田鼠巴贝虫肽基脯氨酸异构酶基因的重组表达及功能分析

目的表达田鼠巴贝虫重组肽基脯氨酸异构酶(BmPPIase)基因并分析其功能。方法利用生物信息学方法筛选分析BmPPIase基因信息。通过BmPPIase全基因合成获得目的片段BmPPIase,构建重组质粒pET28a-BmPPIase,转入大肠埃希菌BL21感受态细胞中进行原核表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析BmPPIase重组蛋白表达情况,镍柱亲和纯化重组蛋白,小牛血清蛋白(BSA)法测定重组蛋白浓度。取BmPPIase重组蛋白在新西兰白兔背部多点免疫4次(第1、15、29、43天,每次1.5 mg),首次免疫后第53天颈动脉采血,ELISA鉴定其特异性多克隆抗体效价。蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析多克隆抗体的免疫原性。免疫荧光定位实验判断PPIase在田鼠巴贝虫虫体的位置。体外抑虫实验分别设置BmPPIase重组蛋白终浓度500、250、100、50、10μg/ml组,以及重组剪接因子1组(无关蛋白对照组,500、250、100、50、10μg/ml)、BSA组、空白对照组,各组加入小鼠感染红细胞孵育48 h,经溴化乙锭标记后,采用流式细胞仪检测感染红细胞的比例,分析重组蛋白在田鼠巴贝虫感染宿主红细胞过程中的作用。结果生物信息学分析结果显示,BmPPIase为亲环素类PPIases;在牛巴贝虫、泰勒虫、人芽囊原虫、疟原虫中均存在同源蛋白。重组质粒酶切结果显示,插入的基因大小为531 bp,与预期相符,测序结果正确。SDS-PAGE分析结果显示,BmPPIase重组蛋白为可溶性蛋白,相对分子质量为19000,经纯化后获得蛋白浓度为1.5 mg/ml。ELISA检测结果显示,抗BmPPIase重组蛋白特异性多克隆抗体效价>1∶80000。Western blotting分析结果显示,制备的抗BmPPIase多抗可特异识别重组蛋白。免疫荧光定位实验结果显示,BmPPIase分布在田鼠巴贝虫虫体表面,属于分泌蛋白。体外抑虫实验结果显示,重组BmPPIase对虫体入侵小鼠红细胞存在一定程度的抑制作用:BmPPIase重组蛋白浓度为500μg/ml时,相对染虫率为(47.0±1.2)%;随着重组蛋白浓度的降低,抑虫作用逐渐减弱,250、100、50μg/ml时相对染虫率分别为(64.0±0.3)%、(78.0±1.9)%和(82.0±0.25)%;至10μg/ml时相对染虫率为(93.0±0.22)%,已无明显抑虫作用。结论BmPPIase属于分泌蛋白,分布于虫体表面;可在体外明显抑制田鼠巴贝虫感染红细胞。

女性冠心病患者血清冯维勒布兰德因子、胎球蛋白B、肽基脯氨酸异构酶A与冠状动脉狭窄程度相关性

目的探讨女性冠心病患者血清冯维勒布兰德因子(vWF)、胎球蛋白B(FETUB)、肽基脯氨酸异构酶A(PPIA)与冠状动脉狭窄程度的相关性。方法选取新疆医科大学第四附属医院自2018年1月至2019年1月收治的80例女性冠心病患者为研究对象。采用Gensini积分评估冠状动脉狭窄程度,并根据Gensini积分的第1个至第4个四分位数,将患者分入Q1组、Q2组、Q3组、Q4组。比较4组患者的vWF、FETUB、PPIA表达量;同时,采用Spearman法分析vWF、FETUB、PPIA表达量与Gensini积分的相关性。结果Q1组、Q2组、Q3组、Q4组的vWF、FETUB、PPIA表达量呈逐渐上升趋势,组间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。vWF、FETUB、PPIA表达量与Gensini积分呈正相关(r=0.372、0.432、0.264,P<0.05)。结论女性冠心病患者血清中的vWF、FETUB、PPIA表达量可作为用于判断冠状动脉狭窄程度的快速、简单、易获得的实验室潜在指标。

