肽基精氨酸脱亚胺酶4在类风湿关节炎中的表达及意义

目的:分析类风湿关节炎(RA)患者肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)蛋白的表达水平与类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体及28个关节的疾病活动度评分(DAS28)的相关性,探讨PAD4对RA的诊断和治疗价值。方法:收集90例RA患者和76例健康对照者的血清,同时收集RA患者的临床资料,ELISA法检测PAD4的表达水平及RA患者血清中抗CCP抗体、RF-IgA、RF-IgG的表达水平。收集39例RA患者和22例健康对照者EDTA抗凝全血,采用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC),实时荧光定量PCR检测PAD4 mRNA的表达水平;特种蛋白仪检测89例RA患者血清中RF-IgM的水平。分离并培养RA患者PBMC,分别加入7.5、15、30、60μmol·L^(-1) PAD4抑制剂F-amidine,作用24、48及72 h后CCK-8检测PBMC增殖情况并确定最佳浓度和最佳作用时间;在最佳浓度和最佳作用时间时收集细胞采用流式细胞术检测PBMC细胞凋亡情况。结果:RA患者血清中PAD4的浓度为(5.94±0.37)ng·ml^(-1),显著高于健康对照者的(2.30±0.18)ng·ml^(-1),差异有统计学意义(P<0.05)。PAD4诊断RA的ROC曲线下面积(AUC)为0.875。RA患者PAD4的表达水平与RF-IgM呈正相关(r=0.22,P=0.039),抗CCP抗体阳性组患者PAD4的表达水平与抗CCP抗体水平呈正相关(r=0.258,P=0.033),而抗CCP抗体阴性组患者血清中也会有高水平的PAD4表达;PAD4表达水平与RF-IgA、RF-IgG和DAS28无相关性。PAD4抑制剂F-amidine作用RA患者PBMC的最佳作用时间是48 h,最佳作用浓度是15μmol·L^(-1)。F-amidine可以增加PBMC晚期凋亡比例。RA患者全血中PAD4 mRNA的表达水平为7.23±9.57,显著高于健康对照者的1.00±0.00,差异有统计学意义(P<0.05),同时PAD4 mRNA的表达水平与抗CCP抗体呈正相关(r=0.390,P=0.023),但与RF及DAS28无相关性。结论:RA患者PAD4的表达水平可作为诊断RA的一个指标,在抗CCP抗体阴性的RA患者中也有73.7%的表达PAD4,检测PAD4的水平对其诊断价值更高;PAD4可以作为治疗RA的一个靶点。

保藏方法对菌株JXU1023产精氨酸脱亚胺酶的影响研究

精氨酸脱亚胺酶(Arginine deiminas,ADI)可以水解葡萄酒中的精氨酸产生瓜氨酸等物质,从而促进氨基甲酸乙酯的形成,有利于产酶菌株生长和产酶能力的高稳定性菌种保藏方法研究是精氨酸脱亚胺酶进一步研究的前提与基础。通过系统考察斜面低温保藏法、深层液体保藏法、甘油低温保藏法、液体石蜡保藏法和冷冻干燥保藏法等5种不同保藏方法对菌株JXU1023的影响,发现冷冻干燥保藏法是菌体生长能力和精氨酸脱亚胺酶活力的长期稳定保持的较好方法,其他几种方法虽然操作简便,但并不利于菌种的长期稳定保藏,而斜面低温保藏法可用于生产和研究阶段的短期保藏。

