织中上述分子均呈强阳性表达。YAP1主要定位于对照组羊肺组织细胞的胞质中,而在OPA组中YAP1主要定位于细胞核中(少量定位于细胞质中)。上述结果表明,OPA组绵羊肺组织中存在转录显著差异基因,主要参与细胞增殖、肿瘤发生和转移等过程,且主要富集在PI3K/Akt、MAPK、Hippo等信号通路,尤其是Hippo信号通路中的YAP蛋白可能通过核异位促进肿瘤的发生与发展。本研究为JSRV致瘤机制提供了新的研究基础与研究思路和方向。

绵羊肺腺瘤病毒中国NM株部分gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒的基因序列,设计合成一对引物,对绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙株的gag基因中主要编码CA蛋白的基因段进行PCR扩增,产物经琼脂糖凝胶电泳分析,呈现一条约897bp的特异条带,将其回收后克隆入pMD-18 T载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,与南非株(基因序列号NC-001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为83%,推导出的氨基酸同源性为84%。与美国株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为81.5%,氨基酸同源性为83%。这是我国首次报道的绵羊肺腺瘤病毒的gag基因的一段序列,为我国科研工作者进行更深入的研究奠定基础。

绵羊肺腺瘤病诊断方法及治疗措施

绵羊肺腺瘤病是由肺腺瘤病毒引起的慢性、高接触性传染病。成年绵羊为易感群体,患病绵羊日渐消瘦、虚弱、咳嗽、呼吸困难、浆液性鼻漏。此病在内蒙古、青海、甘肃和新疆等省份流行。本文围绕该病诊断方法和治疗措施开展具体分析,为绵羊养殖人员提供肺腺瘤病防控参考。

绵羊肺腺瘤病病毒NM株衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病病毒内蒙(NM)株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术扩增编码gag基因衣壳蛋白(Capsid protein,CA)基因,构建CA蛋白的重组表达质粒pGEX-4T-1-CA,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入Ecoli BL21 CodonPlus中,在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以可溶性和包涵体形式高效表达,表达的CA融合蛋白表观分子量约为37 Ku,表达量占全菌蛋白的20%,利用谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析柱纯化可以得到具有较高纯度的表达蛋白,是一种理想的免疫原。本研究为下一步利用重组蛋白研制绵羊肺腺瘤病病毒NM株的单克隆抗体及诊断试制盒等奠定了基础。

绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株囊膜蛋白基因在大肠杆菌中的分段表达

为了建立原核高效表达体系,从自然感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙毒株的肺肿瘤组织中提取基因组DNA,应用PCR技术分别扩增编码囊膜蛋白(env)基因的表面蛋白(surface protein,SU)和跨膜蛋白(transmembrane protein,TM)区域基因,通过T-A克隆的方法分别克隆入pGEM-TEasy载体中,然后利用设计的起始密码、终止密码以及相应酶切位点的引物,把env基因的SU区和TM区基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1中,分别构建SU和TM的重组表达质粒,经酶切、PCR及DNA测序鉴定后,将阳性质粒转化入大肠杆菌BL21 CodonPlus中并在IPTG的诱导下表达,表达产物用SDS-PAGE分析鉴定。结果表明,该基因可以在大肠杆菌中以稳定的包涵体形式高效表达,表达的SU和TM融合蛋白表观分子质量约为68 ku和46 ku,表达量分别占全菌蛋白的25%和30%,并且从包涵体分离纯化得到的表达蛋白具有较高纯度,是一种理想的免疫原。

