基于肼化学富集法分析人血浆外泌体中的N-糖基化蛋白质

目的对人血浆外泌体中N-糖基化蛋白质的组成和功能进行分析。方法通过超速离心法分离获得健康人血浆外泌体,超声处理获得外泌体蛋白,胰蛋白酶将蛋白酶解为肽段。肼化学法分离富集血浆外泌体中的N-糖基化肽段,液相色谱及高分辨质谱对其进行鉴定,基因本体法对鉴定的N-糖基化蛋白质的生物学功能进行分析。结果获得的外泌体具有外泌体典型的茶托样双层膜结构,形态完整,大小均匀,直径分布在100 nm左右。在1 mL健康人血浆外泌体中共鉴定到252个N-糖基化修饰位点,归属于131个N-糖基化蛋白质。可能在丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性抑制及钙离子结合等生命过程中发挥重要作用。其中,67个N-糖基化蛋白质与疾病的发生发展密切相关。结论本研究在人血浆外泌体中共鉴定到131个N-糖基化蛋白质。它们可能参与关键的生命活动及疾病的发生发展。

凝集素法与酰肼法富集糖肽的方法学比较

蛋白质糖基化(glycosylation)是最常见和最重要的翻译后修饰之一.大规模N-连接糖基化位点鉴定是糖蛋白质组学研究的重要组成部分,而N-连接糖肽富集是高通量N-连接糖基化位点鉴定的关键步骤.凝集素富集法和酰肼化学法是目前被广泛应用的N-连接糖肽富集技术,有报道认为两种方法具有很强的互补性,联合使用能提高糖基化位点的鉴定数目.本文以Hep G2细胞系为模型,系统比较了这两种方法的富集效率和糖蛋白鉴定数目.结果表明,虽然酰肼法的糖肽富集效率为76.6%,远高于凝集素法的54.6%,但是凝集素法却能鉴定到825个糖蛋白和1 959个N-连接糖基化位点,显著多于酰肼法富集到的522个糖蛋白和1 014个糖基化位点.并且,两种方法并未显示出显著的互补性,仅28个糖蛋白和80个糖基化位点未在凝集素法中鉴定到.