乳酸菌肽聚糖的提取纯化及其对河豚毒素的毒性消减效果研究

乳酸菌中提取的肽聚糖已被发现对河豚毒素具有消减作用。但肽聚糖提取工艺复杂、效率低下,阻碍了毒素消减研究。该研究以具有A3α,A1γ,A4α三种类型肽聚糖的乳酸菌为原料,通过对磷壁酸去除条件、脂质去除试剂和蛋白质的酶解工艺进行优化获得高纯度肽聚糖,并采用小鼠生物法评价了纯化后的3种肽聚糖对河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)的毒性消减效果。溶菌酶及扫描电镜结果显示,采用100 g/L三氯乙酸去除磷壁酸、50 g/L十二烷基硫酸钠溶液去除脂质、胰蛋白酶与链霉蛋白酶联用去除蛋白质后,3种肽聚糖呈现完整的球状形态,表明优化后的提取工艺对肽聚糖的球形结构完整性影响小。酶联免疫吸附法和小鼠生物法结果显示,纯化后的3种肽聚糖可以去除78%以上的TTX含量,并降低87%以上的毒性,消减效果均优于灭活菌株。由此可见,优化后的肽聚糖提取纯化工艺不会破坏肽聚糖消减TTX的主要组分,并能显著提高效率,为肽聚糖的工业化应用和毒素控制研究提供了理论基础。

皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性

为研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肽聚糖识别蛋白HdhPGRP-SC2-like的免疫功能特性,利用RACE技术克隆了HdhPGRP-SC2-like基因的全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析了HdhPGRP-SC2-like基因的组织分布特征,通过原核表达获得了重组蛋白rHdhPGRP-SC2-like,并对其酰胺酶活性及免疫特性进行了验证。结果表明:HdhPGRP-SC2-like基因的cDNA全长为938 bp,开放阅读框为780 bp,编码260个氨基酸,包含保守的PGRP结构域和Ami_2结构域;HdhPGRP-SC2-like属于短型PGRP,与软体动物近缘物种PGRP具有高度相似性;qPCR分析显示,HdhPGRP-SC2-like mRNA在皱纹盘鲍各组织中均有表达,其中,鳃中表达量最高,外套膜、消化腺中表达量次之,腹足和血细胞中表达量较低;进一步构建原核表达载体pET-28a(+)-HdhPGRP-SC2-like,经诱导表达、分离纯化获得重组蛋白rHdhPGRP-SC2-like,该蛋白具有肽聚糖结合活性,且在Zn2+存在的情况下显示出酰胺酶活性。研究表明,HdhPGRP-SC2-like能够结合细菌肽聚糖成分,在机体抵御入侵细菌等免疫防御中发挥重要作用。

肽聚糖的生物合成虚拟仿真实验设计及实践

为了提升“微生物学实验”教学质量,通过三维可视化交互转变方式,完整构建了基于虚拟仿真实验模式的细菌细胞壁关键成分肽聚糖生物合成过程的实验教学体系。虚拟仿真实验过程通过人机对话模式将微观世界的反应全要素在虚拟场景中以直观、开放、仿真可控的方式展示。肽聚糖生物合成虚拟仿真实验的构建丰富,优化并拓展了实验教学资源,提升了微生物实验教学过程中学生自主学习的积极性和研究式学习的自觉性,强化了实验教学对学生科学素养和实践创新能力的培养。