基因沉默肽基精氨酸脱亚胺酶4的表达对胶原诱导关节炎小鼠肺间质病变的影响

目的:研究基因沉默肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deaminase 4,PAD4)的表达对胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠肺间质病变的治疗作用及可能机制。方法:DBA/1小鼠建立CIA模型,尾静脉注射PAD4-siRNA表达载体制备的病毒液,每周1次,共8次。处死小鼠,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测肺中PAD4 mRNA的表达水平;免疫组织化学法检测PAD4蛋白的表达;取脾组织进行细胞培养,流式细胞术检测Tfh细胞和Tfr细胞比例的变化;HE染色观察肺病理学的改变。结果:(1)与空白组比较,模型组小鼠肺组织PAD4 mRNA的表达水平增加,差异有统计学意义(P<0.05),PAD4-siRNA治疗后CIA小鼠肺组织中PAD4 mRNA的表达水平较模型组和阴性对照组明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);(2)空白组小鼠肺组织红色荧光较少,而模型组和阴性对照组小鼠肺组织的炎细胞浸润区和气管周围可见较多的红色荧光,PAD4-siRNA治疗后3组的红色荧光明显减少;(3)与空白组比较,模型组脾细胞中Tfh细胞比例升高,差异有统计学意义(P<0.05),PAD4-siRNA治疗后CIA小鼠脾细胞中Tfh细胞比例较模型组和阴性对照组明显降低,差异有统计学意义(P<0.05);与空白组比较,模型组小鼠脾细胞中Tfr细胞比例略有降低,但差异无统计学意义,PAD4-siRNA治疗后小鼠脾细胞中Tfr细胞比例升高,但只有PAD4-siRNA2组与模型组和阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);(4)模型组脾细胞中Tfh/Tfr值升高,与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05);PAD4-siRNA治疗后3组Tfh/Tfr值均下降,差异有统计学意义(P<0.05);(5)与空白组比较,模型组小鼠肺组织的肺泡壁增厚,炎性细胞浸润增加,PAD4-siRNA治疗后CIA小鼠的肺组织破坏及炎性浸润减少,纤维化程度减轻。结论:基因沉默PAD4的表达可以降低Tfh细胞的比例,升高Tfr细胞的比例,逆转Tfh/Tfr值,减轻肺组织的间质病变程度和炎症浸润程度。

大鼠胶原诱导关节炎模型滑膜肽基精氨酸脱亚胺酶4表达

目的探讨肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidylarginine deiminase 4,PADI4)在大鼠胶原诱导关节炎模型的表达。方法2012年7月至2013年5月中国医科大学附属盛京医院实验中心将关节炎模型建立成功且关节炎指数大于2分的18只大鼠随机分为胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)3周模型组、4周模型组及6周模型组各6只,另有6只大鼠为对照组。分别予以生理盐水1 mld(对照组)、0.5 mgml鸡Il型胶原(CIA模型组)皮内注射,并于免疫后3、4、6周按组别处死。比较各组大鼠体重、关节炎指数、足趾容积及PADI4表达的变化情况。结果 CIA模型组关节炎发展迅速,关节炎指数、足趾容积相对于正常对照组明显增高,PADI4表达亦增多,体重减轻。结论 PADI4与大鼠胶原诱导关节炎模型有明显的相关性。

粪肠球菌SK32.001精氨酸脱亚胺酶的分离纯化及酶学性质研究

对Enterococcus faecalis SK32.001所产的精氨酸脱亚胺酶（ADI）进行分离纯化并对其酶学性质进行研究。实验结果表明,通过细胞破碎,硫酸铵沉淀,Hi Prep Q FF 16/10阴离子交换层析,Sephadex G-75等纯化方法获得电泳纯精氨酸脱亚胺酶,分子量约为42ku,催化最适温度和p H分别为50℃和6.5,在30~40℃和p H5.5~7.5时较稳定。不同浓度的Zn2＋对酶活性影响较大。1mmol/L的Zn^2＋和10mmol/L的Co^2＋、Ca^2＋、Mg^2＋对酶活有较大的促进作用,10mmol/L的Cu^2＋对酶的抑制作用最强。精氨酸脱亚胺酶在最适反应条件测定其米氏常数为1.33mmol/L,最大反应速度为2.41μmol/min。

双水相体系萃取精氨酸脱亚胺酶

报道了利用聚乙二醇/硫酸铵双水相体系从自溶NJ402菌粗提酶液中分离纯化精氨酸脱亚氨酶(ADI)的研究结果,为精氨酸脱亚氨酶的分离纯化提供了一种方法。在双水相体系中采用聚乙二醇(PEG)与(NH4)2SO4为组成成分,考察了聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量、PEG质量分数、(NH4)2SO4质量分数、pH及NaCl质量分数对精氨酸脱亚氨酶分离纯化效果的影响。最佳双水相体系萃取条件为:聚乙二醇(PEG)平均相对分子质量为1 000,w(PEG1000)=15%,w[(NH4)2SO4]=20%,pH=6.5,室温下从自溶NJ402菌粗提酶液中分离纯化精氨酸脱亚氨酶,纯化倍数达到2.35倍,萃取率达91.1%。