绵羊肺腺瘤病的病理学及RT-PCR诊断

对呼和浩特市四子王旗某种羊场的疑似绵羊肺腺瘤病的4只病羊,通过临床诊断、病理组织学观察,PCR、RT-PCR和半巢式PCR技术对疑似病羊进行检测诊断。结果显示:(1)"小推车试验"时有鼻液流出;(2)剖检时可见肺肿大实变,切开肺脏时可见大量泡沫状液体从切面渗出;(3)病理组织学观察肺脏有大小不一的腺瘤灶,而且肺泡上皮细胞呈乳头状增生;(4)根据GenBank中登录的绵羊肺腺瘤病毒全序列(AF105220),设计合成3对特异性引物和3条巢式引物,经RT-PCR、PCR及半巢式PCR法扩增并测序,利用RT-PCR和PCR分别扩增出与预期大小一致的条带U3(175bp)、env(225bp)、gag(300bp),序列分析表明与引起该病的绵羊肺腺瘤病毒序列同源性较高,分别达97.2%、96.5%、94.4%。应用半巢式引物扩增片段分别为U3(133bp)、env(178bp)、gag(275bp)。经过以上方法确诊该羊场的疑似病例为绵阳肺腺瘤病。

绵羊肺腺瘤病毒的巢式RT-PCR技术检测

目的为能够更加准确、敏感的检测绵羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis SPA)。方法本试验通过外源性绵羊肺腺瘤病毒的囊膜基因env的TM区和长末端重复序列LTR的U3区分别设计特异性的内外侧引物,运用巢式RT-PCR的方法进行检测,同时与普通RT-PCR进行比较。结果测得的绵羊肺腺瘤病毒的env基因和U3区序列与Gen-Bank中发表的外源性绵羊肺腺瘤病毒基因序列(AF105220)同源性分别为100%和98%。特异性试验结果表明本试验设计的env基因和LTR的U3区的内外侧引物不能从健康绵羊、小鼠、家兔的肺组织以及感染了SPA羊的肾、肝、脾的RNA中扩增出条带。敏感性试验结果表明,env基因和LTR的U3区的巢式RT-PCR诊断方法最低能检测出的标准模板RNA量分别为48 fg和48 pg,而普通的RT-PCR,env基因及LTR的U3区的最低检出量分别为0.48 ng和4.8 ng,得出巢式RT-PCR的敏感性高于普通RT-PCR,同时env基因的敏感性高于LTR的U3区的敏感性。结论以上试验说明巢式RT-PCR技术对于检测绵羊肺腺瘤病具有很高的敏感性和实用性。

人工感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株羔羊的临床病理学研究

试验旨在探讨试验性感染绵羊肺腺瘤病毒内蒙株(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV-NM)对羊的淋巴细胞亚群、淋巴细胞凋亡、血气指标的影响。用含JSRV-NM株的病毒悬液1 mL气管内接种1日龄羔羊,对人工感染羊进行了临床症状观察、血液学检查、病理生理学的系统病理学研究。在不同时段用流式细胞仪检测外周血中淋巴细胞及其亚群的动态变化及淋巴细胞凋亡情况。同时,对血液做血气分析和血清酶的检测。人工感染羔羊均出现了一些轻微的绵羊肺腺瘤病(sheep pul-monary adenomatosis,SPA)临床症状。SPA攻毒组感染JSRV-NM株后前60 d,外周血中CD4+、CD8+T细胞保持较高水平;到感染后90 d呈现下降趋势。对淋巴细胞凋亡检测的结果显示,在感染JSRV-NM株前60 d,凋亡细胞都保持较高水平;而感染第90天后,晚期细胞凋亡显著低于对照组。血气分析结果显示,阴离子隙(AnGap)、细胞外液碱剩余(BE(ecf))、氯离子浓度(Cl-)、氧分压p(O2)、实际碳酸氢根(HCO3act)、标准碳酸氢根(HCO3std)、二氧化碳总量(TCO2)、氧饱和度(O2SAT)、氧含量(O2CT)9项在不同时期与对照组存在显著差异。接毒羔羊尚未发生SPA的典型症状,但试验羔羊的病情已经出现,处于SPA疾病的早期表现;病羊在感染JSRV-NM病毒株后,在一定时期内,血液中CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞的变化是SPA病羊在疾病过程中细胞免疫和淋巴细胞受损的重要表现之一;外周血淋巴细胞会呈现不同程度的凋亡,JSRV-NM株诱导机体免疫细胞凋亡是一种重要的临床表现;本试验结果初步证明,血气分析方法在临床诊断绵羊肺腺瘤病时有一定的参考价值。