硒化枯草芽孢杆菌肽聚糖的结构表征及体外抗氧化活性研究

为探究硒化肽聚糖(Se-PG)的结构与抗氧化能力,以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)胞壁肽聚糖(PG)和亚硒酸钠为原料,利用HNO_(3)-Na_(2)SeO_(3)法对PG进行硒化修饰,制备Se-PG复合物。通过紫外光谱、傅里叶红外光谱及核磁共振研究Se-PG结构特征,从对DPPH、ABTS、·OH自由基的清除能力评价其体外抗氧化活性。结果表明:Se-PG的硒含量为369.32μg/g,傅里叶红外光谱在890 cm_(-1)有吸收峰,表明形成亚硒酸酯键;Se-PG对DPPH、ABTS和·OH自由基清除率具有质量浓度依赖效应,当质量浓度达到5 mg/mL时,自由基清除率分别为39.51%±0.26%、39.47%±0.98%、48.38%±1.42%,显著高于亚硒酸钠和PG(P<0.05)。结构表征表明B.subtilis PG可进行硒化修饰且不改变PG的基本结构。Se-PG具有优越的体外自由基清除能力和抗氧化活性,可作为功能性抗氧化剂进行开发。

枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞β-防御素-1(SBD-1)表达的影响

为了探究来源于枯草芽孢杆菌细胞壁的肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞(ORECs)中β-防御素-1(SBD-1)表达的影响,本试验使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间(2、4、6、8、10和12 h),采用荧光定量PCR(qPCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)方法分别检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激时间;再使用不同浓度的肽聚糖(0、10、20、30、40和50μg/mL)刺激ORECs 2 h,采用qPCR和ELISA方法检测SBD-1的mRNA和蛋白表达量,确定最佳刺激浓度。结果显示:(1)使用30μg/mL肽聚糖刺激ORECs不同时间时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着时间的增加呈先下降后升高的趋势,2 h时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(2)使用不同浓度肽聚糖刺激ORECs 2 h时,SBD-1的mRNA和蛋白表达量随着肽聚糖浓度的升高呈现先升高后降低的趋势,在20μg/mL时表达量最多并极显著高于对照组(P<0.001)。(3)不同时间刺激试验和不同浓度刺激试验均不会对ORECs产生细胞毒性作用。结果表明,来源于枯草芽孢杆菌的肽聚糖能够诱导ORECs表达SBD-1,最佳刺激条件为20μg/mL枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 2 h。

饲料中添加肽聚糖对中华绒螯蟹幼蟹生长、肝胰腺部分免疫指标及抗病力的影响

为研究饲料中添加肽聚糖对中华绒螯蟹幼蟹生长及抗氧化酶活力的影响,在基础饲料中分别添加0 (对照组)、62.5 mg/kg、125 mg/kg和250 mg/kg肽聚糖,配制成4组实验饲料,分别投喂初始体质量为(32.7 ± 1.4) g的中华绒螯蟹幼蟹42 d。结果显示,实验蟹的体质量、增重率、特定生长率等生长指标随着饲料中肽聚糖添加量的提高先升后降,在添加量为125 mg/kg时达到最大值,显著高于对照组。相比于对照组,添加125 mg/kg饲料的肽聚糖组实验蟹肝胰腺中蛋白浓度、酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(ALP)显著提高。攻毒感染试验表明,125 mg/kg肽聚糖组相对免疫保护率最高(38.22%),显著高于其它组。研究表明,饲料中适量添加肽聚糖可显著提高中华绒螯蟹幼蟹的生长性能、增强抗氧化能力和抗菌能力。

昆虫先天免疫的肽聚糖识别蛋白的研究进展

先天免疫系统的激活是通过一系列高度保守的模式识别受体识别病原体相关分子模式。肽聚糖识别蛋白家族是重要的模式识别受体,从昆虫到人类均高度保守,可识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌,在先天免疫和获得性免疫应答中发挥重要的识别和调节功能。

昆虫肽聚糖识别蛋白研究进展

在脊椎动物和非脊椎动物中,识别非己是天生免疫反应中的第一步。肽聚糖是细菌细胞壁的必需成分,属于进化上保守的微生物表面病原相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP),可以被模式识别蛋白(pattern recognition proteins,PRRs)如肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)识别。在昆虫的天生免疫系统中,有些PGRPs能够利用细菌独有的肽聚糖识别入侵细菌,并将细菌入侵信号传递给下游的抗菌肽(antimicrobial peptide,AMP)合成途径,启动抗菌肽基因的转录及合成;PGRPs对肽聚糖的识别也会启动酚氧化酶原途径的激活,引起黑化反应。有些具有酰胺酶活性的PGRPs可以促进吞噬作用;有些可以抑制抗菌肽合成以减弱过度免疫反应带来的损伤。还有一些PGRPs作为效应因子直接作用于细菌将细菌杀死。本文主要从昆虫PGRPs作为识别受体(recognition receptor)、调节子(regulator)和效应因子(effector)3个方面进行了综述,并分析了目前PGRPs研究中仍不清楚的问题和未来研究的方向。

