人外周血树突状细胞与人肺鳞癌细胞的融合研究

目的 探讨用杂交瘤技术制备树突状细胞疫苗的方法。研究树突状细胞 肿瘤细胞之融合细胞的形态及表型特征。 方法 用PEG法将免疫磁珠法分离获得的人外周血树突状细胞与人肺鳞癌细胞株LTEP78融合 ,瑞氏 姬姆萨染色观察树突状细胞、LTEP78细胞及其融合细胞的形态结构 ,SP免疫细胞化学染色法检测融合细胞的分子表达。 结果 分离的树突状细胞能高表达HLA DR分子 ,而LTEP78细胞则不表达 ;将树突状细胞与LTEP78细胞按 10∶1比例融合后 ,两者的细胞膜、细胞质依次融合 ,获得的融合细胞仍能表达HLA DR分子。 结论人树突状细胞与人肺鳞癌细胞的融合是一个动态过程 ,通过将两者融合 ,人肺癌细胞获得了人树突状细胞表达的HLA DR分子 ,从而增强了其免疫原性 ,为人树突状细胞疫苗的研制奠定了基础。

ODC反义RNA表达质粒的构建及其对人肺鳞癌细胞生长特性的影响

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成途径中的限速酶,其活性的异常升高及多胺堆积与恶性肿瘤的发生、发展及转移密切相关.作者构建一个能表达人ODC反义RNA的真核表达质粒pCMV/ODCas,用磷酸钙沉淀法将其导入人肺鳞癌细胞系LTEP-78(L78),经G418筛选,获两株转染细胞系L78/ODCasl和L78/ODCas4.与亲本细胞相比,其生长速度减慢;软琼脂集落形成能力减弱,DNA、RNA及蛋白质等生物合成受到抑制,ODC酶活性降低.经Southern blot及PCR分析,进一步证明了上述变化与ODC反义序列稳定完整地整合到转染细胞基因组中有关.

人肺鳞癌细胞电阻抗谱测量实验研究

在1 k Hz^100 MHz范围内,采用Agilent 4294A精密阻抗分析仪,测量人肺鳞癌SK-MES-1细胞悬浮液的电阻抗,通过电阻抗频谱图和Nyquist图的分析,提取肺癌细胞电阻抗频谱的特征参数,并与人正常肺上皮BEAS-2B细胞进行比较。结果显示:肺癌细胞与正常人肺细胞悬浮液的电阻抗谱存在着较显著的差异;肺鳞癌细胞的电阻抗实部增量最大值(ΔZmax)和电阻抗虚部峰值(Z″P)与细胞体积分数(Φ)呈线性关系;肺鳞癌细胞悬浮液阻抗谱的特征频率(fc)低于正常人肺细胞的54.72%(P<0.001),并且不受细胞体积分数的影响。这表明,细胞悬浮液阻抗谱特征频率可以用于区分肺鳞癌细胞和正常人肺细胞,可为肺鳞癌细胞的鉴定与分型提供电生理指标。

TGF-β_1在肺鳞癌细胞中的表达

目的 探讨TGF β1 在肺鳞癌细胞中的表达。方法 以原代培养的人肺鳞癌细胞为对象 ,采用ELISA法检测不同分化程度肺鳞癌细胞无血清培养液中TGF β1 蛋白含量。结果 肺鳞癌各组细胞中TGF β1 蛋白含量均显著高于正常支气管上皮细胞 (P <0 0 1) ,低分化组分别高于中分化组和高分化组 (P <0 0 5 ) ,中分化组虽高于高分化组 ,但无显著差异(P >0 0 5 )。结论 TGF β1 蛋白在人肺鳞癌组织中表达增高 ,且与其分化程度基本呈正相关 ,提示TGF β1

9-顺-维甲酸对人肺鳞癌细胞分化和凋亡的影响

目的 :研究 9 顺 维甲酸 (9 cis RA)对人肺鳞癌L78细胞、A2细胞分化和凋亡的影响。方法 :以 1和 5 μmol/L 9 cis RA处理肿瘤细胞株 ,分别于 0、12、2 4、36、4 8、72h检测对照组和用药组细胞数及细胞HE染色后的形态变化 ,应用流式细胞术分析细胞周期分布、Bcl 2表达和凋亡细胞数。结果 :9 cis RA可抑制肺鳞癌细胞生长 ;用药后细胞分化征明显 ,可见凋亡细胞。流式细胞计数显示 ,用药组细胞G0 /G1百分率明显升高 ,S期细胞百分率下降 ,细胞凋亡率增加 ,Bcl 2的表达下降。结论 :9 cis RA能抑制人肺鳞癌L78细胞、A2细胞增殖 ,诱导细胞分化和凋亡。