绵羊肺腺瘤病毒NM株前病毒gag基因的克隆与序列分析

参照GenBank中已发表的绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)的全基因序列,设计合成3对引物,对JSRVNM株的gag基因分3段进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,分别呈3条531、888和949bp的特异条带,将其分别克隆入pMD 18T载体中,进行序列测定并拼接序列,得到完整的gag基因序列。分析结果表明,与南非代表株(基因序列号NC 001494)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为89 0%,推导出的氨基酸同源性为90%。与美国代表株(基因序列号AF105220)的gag基因序列比较,核苷酸同源性为86 3%,氨基酸同源性为87%。

兰州地区绵羊肺腺瘤病的诊断及病理学研究

通过临床、病理学及PCR诊断技术,对兰州某羊场疑似绵羊肺腺瘤病的4例病羊进行了检测诊断和病理学分析.结果表明:病羊表现为临诊咳嗽,呼吸困难."手推车试验"时,有大量稀薄鼻液从鼻腔流出.病理变化主要表现为肺表面散布在大小不等的灰白色结节,肺切面有大量泡沫状液体流出,Ⅱ型肺泡上皮细胞大量增生使肺泡呈不规则腺泡状,并有增生的突起突入肺泡腔;病变区附近肺泡腔中有大量巨噬细胞充塞;特异性PCR检测扩增出531bp的特异性片段,与已知绵羊肺腺瘤病特异性片段大小一致;4例病羊确诊为绵羊肺腺瘤病.

绵羊肺腺瘤病研究进展

绵羊肺腺瘤病 ( OPA)是由外源性的 D型和 B型绵羊肺腺瘤反转录病毒 ( JSRV)引起的肺脏肿瘤性疾病 ,该病毒主要在肺肿瘤上皮细胞内高水平表达 ,病毒基因组内 L TR的活化和病毒囊膜蛋白的表达是引起体外细胞转化癌变的主要因素 ,其致瘤的可能机制是通过激活磷酯酰肌醇 3 -激酶 ( PI-3 K)和蛋白酶 K( AKT)信号通路来启动细胞内抑制细胞凋亡和刺激细胞增生的信号转导系统 ,从而引起细胞增生癌变。该病与人的细支气管 -肺泡癌 ( BAC)极相似 ,通过对 OPA的研究 ,不仅为早期诊断及预防该病提出新方法 ,而且为揭示 BAC的分子发病机制及探索其基因治疗提供新思路。

自然感染绵羊肺腺瘤病和绵羊进行性肺炎病例肺脏的病理组织学观察

绵羊肺腺瘤病(ovine pulmonary adenomatosis,OPA)和绵羊进行性肺炎(ovine progressive pneumonia,OPP)是改良绵羊很容易发生的两种呼吸系统疾病,两者都可引起明显的肺脏病变。为了从病理组织学变化上对这两种疾病加以鉴别,分别描述了OPA和OPP自然病例肺脏的眼观病变,采集OPA和OPP病死羊的肺脏,制成石蜡切片,经HE染色后,在光学显微镜下观察、拍照,并记录病理形态学变化。

新疆绵羊肺腺瘤病调查

绵羊肺腺瘤病(Sheep Pulmonary Adenomatosis,SPA)在我国首次报道于新疆,1955年至1657年间在来自焉耆和乌鲁木齐地区的屠宰羊中见到11例。在此以前,曾在1951年于甘肃兰州见到一例。本文报道1980年在乌鲁木齐和哈密屠宰绵羊中的绵羊肺腺瘤病。

绵羊肺腺瘤病毒内蒙株衣壳蛋白在真核细胞中的表达

为构建绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte Sheep Retrovirus,JSRV)内蒙株衣壳蛋白(CA)基因真核表达载体,采用含HA标签的引物,通过PCR方法从重组原核表达质粒上扩增CA-HA融合基因片段,将其克隆至真核表达载体上。构建的真核表达质粒通过脂质体法转染293细胞和Hela细胞,用间接免疫荧光和Westhern blotting法检测目的蛋白的表达。结果表明,成功地构建真核表达质粒pcDNA3.1(+)-CA-HA,并转染的293细胞和Hela细胞内观察到特异性荧光和检测到目的基因的表达产物,说明CA基因在真核细胞内获得表达。本试验为建立特异性的诊断试剂盒奠定了基础。