粪肠球菌精氨酸脱亚胺酶酶学性质研究

经硫酸铵分级沉淀、Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析、SephadexG-75凝胶柱层析从NJ402自溶细胞超声破碎液中提纯得到精氨酸脱亚胺酶(ADI),纯化倍数为34.5,活力回收率为31.4%,经SDS-PAGE以及Native-PAGE测定结果表明,ADI亚基分子量约为46kD,该酶非变性情况下的分子量约为190kD左右,该酶为同四聚体结构。酶学性质研究结果表明:ADI催化最适温度和最适pH分别为50℃和6.5,在45℃以下和pH5～8之间有很好的稳定性。ADI是L-型脱亚胺酶,具有严格的光学选择性,适当浓度的Mn2+、Mg2+、Co2+对ADI催化活力的促进作用较大,高浓度的Zn2+和Co2+对酶有一定程度的抑制作用,L-瓜氨酸对酶无抑制作用而L-鸟氨酸却表现出较强的抑制作用。ADI在最佳催化条件下作用于L-精氨酸的米氏常数为3.2686 mmol/L,最大反应速度为2.44 μmol/min。

假单胞菌发酵制备精氨酸脱亚胺酶

采用假单胞菌(Pseudomonas sp.)发酵制备精氨酸脱亚胺酶,优化发酵培养基配方及培养条件,以葡萄糖为碳源,酵母膏和蛋白胨为氮源,30℃振荡培养20h时,发酵液中精氨酸脱亚胺酶的酶活力可达2.17u/ml。向HepG2肝癌细胞培养液中加入酶粗品0.5u/ml,对肿瘤细胞的生长抑制率为93.4%。

反胶束萃取精氨酸脱亚胺酶

报道了用反胶束体系萃取精氨酸脱亚胺酶(ADI)的研究结果,为精氨酸脱亚胺酶的分离纯化提供了一种方法。在反胶束体系中采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)作为表面活性剂,正辛烷和丁醇作为溶剂及助溶剂。考察了水相pH、振荡时间、离子强度、表面活性剂浓度及精氨酸脱亚胺酶质量浓度等因素对精氨酸脱亚胺酶分离纯化效果的影响。实验结果表明,当c(CTAB)=0.01 mol/L,pH=7,振荡时间15 min,体系中用于反萃取的c(NaCl)=0.75 mol/L,且起始粗酶质量浓度控制在30 g/L时,通过辛烷/丁醇/CTAB反胶束体系的萃取和反萃取,ADI酶液萃取率E达到85%,比活达到1.107 U/mg,是起始酶液的4.52倍。

精氨酸脱亚胺酶发酵条件研究

对一种新型肿瘤增殖抑制酶类一精氨酸脱亚胺酶的发酵生产工艺进行了研究。运用单因子扫描方法，考察了不同碳源、氮源等影响因子对粪肠球菌（Enterococcus faecalis）NJ402产精氨酸脱亚胺酶的影响。优选出其较佳培养基组分为（g／L）；蔗糖15，蛋白胨5，酵母膏5，牛肉膏2．5，NaCl3，KH2PO42，MgSO40．01，MnSO40．0025，L-精氨酸15；接种量以4％～5％为宜，最佳培养温度是37℃，最适起始pH为7．5。100L发酵罐实验表明，发酵到10h时，菌量与比酶活量均为最大，分别为40mg／mL和2．57U／mL。

精氨酸脱亚胺酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达及纯化

通过PCR扩增得到菌株编码ADI的arcA基因,并构建表达载体pET24a-ADI。将该载体导入大肠杆菌BL21(DE3),获得高效表达ADI基因的重组菌。对ADI诱导表达条件进行优化,结果发现宿主菌在A600达到1.0时加入0.2 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在30℃诱导4 h酶活最高,为2.04 U/mL发酵液。经超声波破碎、HiPrep DEAE FF阴离子交换层析、SuperdexTM200凝胶过滤层析,可获得SDS-PAGE电泳纯重组精氨酸脱亚胺酶(rADI)。rADI相对分子质量大小为92 600,由两个相同亚基组成,纯化后的rADI比酶活达20.9 U/mg。

中性粒细胞胞外诱捕网通过肽基精氨酸脱亚胺酶4促进前列腺癌增殖及侵袭的机制研究

目的探究肽基精氨酸脱亚胺酶4(PAD4)和中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)对前列腺癌增殖、侵袭的影响及其相关机制。方法收集前列腺癌患者肿瘤及其癌旁组织,通过免疫组化和实时荧光定量聚合酶链反应检测PAD4表达水平。将PC-3细胞分组为PMN组、NETs组、PMN+cl-amidine组和NETs+cl-amidine组。通过CCK8和Transwell实验检测各组细胞增殖和侵袭能力。采用Western blot法检测各组细胞组蛋白H3的瓜氨酸化(H3cit)、P53表达水平。结果患者肿瘤组织中PAD4 mRNA和蛋白水平均高于癌旁组织。与PMN组相比,NETs组PC-3细胞的增殖、侵袭能力显著提高,H3cit蛋白表达水平增加、P53蛋白表达水平降低。与NETs组相比,NETs+cl-amidine组PC-3细胞的增殖、侵袭能力显著降低,H3cit蛋白表达水平降低,P53蛋白表达水平增加。结论NETs通过释放PAD4诱导前列腺癌细胞增加H3cit表达,减少P53表达,促进肿瘤细胞增殖和侵袭。