亚洲玉米螟肽聚糖识别蛋白OfPGRP-SA的表达与功能分析

目的:明确肽聚糖识别蛋白PGRP在亚洲玉米螟先天免疫中的功能。方法:构建质粒表达载体,进行重组蛋白表达、纯化及Western blot鉴定,对获得的OfPGRP-SA重组蛋白进行抗菌活性、细菌凝集、酰胺酶活性、酚氧化酶反应和黑化反应等体外试验。结果:通过SDS-PAGE和Western blot鉴定,OfPGRP-SA蛋白纯化后条带单一,与预期大小一致。对重组蛋白体外活性分析表明,OfPGRP-SA对革兰氏阳性菌有较强的诱导作用,说明OfPGRP-SA可能参与Toll途径的激活。结论:进一步明确OfPGRP-SA在亚洲玉米螟先天免疫应答中的作用,有助于更好地利用病原微生物对亚洲玉米螟进行生物防治。

肽聚糖在天然免疫中的作用研究

肽聚糖是细菌等原核生物细胞壁的特有成分,但它在天然免疫系统中的作用长期被低估。近年来的研究资料表明,肽聚糖识别蛋白是一类与肽聚糖结合的模式识别受体,可识别入侵细菌,激活相应的免疫反应,在免疫应答中发挥重要作用。随着对免疫机制研究的进一步深入,肽聚糖在医学、畜牧和生物工程等领域中的应用将会有更广阔的前景。

淋球菌肽聚糖乙酰化对大肠杆菌溶解性转糖酶A酶切作用的影响

背景:有研究表明大肠杆菌(E.coli)肽聚糖乙酰化抑制溶解性转糖酶的酶切活性,但对淋球菌胞壁质乙酰化对该类酶的影响未见报道。目的:观察淋球菌的肽聚糖乙酰化对革兰阴性菌溶解性转糖酶家族二的酶切效果的影响。方法:运用同源重组方法敲除淋球菌的肽聚糖乙酰化基因A和B(△pacAB),制备3H标记的野生株和突变株的肽聚糖。应用分子克隆和蛋白表达纯化技术获得溶解性转糖酶A,体外测定溶解性转糖酶A对淋球菌和突变株(△pacAB)的肽聚糖酶切效果和最适酶切温度。结果与结论:溶解性转糖酶A经克隆、表达和纯化得到浓度为26.12g/mL蛋白;氚代葡糖胺标记并纯化得到氚代淋球菌肽聚糖多聚体;溶解性转糖酶A对40%乙酰化的淋球菌FA19肽聚糖酶切效果仅为9.71%,但对去乙酰化的突变株肽聚肽的酶切效果达93.45%;溶解性转糖酶对淋球菌肽聚糖酶的最佳酶反应温度为30℃。结果提示,淋球菌的肽聚糖乙酰化抑制溶解性转糖酶蛋白的切割活性,淋球菌可能通过胞壁酸乙酰化抑制溶解性转糖酶A引起的自溶的发生。