ODC反义RNA对人肺鳞癌细胞c-myc及c-Ha-ras基因表达的影响

目的：探讨鸟氨酸脱羧酶（ＯＤＣ）反义ＲＮＡ逆转人肺鳞癌细胞ＬＴＥＰ７８（Ｌ７８）恶性表型的分子机理。方法：核酸杂交，免疫细胞化学染色等。结果：在ＯＤＣ反义基因稳定整合、ＯＤＣ反义ＲＮＡ高效表达的转染细胞株中，ｃｍｙｃ及ｃＨａｒａｓｍＲＮＡ的表达比Ｌ７８亲本细胞显著下降；ｒａｓＰ２１蛋白的表达也受到明显抑制。结论：ＯＤＣ反义ＲＮＡ引起细胞内多胺耗竭，对ｃｍｙｃ及ｃＨａｒａｓ基因表达有明显的下调作用，这可能是其逆转人肺鳞癌细胞恶性表型的重要机制之一。

靶向survivin利用RNA干扰技术影响云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC凋亡的初步研究

目的检测云南个旧肺鳞癌细胞株YTMLC细胞内源凋亡抑制因子survivin基因的表达以及促进YTMLC细胞凋亡的情况。方法构建和转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2至YTMLC细胞株,通过免疫荧光和半定量RT-PCR检测survivin蛋白表达及mRNA转录水平的变化,并通过流式细胞仪使用PI-AnnexinV双染法检测YTMLC细胞株的凋亡。结果构建的2种重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均能明显抑制survivin基因的表达;应用免疫荧光检测survivin基因的表达,转染重组质粒pshRNA-survivin-1和pshRNA-survivin-2的实验组survivin荧光强度明显低于转染空载体pGE-1和pshRNA-negative非特异对照质粒;通过半定量RT-PCR检测到sur-vivin基因mRNA转录明显减少,抑制率为80.60%和70.09%;通过PI-AnnexinV双染法检测YTMLC细胞的凋亡分别达(33.42±2.42)%(P<0.01)和(20.09±1.32)%(P<0.01)。结论重组质粒pshR-NA-survivin-1和pshRNA-survivin-2均可明显抑制YTMLC细胞内源survivin的表达和mRNA的转录均可并明显促进YTMLC细胞的凋亡,为survivin介导的肿瘤基因沉寂疗法提供良好的实验基础。

调控靶向Xklp2表达对肺鳞癌细胞放射线照射后γ-H2AX蛋白表达的影响

目的探讨调控靶向Xklp2(TPX2)表达对肺鳞癌细胞放射线照射后γ-H2AX蛋白表达及细胞核内γ-H2AX和MDC1斑点形成的影响。方法利用前期构建的稳定转染TPX2 shRNA质粒的SK-MES-1细胞和稳定转染TPX2过表达质粒的NCI-H226细胞,采用Western印迹检测4 Gy照射后0～24 hγ-H2AX蛋白表达,免疫荧光技术观察4 Gy照射后4 h细胞核内γ-H2AX和MDC1斑点形成情况。结果 4 Gy照射后0～24 h,TPX2干扰的SK-MES-1细胞和TPX2过表达的NCI-H226细胞中γ-H2AX蛋白表达水平均出现显著增加后逐渐下降的趋势,但在TPX2干扰的细胞中,各时间点γ-H2AX蛋白表达水平均显著高于单纯照射组(P<0. 05),而在TPX2过表达细胞中,各时间点γ-H2AX蛋白表达水平均显著低于单纯照射组。②照射后4 h,下调TPX2表达则γ-H2AX和MDC1核内斑点形成增加,而过表达TPX2则γ-H2AX和MDC1核内斑点增加幅度降低(P<0. 05)。结论照射后H2AX磷酸化及γ-H2AX和MDC1核内斑点形成变化,提示TPX2参与DNA损伤修复。

