高表达GFP-PBP1b融合蛋白的猪链球菌菌株的构建及PBP1b蛋白细胞定位的研究

为鉴定猪链球菌(Streptococcus suis)A型青霉素结合蛋白PBP1b在S.suis中的细胞定位,本研究经PCR扩增S.suis pbp1b基因融合位点上下游序列UP和DN、强启动子Peno基因片段及绿色荧光蛋白(GFP)gfp基因片段,再通过重叠延伸PCR扩增构建融合片段UP-Peno-GFP-DN。利用同源重组的方法将UP-Peno-GFP-DN转化含反向筛选标记的PSS-pbp1b中间菌株,经含7%蔗糖的TSAS平板筛选,挑单菌落进行PCR及测序鉴定。PCR及测序鉴定结果显示,获得的重组菌株中Peno-gfp片段替换了PSS-pbp1b中的PSS片段,表明融合强启动子Peno、GFP及PBP1b(GFP-PBP1b)的重组菌株P-GFP-pbp1b正确构建。以S.suis 05ZYH33株和本实验室前期构建的GFP-pbp1b为对照,培养P-GFP-pbp1b菌株并测定OD600nm值,绘制各菌株的生长曲线;采用western blot检测P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b融合蛋白的表达水平,并与GFP-pbp1b菌株进行比较;利用Alexa Fluor 633-WGA染色,经超高分辨显微镜观察GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态及GFP-PBP1b融合蛋白在S.suis细胞中的定位。生长曲线结果显示,S.suis融合菌株GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b均正常生长;western blot结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株均能够表达GFP-PBP1b融合蛋白,但强启动子驱动的P-GFP-pbp1b菌株中GFP-PBP1b蛋白表达量较GFP-pbp1b菌株提高了6倍(P<0.01);超高分辨显微镜观察结果显示,GFP-pbp1b和P-GFP-pbp1b菌株形态均正常,GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较弱,难以定位GFP-PBP1b,而P-GFP-pbp1b菌株中GFP荧光较强,能够明显观察到融合蛋白GFP-PBP1b定位在S.suis的细胞横隔和两极。本研究通过构建高表达GFP-PBP1b融合蛋白的P-GFP-pbp1b菌株首次观察到PBP1b在S.suis中的细胞定位,为进一步研究PBP1b在S.suis细胞壁肽聚糖合成中的作用奠定了基础。

具有糖基转移抑制活性的抗生素研究进展

细菌细胞壁的骨架肽聚糖的生物合成过程在抗生素治疗中具有重要地位。随着细菌耐药性日益严重,糖基转移过程成为新型抗生素极有潜力的靶标。近年来,糖基转移酶的三维结构的确定,酶与抑制剂复合物结构及其相互作用的详细阐述,都为筛选和研究抑制糖基转移活性的新型抗生素提供了新的突破点。文中依照作用机制的不同,依次论述了直接抑制糖基转移酶活性的抗生素——默诺霉素及其类似物、万古霉素疏水衍生物,和作用于底物脂Ⅱ的抗生素——万古霉素和替考拉宁、雷莫拉宁、硫醚抗生素及一些推测的底物结合物,就其近年的研究进展做一综述。

某医院儿科感染耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及femA、mecC、PVL耐药基因特点

目的探讨某三甲医院儿科感染耐药金黄色葡萄球菌检出特点及femA、mecC、PVL耐药基因表达改变。方法选择2018年1月-2020年3月医院门诊及住院儿科临床标本分离出的金黄色葡萄球菌株149株,将其分为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)组及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)组,对检出金黄色葡萄球菌标本来源分布及MRSA组、MSSA组耐药性特点进行比较;比较两组患儿的临床资料及预后情况;采用聚合酶链式扩增反应对菌株DNA中femA、mecC、PVL耐药基因进行检测。结果149株检出金黄色葡萄球菌中痰液标本61株占40.94%,检出率最高;MRSA检出率为35.57%(53/149),MRSA组对克林霉素耐药率高于MSSA组(P<0.05),两组对其余抗菌药物耐药率差异无统计学意义;所有检出金黄色葡萄球菌对万古霉素、替拉考宁、利奈唑胺耐药率均为0;MRSA组及MSSA组femA基因检出率均为100.00%,mecC检出率均为0,PVL检出率差异无统计学意义。MRSA组预后不良发生率高于MSSA组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论本地区SA携带femA、mecC、PVL耐药基因与国内报道无明显差异,MRSA感染患儿预后相对较差,应保持持续关注,为感染防控提供完善的数据。