重组精氨酸脱亚胺酶的表达、纯化及其抗癌活性

克隆了ADI并在大肠杆菌中表达重组蛋白,得到的ADI重组蛋白通过离子交换层析纯化并进一步复性.复性后的重组ADI蛋白经分析与天然ADI蛋白具有相近的分子量(大约46 kD)和相似的酶活性(38 U/mg),可以将L-精氨酸转换成瓜氨酸.在蛋白酶降解实验中,发现重组ADI具有比天然ADI更稳定的抗胰蛋白酶降解活性,重组ADI的半衰期比天然ADI的更长.重组ADI能抑制肿瘤细胞HepG2的生长,同时具有抑制HepG2细胞迁移的作用.

恶臭假单胞菌产精氨酸脱亚胺酶发酵条件及特性的研究

对恶臭假单胞菌UN0705产精氨酸脱亚胺酶的发酵条件及部分酶学性质进行了研究。结果表明，在培养温度28℃，培养基初始pH值为6．6，接种量4％，装液量40mL／250mL，发酵时间50h时，精氨酸脱亚胺酶酶活最大。精氨酸脱亚胺酶发酵粗酶液在温度37℃及pH6．0-7．0时有较好的稳定性。

肽酰基精氨酸脱亚胺酶4基因多态性与类风湿性关节炎及抗环瓜氨酸化蛋白抗体的相关性研究

目的:探讨肽酰基精氨酸脱亚胺酶(PADI)4基因padi4_94位点的单核苷酸多态性(SNP)与河北汉族人群类风湿关节炎(RA)易感性的关系及与抗环瓜氨酸化蛋白(CCP)抗体的相关性。方法:应用聚合酶链反应-连接酶检测反应技术(PCR-LDR)对134例RA患者和140例健康对照组中PADI4基因的padi4_94位点进行SNP分型,以酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测RA患者血清中的抗CCP抗体。结果:RA患者中padi4_94位点各基因型分布与正常对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),在所用病例对照人群中携带AG基因型者患RA的可能性是GG基因型的2.010倍(OR=2.010,95%CI=1.162-3.476),A等位基因可能为RA的易感等位基因(P<0.05)。抗CCP抗体的阳性率在携带RA易感等位基因A阳性患者中高于阴性患者,差异具有统计学意义(P<0.01),且携带A等位基因的阳性组患者中抗CCP抗体滴度明显高于阴性组患者,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:padi4_94位点AG基因型与RA具有相关性,其中A等位基因在河北汉族人群中为RA的易感等位基因。且携带A等位基因的患者血清中抗CCP抗体的阳性率和滴度均较不携带A等位基因的患者高。

精氨酸脱亚胺酶发酵过程特性研究

精氨酸脱亚胺酶有较好的体内体外肿瘤生长抑制作用。通过对粪肠球茵(Enterococcus faecalis)NJ402菌株产精氨酸脱亚胺酶的发酵特性的研究,建立起代谢物的过程变化与精氨酸脱亚胺酶产生机理的内在联系。NJ402菌株生长过程中碳源物质代谢产生乳酸导致发酵体系pH的下降,而培养基中L-精氨酸的脱亚胺作用有利于发酵体系pH的稳定和茵体生长。进一步的研究表明,低pH生长环境有利于NJ402菌株产精氨酸脱亚胺酶,且精氨酸脱亚胺酶的产生与能量代谢无关。NJ402菌株产精氨酸脱亚胺酶受底物L-精氨酸的诱导,但该诱导作用受茵体生长体系pH的调控,即精氨酸脱亚胺酶的产生是低pH生长环境与L-精氨酸共同作用的结果。

肽基精氨酸脱亚胺酶在脑梗死患者中的表达及意义

目的研究肽基精氨酸脱亚胺酶(PADI4)在脑梗死患者中的表达及意义。方法选取2020-03—10南华大学附属长沙市中心医院神经内科收治住院的40例急性脑梗死患者,对照组为40例同期收治住院的与病例组年龄相匹配的非脑梗死患者,应用RT-qPCR技术方法检测2组患者血液中PADI4的相对表达量。结果PADI4在病例组中的相对表达量为1.06(0.91~1.21),对照组为0.86(0.80~0.95),病例组的相对表达量较对照组显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);绘制ROC曲线进行诊断试验效能的评价,AUC为0.759,PADI4用于诊断脑梗死的敏感度为70.0%,特异度为82.5%,P<0.001。结论PADI4相对表达量与脑梗死的发生具有相关性,同时对脑梗死的发病有一定的诊断效能.