A3α肽聚糖对牙鲆不同组织中超氧化物歧化酶及磷酸酶活性的影响

研究了口服不同剂量的A3α肽聚糖 (A3α -PG)对牙鲆 (Paralichthysolivaceus)体表粘液和组织中超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase,SOD)、酸性磷酸酶 (Acidphosphatase,ACP)及碱性磷酸酶 (Alkalinephosphatase,AKP)活力的影响。饲料中A3α -PG添加量分别为 0 (对照 ) ,0 .0 5 % ,0 .10 % ,0 .2 0 % ,0 .4 0 % ,0 .80 %和 1.6 0 % (质量比 ) ,饲喂天数为 4 0d。结果表明 ,饲料中未添加A3α -PG时 ,牙鲆体表粘液、肾脏、肝脏和肌肉中SOD、ACP及AKP活性各异 ,其中SOD活性从高到低依次为粘液、肝脏、肌肉、肾脏 ;ACP活性大小依次为肝脏、肾脏、肌肉、粘液 ;AKP活性大小依次为肾脏、肝脏、肌肉 ,粘液中则检测不到AKP。饲料中添加A3α -PG后 ,实验组与对照组相比 ,各组织中SOD活性变化不大 ,未见显著性差异 (P>0 .0 5 )。ACP活性 ,肌肉与粘液中未见显著提高 ;而在肝脏中 0 .0 5 %和 0 .4 0 % (质量比 )剂量组能显著提高其ACP活性 ,与对照差异显著 (P <0 .0 5 ) ;在肾脏中 ,0 .2 0 % (质量比 )剂量组使其ACP活力得以显著提高 (P <0 .0 5 )。AKP活性呈现不同组织变化趋势各异 ,肌肉中没有明显提高 ,而在肾脏与肝脏中 ,除两个低剂量组 (0 .0 5 %和 0 .10 % ) (质量比 )未能使AKP活力得以显著提高外 ,其他剂量组?

双歧杆菌细胞壁肽聚糖的分离及其对二种海产动物免疫活性的影响

采用三氯乙酸裂解法分离双歧杆菌细胞壁肽聚糖,得到的肽聚糖约占双歧杆菌细胞干重的8.4%,其中总糖含量约为24.2%,脂肪酸含量约为3.2%,蛋白质含量约为2.4%;氨基酸含量及组分分析结果显示:与N乙酰胞壁酸羧基连接的肽链上的甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸和丙氨酸间的摩尔比为1∶0.7∶1.1∶6.7。将所得肽聚糖经超声波破碎后,制成0.1%和1%两种浓度的悬液,并将相应的缓冲液设置为对照组,分别注射给日本对虾和牙鲆,测定其对日本对虾和牙鲆血清酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(ALP)、酸性磷酸酶(ACP)和溶菌酶(LSZ)5种免疫酶活性的影响。结果显示:肽聚糖可显著提高日本对虾血清内的PO活性和LSZ活性,并在96h内一直维持在较高水平;肽聚糖可适当提高日本对虾血清SOD活性,但到72h又降回原来的水平;肽聚糖可影响日本对虾血清的ALP活性和ACP活性,且两种作用趋势相近,96h内呈逐渐平缓上升的趋势。肽聚糖可显著提高牙鲆血清的LSZ活性,但这种升高具有明显的时效性,72h后降至原来的水平,且不同浓度的作用效果也有差异。由此可见,肽聚糖可作为免疫增强剂用于提高养殖日本对虾和牙鲆的非特异性免疫水平。