肺鳞癌细胞单克隆抗体的建立及鉴定

目的制备出高效价的抗人肺鳞癌单克隆抗体。方法以云南个旧肺鳞癌细胞YTMLC-90免疫的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤NS-1、SP2/0细胞为亲代细胞,应用鼠-鼠杂交瘤技术建立杂交瘤细胞系。ELISA法筛选,有限稀释法克隆化培养,ELISA法测定抗体效价,双抗体夹心法鉴定Ig亚类,制备染色体,G iemsa染色计数染色体数目,ABC免疫组化法行不同组织细胞的交叉检测。结果获得3株稳定分泌抗YTMLC-90细胞抗体的杂交瘤细胞株S2D1、N2D1及N3C5。培养上清效价分别为1∶512、1∶284及1∶1 024,腹水效价分别为1∶105、1∶104及1∶104;Ig亚类分别为IgG1、IgG2a及IgG3;染色体众数在90~110之间;3株抗人肺鳞癌单克隆抗体与其他组织细胞无交叉反应性。杂交瘤细胞体外传代培养6个月仍保持抗体稳定分泌。结论成功制备高效且特异的抗人肺鳞癌单克隆抗体。

抑制肺鳞癌细胞FANCM和USP1基因对顺铂的增敏效应

目的:研究抑制FANCM和USP1基因后,人肺鳞癌SK-MES-1细胞株FA/BRCA通路激活状态以及对顺铂敏感性的变化。方法:用脂质体转染试剂将FANCM-siRNA和USP1-siRNA分别和共转染于SK-MES-1细胞株,采用蛋白质印迹法测定转染后FANCM和USP1蛋白表达,并检测转染前后经DDP处理后细胞FANCD2蛋白单泛素化水平。免疫荧光染色检测胞核内FANCD2核聚小体表达。CCK-8法测定转染前后细胞生存率的变化;Annexin V/PI流式细胞术测定转染前后细胞凋亡率。结果:转染FANCM-siRNA和USP1-siRNA后,SK-MES-1细胞中FANCM和USP1蛋白表达均较转染前明显降低。转染FANCM-siRNA后经顺铂诱导的FANCD2单泛素化水平和核聚小体表达明显下调;转染USP1-siRNA后,顺铂诱导的FANCD2单泛素化水平和核聚小体形成明显增加;转染USP1-siRNA后细胞生存率和细胞凋亡率高于转染FANCM-siRNA,同时共转染USP1-siRNA+FANCM-siRNA后细胞对顺铂的致敏效应与转染USP1-siRNA相似。结论:沉默FANCM和USP1基因后,通过阻断FA/BRCA通路,抑制其DNA修复功能,导致SKMES-1细胞对顺铂的敏感性增高,其中沉默USP1基因的增敏效应更为明显。

外源性骨形态发生蛋白9转入肺鳞癌细胞对其活性的影响及作用机制

目的观察骨形态发生蛋白(BMP)9对人肺鳞癌细胞株YTMLC-90迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法 RT-PCR和Western印迹法检测YTMLC-90细胞和正常人支气管上皮细胞(NHBE)中BMP9 mRNA和蛋白表达水平;以转染重组腺病毒Ad-BMP9的YTMLC-90细胞为研究组,转染Ad-GFP为阴性对照组,未转染为空白对照组;采用划痕愈合实验检测3组细胞迁移能力,Transwell实验检测迁移和侵袭能力,同时检测迁移相关因子基质金属蛋白酶(MMP)2 mRNA和蛋白表达情况;Western印迹法检测3组细胞BMP-Smad信号通路中Smad 1/5磷酸化水平。结果YTMLC-90细胞中BMP9 mRNA和蛋白表达量均明显低于NHBE细胞(P<0.05)。Ad-BMP9转染YTMLC-90细胞后胞内BMP9蛋白表达量明显高于阴性对照组(P<0.01)。空白对照组48 h的细胞划痕愈合率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);研究组细胞划痕愈合率明显低于阴性对照组和空白对照组,穿过小室膜和基质胶的YTMLC-90细胞数均明显少于阴性对照组和空白对照组,MMP2表达量明显低于阴性对照组,MMP2mRNA和蛋白表达量均明显低于阴性对照组(均P<0.05)。YTMLC-90细胞高表达BMP9后其p-Smad 1/5表达量明显高于阴性对照组和空白对照组(P<0.01)。结论外源性BMP9转入人肺鳞癌细胞株YTMLC-90可有效抑制其迁移和侵袭能力,激活BMP-Smad信号通路是该抑制作用的机制之一。