单核细胞增生李斯特菌精氨酸脱亚胺酶基因的克隆及原核表达

精氨酸脱亚胺酶(ADI)可能介导单核细胞增生李斯特菌抗酸应激,由arcA基因编码。利用分子克隆技术从单核细胞增生李斯特菌10403S扩增得到ADI基因,测序正确后将其插入pET30a表达载体中,构建该基因的原核表达质粒pET30a-ADI,并转化入大肠埃希菌Rosetta中进行诱导表达。核苷酸序列分析显示,ADI基因的完整开放阅读框为1 233 bp,编码410个氨基酸。SDS-PAGE表明:该基因在大肠埃希菌中成功表达,重组蛋白的分子质量约为52.5 ku。为进一步研究精氨酸脱亚胺酶的活性提供了条件,同时也为探索单核细胞增生李斯特菌抗酸应激的机理奠定了重要的基础。

浸润性乳腺癌中肽基精氨酸脱亚胺酶4与CD133的表达及意义

目的探讨浸润性乳腺癌中肽基精氨酸脱亚胺酶4(peptidyl arginine deiminase 4,PADI4)与CD133的表达及意义。方法选取2016—2021年北京老年医院病理科诊断的46例浸润性乳腺癌(非特殊型)患者的病理资料,采用免疫组织化学染色法观察PADI4与CD133在乳腺癌组织中的表达,并分析其与乳腺癌临床病理特征的关系。结果46例乳腺癌组织中,PADI4高表达19例(41.3%),低表达27例(58.7%);CD133阳性表达24例(52.2%);PADI4在乳腺癌组织学分级3级和雌激素受体(estrogen receptor,ER)阴性患者癌组织中的表达明显高于乳腺癌组织学分级1~2级和ER阳性患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。与ER阳性患者相比,CD133在ER阴性患者癌组织中的表达更高,差异有统计学意义(P<0.05);PADI4的表达与CD133的表达呈正相关(r=0.538,P<0.05)。结论PADI4与CD133在浸润性乳腺癌组织中高表达,且二者均在ER阴性乳腺癌组织中表达更高,PADI4与CD133可能在浸润性乳腺癌的进展过程中发挥着重要作用。

肽酰基精氨酸脱亚胺酶检测对类风湿关节炎诊断价值

目的：研究肽酰基精氨酸脱亚胺酶（PADI-4）在类风湿关节炎（RA）中的诊断意义。方法用酶联免疫吸附试验（ELISA）双抗体夹心法检测58例 RA 患者，40例其他风湿性疾病和30名健康志愿者血清中的 PADI-4、抗核周因子（APF）、抗环瓜氨酸肽（CCP）抗体和抗角蛋白抗体（AKA）的含量，应用 ROC曲线、方差分析和相关性分析对各项指标进行评价。结果 RA患者血清中PADI-4浓度（2.653±2.719 U／L）显著高于其他风湿性疾病组（0.872±0.292 U／L）和健康组（0.793±0.243 U／L），差异有统计学意义（t＝22.732，35.371，P 均＜0.01）；采用受试者工作曲线（ROC），PADI-4诊断 RA的最佳临界值为1.284 U／L，此时的灵敏度为62.1％，特异度为91.4％；PADI-4阳性率（62.1％）与 APF（50％）， AKA （56.9％）之间差异无统计学意义（χ2＝0.322，P＝0.570；χ2＝1.715，P＝0.190），与抗CCP抗体（81.1％）之间差异有统计学意义（χ2＝4.161，P＝0.041）；PADI-4水平与 APF，AKA 之间呈正相关（r＝0.652，0.01，0.666，P＜0.01），与抗CCP抗体之间未显示出相关性（r＝0.122，P＝0.357）。结论 PADI-4在部分 RA患者血清中显著升高，PADI-4对 RA具有良好的灵敏度和特异度，可能成为独立于抗CCP抗体之外的 RA的一种新的诊断标志物。