饲料中添加肽聚糖对大黄鱼生长和非特异性免疫力的影响

以初始体重（30．8±1．33）g的大黄鱼（Pseudosciaena crocea）为研究对象，探讨饲料中添加肽聚糖对其生长和非特异性免疫力的影响。分别向每千克基础饲料中添加0（对照组）、100、500mg肽聚糖，配制出3种等氮等能的实验饲料，进行为期8周的摄食生长实验。实验在海水浮式网箱（1．5m×1．5m×2．0m）中进行，每个处理设3个重复，每个重复放养40尾。实验采取饱食投喂方式，每天投喂2次（05：00和17：30），实验期间海水水温为27．5—30．5℃，盐度为29—33，溶解氧含量在7mg·L^-1以上。饲喂实验结束后测定实验鱼的生长及相关的免疫学指标，同时每网箱取10尾实验鱼转入室内300L水族箱内进行攻毒实验。实验结果表明，饲料中添加肽聚糖显著影响大黄鱼的成活和生长。当饲料中添加100和500mg·kg^-1肽聚糖时，成活率（分别为95．8％和95．0％）显著高于对照组（88．3％）。当饲料中添加100和500mg·kg^-1肽聚糖时特定生长率（分别1．44％·d^-1和1．41％·d^-1）显著高于对照组（1．12％·d^-1）（P〈0．05）。饲料中添加肽聚糖实验组大黄鱼血液白细胞吞噬活力和血清溶菌酶活力显著高于对照组（P〈0．05），且添加肽聚糖的两实验组之间差异不显著；而血清替代补体途径活力则随着饲料中肽聚糖添加水平的增加而显著提高（P〈0．05）。哈维氏弧菌攻毒实验结果表明，饲料中添加肽聚糖实验组的累积死亡率（分别为25．0％和25．7％）显著低于对照组（64．3％）（P〈0．05）。因此，饲料中添加适宜含量的肽聚糖可显著提高大黄鱼生长率和非特异性免疫力，肽聚糖可以作为一种安全高效的口服免疫增强剂应用于大黄鱼的养殖生产。

芽胞杆菌肽聚糖水解酶的功能研究进展

长久以来,肽聚糖水解酶都被认为是破坏性的角色,如噬菌体利用它裂解宿主以释放病毒粒子,一些细菌分泌它来溶解竞争对手等。但近几年来,随着研究的不断深入发现,在细胞生长代谢过程中,它的积极作用更为重要。综述了芽胞杆菌肽聚糖水解酶在细胞整个生命过程中的功能,包括细胞生长、分裂、能动性、芽胞形成及萌发、蛋白分泌、信息传递、先天性免疫以及致病性各个方面,为研究芽胞杆菌及其他微生物中肽聚糖水解酶和细胞代谢调节奠定了理论基础。

双歧杆菌的全肽聚糖对裸鼠腹腔巨噬细胞产生IL-6、IL-12及一氧化氮的影响

目的 :探讨分叉双歧杆菌 (B bifidum)的全肽聚糖对巨噬细胞功能的调节作用。方法 :首先用全肽聚糖注射于裸鼠腹腔 ,以ELISA法测定裸鼠腹腔巨噬细胞产生的IL - 6和IL - 12含量 ,同时用Griess试剂检测一氧化氮 (NO)的水平。结果 :全肽聚糖注射组裸鼠腹腔巨噬细胞产生的IL - 6、IL - 12及NO含量分别为732 5 4± 190 30 (pg/mL)、816 37± 96 40 (pg/mL)和 48 90± 6 5 1(μmol/L) ;对照组分别为 30 3 78± 171 75 (pg/mL)、5 10 2 7± 12 3 46 (pg/mL)以及 30 6 7± 12 83(μmol/L) ,三者比较均具有显著差异 (P <0 0 1)。 结论 :分叉双歧杆菌的全肽聚糖能激活巨噬细胞 ,使之分泌多量的IL - 6、IL - 12及NO ,这些细胞毒性效应分子介导了全肽聚糖的多种重要生理功能。

A3α肽聚糖对凡纳对虾幼体生长及抗病毒感染力的影响

用含不同量的A3α肽聚糖(PG)(0.005%、0.01%、0.1%)的幼体饵料投喂凡纳对虾幼体,另在育苗水体中添加不同水平(0.005mg·mL-1、0.01mg·mL-1、0.05mg·mL-1)PG浸浴并以投喂不添加PG的幼体饵料的实验组作为对照,另设投喂活饵的实验组作参考,分别考察Z1-M1期、M1-PL1期、Z1-PL1期幼体的成活率,M1期、PL1期幼体体长,PL1期幼体体重,另外,PL1期仔虾经7d饲养后,检测体内酚氧化酶(PO)活性,并用白斑综合症病毒(WSSV)料投喂感染。结果显示:与投喂不添加PG幼体饵料组相比,在Z1-M1期,活饵组、0.01%PG添加量的幼体饵料组、0.005mg·mL-1PG的浸浴组幼体的成活率有极显著(P<0.01)提高,而在Z1-PL1、M1-PL1期,各实验组除0.05mg·mL-1浸浴组外均有极显著地(P<0.01)提高;各实验组除0.01mg·mL-1、0.05mg·mL-1PG浸浴组外,M1期幼体体长、PL1期幼体体重也有显著(P<0.01)增长,且各实验组PL1期幼体都有极显著(P<0.01)增长;各实验组仔虾PO活力均有极显著(P<0.01)提高;各实验组除0.1%PG添加量的幼体饵料组外,感染WSSV后仔虾的存活率有不同程度地提高。