靶向细胞表面DcR3适配体促进肺鳞癌细胞凋亡的研究

目的探讨靶向细胞表面DcR3适配体对肺鳞癌细胞SK-MES-1、NCI-H520增殖凋亡的影响。方法采用聚合酶链反应、凝胶电泳对SK-MES-1、NCI-H520细胞DcR3 mRNA表达水平进行检测,应用MTT法检测靶向细胞表面DcR3适配体对细胞增殖抑制率,流式细胞仪分析细胞周期分布,采用Western blot法分析FAS的表达变化。结果SK-MES-1细胞DcR3 mRNA相对表达水平为(1.134±0.115),靶向细胞表面DcR3适配体与细胞共孵育后DcR3 mRNA相对表达水平为(0.497±0.062),差异具有统计学意义(t=7.026,P<0.001);NCI-H520细胞DcR3 mRNA相对表达水平为(1.036±0.078),靶向细胞表面DcR3适配体与细胞共孵育后DcR3 mRNA相对表达水平为(0.419±0.028),差异具有统计学意义(t=7.193,P<0.001)。经靶向细胞表面DcR3适配体处理的G 0/G 1、S期SK-MES-1、NCI-H520细胞与未经处理的空白对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05),其中G 0/G 1期细胞显著高于未经处理的空白对照组(P<0.05),S期细胞显著低于未经处理的空白对照组(P<0.05)。SK-MES-1、NCI-H520细胞经靶向细胞表面DcR3适配体处理后FAS蛋白表达量降低,且随着靶向细胞表面DcR3适配体浓度的加大而减低,差异具有统计学意义(F分别为8.024、12.419,<0.001)。结论DcR3可能参与肺鳞癌细胞的生长、增殖,为其治疗提供了新的靶点。

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人肺鳞癌细胞株分化和增殖的影响

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯是人工合成的全反式维甲酸（ATRA）衍生物之一，ATRA具有抑制多种类型肿瘤细胞的生长、分化及凋亡作用。本研究选用人肺鳞癌细胞株L78细胞为研究对象，观察4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人肺鳞癌细胞体外生长特性的影响。

鸦胆子油乳对肺鳞癌细胞增殖的抑制作用

目的探讨鸦胆子油乳诱导人肺鳞癌细胞株SK-MES-1的凋亡作用和其抗肿瘤机制。方法培养人肺鳞癌细胞株SK-MES-1,用不同浓度的鸦胆子油乳处理SK-MES-1细胞,采用MTT法检测鸦胆子油乳对SK-MES-1细胞生长、增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期。结果鸦胆子油乳抑制SK-MES-1细胞增殖和诱导SK-MES-1细胞的凋亡作用均呈剂量和时间依赖性。与对照组相比,鸦胆子油乳处理后的SK-MES-1细胞G0-G1期百分比明显增高,S期细胞比例下降。结论鸦胆子油乳在体外能够抑制人肺鳞癌细胞株SK-MES-1的增殖,诱导其细胞凋亡,诱导作用具有显著的量效及时效关系。

携带凋亡素基因的重组腺病毒对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299凋亡的影响

目的:研究携带凋亡素基因VP3的重组腺病毒载体Adxsi-GFP-VP3对人肺鳞癌细胞SK-MES-1、人肺腺癌细胞NCI-H1299的凋亡的影响。方法:取对数生长期SK-MES-1、NCI-H1299细胞,各分为重组腺病毒(Adxsi-GFP-VP3)组、空病毒(Adxsi-GFP)组和细胞对照(磷酸盐缓冲液)组,依次记为A、B、C组。采用逆转录-聚合酶链反应和Western blot法检测A、B组细胞转染48、72 h的VP3 mRNA和Apoptin表达情况,透射电镜观察A组细胞转染72 h的超微结构变化。采用MTT法检测3组细胞转染24、48、72、96 h的细胞增殖活性;流式细胞术检测细胞转染后24、48、72 h的凋亡率及细胞周期变化。结果:与B组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞转染48 h后有VP3 mRNA表达,转染72 h后有Apoptin表达。A组转染72 h后SK-MES-1、NCI-H1299细胞均出现细胞凋亡的超微结构改变。与B、C组比较,A组SK-MES-1、NCI-H1299细胞增殖活性降低、细胞凋亡率增加,且与转染时间呈正相关;转染72 h S期的SK-MES-1、NCI-H1299细胞比例降低、G2/M期细胞比例增加。以上差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:Adxsi-GFP-VP3能有效诱导SK-MES-1、NCI-H1299细胞凋亡。