绵羊肺腺瘤病毒自然感染病例的病理学观察

通过对2只自然感染绵羊肺腺瘤病毒的病羊进行剖检及病理组织学观察,了解此病毒对绵羊机体的主要侵害器官及其他各器官所发生的一系列变化。试验结果表明:剖检可见肺脏膨隆,体积增大、充满胸腔;肺的表面和切面上见到大小不一、质度较实的黄白色小结节;有些病例肺胸膜的脏层与壁层发生黏连;在支气管、细支气管内可见白色泡沫状的黏液。组织学检查可见肺泡壁上皮细胞和细支气管上皮细胞增生,呈乳头状向肺泡腔内或细支气管腔内生长;邻近部位的肺泡腔内有大量的巨噬细胞增生。从观察结果中可以看出,绵羊肺腺瘤病毒主要侵害肺脏和机体的免疫器官,可为绵羊肺腺瘤病的进一步研究提供参考。

新疆绵羊肺腺瘤病回顾性研究

本文对1955～1980年间几次绵羊肺腺瘤病(sheep pulmonary adenomatosis,SPA)调查中的部分病例进行了回顾性研究。在31例 SPA 肺病变中,发现有5例并发绵羊进行性肺炎或梅迪(maedi)病变;在所检查的12例纵膈淋巴结中只有1例有转移的腺瘤病灶,转移率为8.3%。6例的超微结构表明腺瘤细胞起源于Ⅱ型肺细胞。其中2例的瘤细胞有病毒从细胞表面出芽,病毒体形态上类似于逆转录病毒。

北京地区绵羊肺腺瘤病的病理学及PCR诊断

对北京某种羊场的疑似绵羊肺腺瘤病的羊进行临床诊断、病理组织学观察和PCR检测。结果显示,(1)"小推车试验"时从鼻腔里流出黏稠鼻液;(2)剖检可见肺脏肿大和实变,肺脏和气管内有大量泡沫性液体;(3)病理组织观察到肺脏上皮细胞肿瘤性增生,突入肺泡腔;(4)PCR和半巢式PCR能扩增到176bp和129bp的特异性片段;(5)序列比对分析显示,U3区与外源性绵羊肺腺瘤病毒的核苷酸同源性为90.9%-97.7%。综合上述诊断结果确诊该种羊场的疑似病例为绵羊肺腺瘤病。

绵羊肺腺瘤病研究进展

绵羊肺腺瘤病（Ovine pulmonary adenomatosis，OPA）是绵羊的一种慢性、进行性、接触性传染的肺脏肿瘤性疾病，山羊也发生此病。该病是以患羊咳嗽、呼吸困难、消瘦、大量浆液性鼻漏、Ⅱ型肺泡上皮细胞（typeII pneumocytes）和无纤毛细支气管上皮细胞（clara cells）肿瘤性增生为主要特征的疾病。

绵羊肺腺瘤病的病原学研究

绵羊肺腺瘤病(SPA)或绵羊肺癌(OPC)是绵羊的一种接触传染性传染病以肺内出现细支气管上皮细胞和Ⅱ型肺泡细胞性腺癌为特征。19世纪南非(1825)称本病为驱羊病(Jaagsiekte),以后又发现于英国(1888)、德国(1899)和法国。后来许多国家都有本病的报道,八十年代又报道于墨西哥(1981)、美国(1982)、加拿大(1982)和爱尔兰(1985)。现在几乎所有的养羊国家和地区都有本病存在,但新西兰和澳大利亚仍然无本病发生。 我国从首次(1958)报道本病以来,在新疆、青海和内蒙的屠宰羊中进行过调查。