肽聚糖制剂对南美白对虾体液免疫因子的影响

按一定梯度配制5种含不同水平肽聚糖制剂的饲料,投喂南美白对虾(Litopenaeusvannamei),35d后取实验对虾血样,用于测定血清中酚氧化酶活力、磷酸酶活力、溶菌活力及超氧化物歧化酶活力。结果显示,饲料中肽聚糖质量分数为500×10-6的实验组,对虾血清中酚氧化酶活力最高,肽聚糖质量分数为2500×10-6的实验组,对虾血清中酸性磷酸酶与碱性磷酸酶活力最高,肽聚糖对对虾的血清溶菌活力影响不明显(P>0.05)。由此表明饲料中添加适量(质量分数500×10-6左右)的肽聚糖制剂可使对虾体液免疫因子总体活力达到较高水平,饲料中肽聚糖制剂含量过高对对虾非特异免疫力的作用效果反而不佳。南美白对虾血清中酚氧化酶活力对饲料中肽聚糖含量变化较敏感,可作为肽聚糖使用效果的评价指标之一。

肽聚糖制剂提高凡纳对虾抗白斑综合征病毒感染力的研究

将肽聚糖制剂添加到普通对虾饲料中,制成分别含肽聚糖制剂1% 和0.1% 的免疫饲料,按常规方法投喂凡纳对虾.4周后测定每个实验组对虾的酚氧化酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶活性,同时进行白斑综合征病毒(WSSV)的人工投喂感染实验.实验结果显示,感染实验前投喂普通饲料组对虾和投喂免疫饲料组对虾的酚氧化酶和酸性磷酸酶活性无显著差别(p>0.05),各实验组对虾碱性磷酸酶活性的差异显著(p<0.05);感染实验后各实验组存活对虾的各项免疫酶活性无显著差异(p>0.05).凡纳对虾摄食添加了肽聚糖制剂的免疫饲料后,明显提高了对虾抵御WSSV感染的能力,其中尤其以添加了1%肽聚糖制剂的实验组的抗病毒感染能力最强,到实验结束时累计死亡率只有10%,而对照组为75%;1%添加量组与0.1%添加量组及对照组之间的累积死亡率差异显著(p<0.05).实验结果提示:在对虾饲料中添加肽聚糖可提高对虾抗病毒感染能力,从而达到防病治病、增加生产收益的目的.

乌贼墨肽聚糖的制备工艺与体外抗前列腺癌研究

目的研究乌贼墨肽聚糖的提取和分离纯化工艺,探讨其基本的结构组成,并研究它的抗前列腺癌活性。方法用Tris-HCl缓冲液提取、丙酮脱脂和Sevag试剂除蛋白方法提取出粗肽聚糖。将提取物用超滤、DEAE-52离子交换柱、G-75凝胶柱进行分离纯化,高效液相色谱和SDS-PAGE凝胶电泳进行纯度检测,经红外扫描,确定该组分具有肽聚糖的一般吸收特征,以及检测它的氨基酸组成。最后采用MTT法检测纯化后得到的肽聚糖对DU-145和PC-3细胞的增殖的影响。结果最终水提得到的肽聚糖的纯化物对DU-145和PC-3细胞均有较明显的增殖抑制效应,且抑制作用具有明显量效依赖关系。结论该法提取的乌贼墨肽聚糖具有明显的抗前列腺癌作用。