田鼠巴贝虫肽基脯氨酸异构酶重组蛋白免疫保护效果

目的观察田鼠巴贝虫肽基脯氨酸异构酶(BmPPIase)重组蛋白主动免疫对巴贝虫感染小鼠的免疫保护效果。方法将雌性BALB/c小鼠(6周龄,约20 g/只)分为重组蛋白免疫组、感染对照组、正常对照组,各组分别为25、18、15只。以BmPPIase重组蛋白主动免疫重组蛋白免疫组小鼠,末次免疫后2周,选取抗体效价较高的18只小鼠经腹腔注射100μL田鼠巴贝虫染虫全血;感染对照组小鼠均经腹腔注射100μL田鼠巴贝虫染虫全血;正常对照组15只小鼠不进行任何处理,直接进行后续实验。重组蛋白免疫组、感染对照组于实验第0~30天,采血观察各组小鼠巴贝虫感染情况,计算染虫率;此外,于实验第0、7、14、21、28天采用血细胞分析仪对各组小鼠进行血常规检测,并采用微量样本多指标流式蛋白定量技术进行小鼠血清细胞因子检测。结果末次免疫后2周,重组蛋白免疫组25只小鼠体内均产生抗BmPPIase抗体,效价为5×10^(3)~8×10^(4)。重组蛋白免疫组和感染对照组小鼠均于实验第7天达到染虫高峰,染虫率分别达13.3%和50.0%;两组染虫率在实验第3、5、7、9天差异均有统计学意义(χ^(2)=113.18、475.22、465.98、18.71,P均<0.01);实验第11天后,两组染虫率均逐渐趋于0。全血细胞分析显示,感染第0~28天,重组蛋白免疫组小鼠红细胞数量[(5.30±0.50)×10^(12)/L~(9.87±0.24)×10^(12)/L]及血红蛋白含量[(89.67±22.80)~(148.60±3.05)g/L]均高于感染对照组。观察期间内重组蛋白免疫组小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)[(748.59±17.56)~(3858.28±1049.10)fg/mL]、肿瘤坏死因子α(TNF-α)[(6687.34±1016.64)~(12708.13±1629.79)fg/mL]、白细胞介素(IL)-6[(611.05±75.60)~(6852.68±1554.00)fg/mL]及IL-17a[(167.68±185.00)~(10849.27±355.40)fg/mL]均高于感染对照组,而IL-10[(247.65±138.00)~(18787.20±2830.22)fg/mL]低于感染对照组。结论田鼠巴贝虫PPIase重组蛋白可诱导感染小鼠体内IFN-γ、TNF-α等重要细胞因子上调表达,对宿主有较好的免疫保护效果,为一种极具潜力的疫苗候选蛋白。

脯氨酰顺反异构酶Pin1在乳腺癌中的研究进展

蛋白磷酸化信号通过影响蛋白的构象变化而调控细胞周期、细胞增殖和分化等许多细胞内过程。脯氨酰顺反异构酶Pin1(protein interaction with NIMA1)特异性识别并催化蛋白分子中磷酸化丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸(pS er/Thr-Pro)的构象变化,进而控制蛋白分子与底物的作用、蛋白分子之间的相互作用以及影响底物稳定性等。作为蛋白分子的"时间控制器",Pin1参与多个肿瘤发生通路。在细胞表型方面,Pin1高表达可抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移,促进肿瘤血管生成,引起治疗药物耐受,以及促进肿瘤干细胞自我更新;在分子机制方面,Pin1可促进癌基因转录,提高其蛋白活性,抑制其降解,还可降低抑癌基因的表达或活性。此外,Pin1基因敲除小鼠的正常乳腺干细胞以及孕期乳腺上皮细胞的增殖都受到抑制。在临床研究中,Pin1的表达水平也与乳腺癌的发生及预后密切相关。因此,Pin1作为治疗乳腺癌的新靶标具有良好的应用前景。

人亲环素A基因克隆及在大肠杆菌中表达

目的 :用基因重组技术表达人亲环素 A( Cy PA) ,以避免从人组织材料中提取纯化该蛋白的麻烦。 方法 :应用反转录聚合酶链反应 ( RT- PCR)技术从人淋巴细胞系 ( MT4 )总 RNA中扩增得到 Cy PA基因片段 ,并用重组 DNA技术对该基因片段进行克隆 ,构建表达载体 ,转入大肠杆菌进行表达。 结果 :DNA序列分析表明 ,得到的基因片段与设计编码 Cy PA的结构基因序列完全相同。所构建的表达载体 p ET11/Cy PA转入大肠杆菌获得表达 ,重组蛋白表达量占菌体可溶性蛋白的 4 1% ,经测定具有肽基脯氨酸顺 /反异构酶活性。 结论 :利用基因重组技术使大肠杆菌高效表达出有生物活性的人 Cy PA。

