荷斯坦牛肺干细胞分离培养与生物学特性研究

本研究利用荷斯坦牛肺间质干细胞(LR-MSCs),通过体外试验观察LR-MSCs在不同条件下的成骨分化能力,以期为临床应用及组织工程提供新的种子细胞。本项目以荷斯坦牛(健康荷斯坦牛胎牛,0日龄,1只,雄性)为对象,通过无菌方法获得肺组织,通过组织块贴壁方法获得LR-MSCs,并将其原代培养。通过绘制3代、9代、15代细胞的生长曲线,测定其增殖时间及成体能力。利用RT-PCR技术对干细胞表面标志物(CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166、CD34和CD45)的表达进行检测。对该基因进行染色体核型分析,并对其进行遗传转化,观察该基因的多向性。结果显示,这种方法能获得LR-MSCs,它们在体外培养时表现为长梭形和螺旋形,并呈现典型的“S”曲线。第9世代的倍增时间比15世代的短,但比3世代的长(P<0.01);第9代LR-MSCs的成株率较3代明显降低,而15代较高,差异有统计学意义(P<0.05)。应用RT-PCR技术检测到在LR-MSCs中特异表达的CD29、CD44、CD73、CD90。前期研究发现,LR-MSCs可特异性地表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD106、CD166,而CD34、CD45则不表达。对LR-MSCs进行染色体组测序,发现其为正常二倍体(2n=60,XY)。通过对荷斯坦牛LR-MSCs的免疫荧光染色及RT-PCR分析,证明LR-MSCs具有向脂肪、骨、软骨等多种细胞定向分化的能力。这可能为今后的组织工程研究提供了一种新的种子细胞。

胎儿肺组织来源间充质干细胞的分离、培养、鉴定及重编程初探

该文主要研究将进行胎儿肺部组织来源的间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from fetal lung,FL-MSCs)转变成为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)。首先使用酶消化法对胎儿肺部组织进行分离,然后采用常规方法进行培养并成功获得成纤维细胞样细胞。使用共聚焦技术检测获得的细胞,发现角蛋白表达呈阴性;共聚焦技术检测c-Myc、Oct4、Nanog以及Nestin四个干性相关因子,发现它们呈阳性;检测成纤维细胞样细胞的免疫表型,符合间充质干细胞的表型判断标准;然后进行诱导分化实验,发现这些细胞可以向成脂、成骨细胞分化,经过以上实验鉴定获得的成纤维细胞为FL-MSCs。使用Yamanaka四因子体系对FL-MSCs进行诱导,可以形成类似人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hES细胞)的克隆,采用核型分析、STR检测分析以及畸胎瘤形成实验初步验证获得的克隆为iPS。