三株抗人肺鳞癌单克隆抗体免疫组化分析

目的对三株抗云南个旧肺鳞癌YTMLC-90杂交瘤细胞S2D1、N2D1、N3C5所分泌的单克隆抗体进行不同组织细胞的免疫组化分析,探讨其特异性.方法用收集的原倍杂交瘤细胞上清常规ABC免疫组化法进行组织细胞学交叉检测,分析三个抗体与临床病理确诊的肺鳞癌组织、肺腺癌组织、肠癌组织、食道癌组织、肾癌组织、肺正常组织石腊切片和肺鳞癌YTMLC-90细胞系、肺腺癌GLC-82细胞系、舌鳞癌Tca-8113细胞系、鼻咽癌KB细胞系、胶质瘤U-251细胞系、膀胱癌T-24、B1u-87细胞系的交叉反应.结果杂交瘤细胞上清液与肺癌组织及肺鳞癌、肺腺癌细胞系YTMLC-90、GLC-82反应呈阳性,阳性率分别为82%、100%;与正常肺组织及肠癌组织、肾癌组织、食道癌组织及体外培养的其它各肿瘤细胞系均呈阴性反应.结论经免疫组化研究,三株单克隆抗体具有肺癌特异性,属于肺癌相关抗原的单克隆抗体.

槲寄生碱抑制肺癌细胞增殖作用初步观察

目的:研究槲寄生碱对人肺腺癌细胞株SPC-A1及肺鳞癌细胞株SK-MES-1的抑制作用。方法:采用四甲基噻唑氮蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测不同浓度槲寄生碱作用24和48h对细胞增殖的影响,以含不同浓度的5-氟尿嘧啶(5-FU)细胞组为阳性对照,不含药物的细胞组为阴性对照,计算半数抑制浓度(IC50)。流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测高、中和低3组浓度的槲寄生碱作用24h后的细胞的凋亡率。结果:不同浓度槲寄生碱作用24h,对SPC-A1细胞的IC50为(14.43±0.53)μg/mL,对SK-MES-1细胞的IC50为(8.09±0.40)μg/mL。其作用48h,对SPC-A1细胞的IC50为(12.11±0.25)μg/mL,对SK-MES-1细胞的IC50为(6.43±0.33)μg/mL。并且抑制作用随碱浓度的升高和作用时间的延长而增加,P<0.05。阳性对照组5-FU作用24h,对SPC-A1细胞的IC50为(4.79±0.45)μg/mL,对SK-MES-1细胞的IC50为(5.15±0.23)μg/mL。作用48h,对SPC-A1细胞的IC50为(4.35±0.41)μg/mL,对SK-MES-1细胞的IC50为(4.11±0.38)μg/mL。FCM检测SPC-A1细胞未加入药物的对照组凋亡率为(0.43±0.01)%,高剂量组药物浓度28.86μg/mL,凋亡率为(31.09±0.05)%,中剂量组药物浓度14.43μg/mL,凋亡率为(18.19±0.02)%,低剂量组药物浓度7.22μg/mL,凋亡率为(7.99±0.01)%。SK-MES-1细胞未加入药物的对照组凋亡率为(0.57±0.02)%,高剂量组药物浓度16.18μg/mL,凋亡率为(38.24±0.03)%,中剂量组药物浓度为8.09μg/mL,凋亡率为(21.81±0.01)%,低剂量组药物浓度4.05μg/mL,凋亡率为(9.11±0.01)%,与没有加入槲寄生碱的细胞相比,加入槲寄生碱后SPC-A1细胞与SK-MES-1细胞凋亡率均明显增加,P<0.05,并且凋亡率随槲寄生碱剂量的增加而升高,P<0.05。结论:槲寄生碱能够抑制人肺腺癌细胞株SPC-A1及肺鳞癌细胞株SK-MES-1的增殖,并能促进细胞的凋亡,为槲寄生碱应用于肺癌的临床治疗提供了实验依据。