Pin1在神经退行性疾病中的作用机制及研究进展

肽基脯氨酰顺/反异构酶NIMA互作蛋白1(peptidyl-prolylcis/transisomerases,NIMA-interacting1,Pin1)可以识别底物磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酸(phosphor-Ser-Pro or phosphor-Thr-Pro,pSer/Thr-Pro)基序,通过催化磷酸化底物的顺反异构,对底物蛋白的结构和功能产生影响,在增殖、分化、存活等多种细胞生物学过程中发挥重要作用。近年来研究发现Pin1的表达和功能异常与多种神经退行性疾病相关。由于Pin1催化底物丰富,同时参与不同疾病发病的关键因子不尽相同,因此Pin1在不同神经退行性疾病中发挥的作用也不一样。本文从多种常见的神经退行性疾病的角度展开讨论,就Pin1在不同的神经退行性疾病中所发挥的作用和机制展开综述。

Pin1介导血管内皮细胞氧化应激反应参与重症中暑急性肺损伤的机制研究

目的观察热打击后小鼠肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)和肺组织中肽基-脯氨酰顺/反异构酶1(Pin1)通过调控氧化应激和凋亡形成,参与重症中暑急性肺损伤(acute lung injury,ALI)形成的分子机制。方法体外实验,建立PMVECs热打击模型,对照组将PMVECs置于标准37℃、5%CO2细胞培养箱,热打击组将细胞置于43℃细胞培养箱中进行热打击2 h,热打击后继续在细胞培养箱进行复温(1、3、6、12 h),并使用Pin1抑制剂Juglone(1µmol/L)预处理细胞1 h。体内实验,通过热打击构建重症中暑小鼠模型,热打击组动物置于仿真气候舱内,舱内温度(35.5±0.5)℃,湿度(60±5)%,肛温表监测小鼠直肠温度,小鼠体温达到42℃即停止热打击,热打击后1、3、6以及12 h处死动物,对照组小鼠始终置于室温(25±0.5)℃下,并使用Pin1抑制剂Juglone(1 mg/kg)于热打击前连续3 d腹腔注射对小鼠进行预处理。Western blot观察Pin1、cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的表达情况;DHE染色,荧光显微镜下观察细胞中O_(2)^(-)˙水平;ELISA检测肺组织中丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)水平;HE染色检测各组小鼠的病理改变情况;免疫组化染色检测各组小鼠肺组织中Pin1表达情况;TUNEL染色检测各组小鼠肺组织凋亡情况。结果热打击后复温1 h即可诱导PMVECs和肺组织中Pin1的表达,并呈现复温时间依赖性增加(F=771.6,P<0.05;F=1035,P<0.05);热打击后复温3 h开始PMVECs和肺组织中cleaved caspase-9的表达,并呈现复温时间依赖性增加(F=729.8,P<0.05;F=1773,P<0.05);PMVECs和肺组织中cleaved caspase-3在热打击后复温3 h开始表达,随着复温时间的延长其表达不断增多,趋势与cleaved caspase-9一致(F=1084,P<0.05;F=1252,P<0.05);同时,热打击后导致PMVECs中O_(2)^(-)˙释放。热打击后小鼠肺组织中氧化-抗氧化系统失衡,表现为热打击后小鼠肺组织中MDA的持续释放(F=114.2,P<0.05),而SOD水平持续抑制(F=99.15,P<0.05)。使用Pin1抑制剂Juglone对PMVECs和小鼠进行预处理,发现与热打击组相比,热打击+Juglone组PMVECs和肺组织中Pin1、cleaved caspase-9、cleaved caspase-3均被抑制(均P<0.05);使用Pin1抑制剂后明显减轻热打击后PMVECs中O_(2)^(-)˙的释放,促进重症中暑小鼠肺组织中氧化-抗氧化系统平衡恢复,与热打击组相比,热打击+Juglone组肺组织中MDA被抑制[(11.53±0.84)nmol/mL vs(9.65±0.69)nmol/mL,t=12.52,P<0.05],而SOD明显恢复[(41.18±3.45)U/mL vs(57.52±4.83)U/mL,t=5.57,P<0.05]。同时,抑制Pin1表达后可以明显减轻热打击后肺组织的病理损伤,以及抑制凋亡的发生。结论初步确认Pin1主要通过介导肺组织和PMVECs的氧化应激反应和凋亡发生,进而参与热打击后肺损伤的形成.