山奈酚对高糖诱导的人肾上皮细胞增殖与凋亡的影响

目的 探究山奈酚对高糖诱导人肾上皮细胞(Hkb20)增殖及凋亡的影响。方法 分组培养人肾上皮细胞分为正常糖浓度组(对照组)、高糖组、氯沙坦组(阳性对照)和不同浓度山奈酚组(10μmol/L、30μmol/L、50μmol/L山奈酚与高糖共同作用)。采用CCK-8法和AV/PI法应用流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况,qRT-PCR检测TGF-β1和Smad3 mRNA水平的表达,Western blot法检测细胞因子TGF-β1和Smad3蛋白含量。结果 高糖能诱导人肾上皮细胞增殖降低,使细胞凋亡率升高,增加TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平(P<0.05)。不同浓度山奈酚处理后,山奈酚能显著增强细胞增殖和降低细胞凋亡率。同时TGF-β1和Smad3 mRNA和蛋白的表达水平下降,且呈剂量依赖性(P<0.05)。结论 山奈酚可逆转高糖诱导的人肾上皮细胞增殖降低和凋亡增加。这说明山奈酚可能是通过TGF-β1/Smad3信号通路抑制高糖环境下人肾上皮细胞的增殖降低和凋亡增加,从而最终导致肾脏纤维化。

原代肾上皮细胞改良培养方法

背景：目前国内对上皮细胞的研究多采用细胞株的方式,但其离体时间长,细胞易产生变异,而原代培养则与体内状态更相近,希望能为组织工程肾脏相关研究提供肾上皮细胞来源。目的：探索原代肾上皮细胞培养的条件和方法。建立一套高效快捷的原代肾上皮细胞培养方案。设计、时间及地点：单一样本观察,开放性实验,于2007-12/2008-03在武汉大学病毒学国家重点实验室分子病毒与癌研究室完成。材料：新生2~4dSPF级雄性SD大鼠鼠婴12只。方法：取SD大鼠,切取双侧肾脏组织,将其反复剪成约1mm×1mm×1mm块,加入2.5g/L的胰酶和0.4g/L乙二胺四乙酸,放入37℃恒温水浴箱消化,30min后移至200目钢网过滤,去除未消化组织块和细胞团,收集网下悬液1000r/min低温离心5min,用DMEM（pH7.2）培养基制成细胞悬液,以4×108L-1密度接种于培养瓶中,置CO2培养箱中培养。再将细胞悬液接种到一个培养瓶内,静止培养30min,镜下观察细胞部分贴壁,将培养液连同尚未贴壁细胞一起吸到另一瓶内,继续培养,重复上述操作一次,纯化肾上皮细胞。主要观察指标：以4×108L-1密度接种于培养瓶中培养。用4g/L锥虫蓝染色检测肾上皮细胞的存活率,不着色者为存活细胞。并观察肾上皮细胞的形态学变化、贴壁率。结果：肾上皮细胞存活率为95.20%,4h约60%的细胞贴壁,12h85%以上的细胞已经贴壁。24h后肾上皮细胞伸出伪足呈梭形、多角形,具有胞核一两个,细胞大小均匀,生长迅速,三四天后形成细胞簇,最后肾上皮细胞连接成片生长。结论：该肾上皮细胞培养方法存活率、贴壁率高,是一种可靠的肾上皮细胞培养方法。

鸡传染性支气管炎病毒在鸡肾上皮细胞中培养条件的优化研究

鸡传染性支气管炎病毒(IBV)具有严格的上皮细胞嗜性。由于缺乏可供IBV复制的传代细胞系,从而阻碍了从细胞水平研究其复制、致病等分子机制。掌握鸡肾上皮细胞等原代细胞的制备、纯化及培养技术显得尤为关键。本项目组通过选择不同日龄的SPF鸡胚或雏鸡进行肾上皮细胞的制备,同时对消化酶、纯化方式及培养条件进行筛选优化,进一步采用具有EGFP标签的r H120-EGFP/5a重组病毒鉴定培养的鸡肾上皮细胞。结果表明:选择1日龄雏鸡,通过胶原酶Ⅰ消化制备的鸡肾上皮细胞的活力最佳;采用多次离心法能有效去除大量单细胞,从而达到纯化上皮细胞的目的;3%胎牛血清足够提供上皮细胞生长所需的营养,并能抑制CEF的生长。试验探索并优化了鸡肾上皮细胞制备及培养的条件,为禽源上皮细胞系的建立和IBV分子致病机制的研究奠定了基础。

褪黑素抑制原代培养鸭肾上皮细胞c－fos的表达

本研究采用Ｆｏｓ蛋白免疫组化染色方法观察了胎牛血清对原代培养鸭肾上皮细胞ｃ─ｆｏｓ表达的刺激作用及褪黑素的阻断作用。以每一视野Ｆｏｓ染色阳性细胞的百分比为指标，每组实验观察１４至１７个视野。实验结果显示，正常对照组平均每视野Ｆｏｓ染色阳性细胞为４４．３１±２．７７％，胎牛血清刺激组为６３．０７±３．９３％，明显高于对照组（Ｐ＜０．０１），胎牛血清加１０￣（－６）ｍｏｌ／Ｌ褪黑素组为３５．２９±３．２２％，明显低于单纯胎牛血清刺激组（Ｐ＜０．０１），但与对照组无明显差异（Ｐ＞０．０５）。该结果表明褪黑素可以抑制原代培养鸭肾上皮细胞ｃ─ｆｏｓ表达。

兔肾上皮细胞cDNA表达文库的建立

为筛选兔瘟病毒在兔肾上皮细胞(rabbit kidney epithelial cells,RK13)上的受体,从RK13细胞中提取基因组总RNA,然后用链霉亲和素磁珠(SA-PMP)纯化mRNA,再用SMART(Switching methanism at 5 end ofRNA transcript)技术合成cDNA第1链。采用长距离PCR(long-distance-PCR,LD-PCR)方法扩增双链cDNA,经纯化后克隆到真核表达载体pEXP-Lib中。最后,电转化宿主菌(DH5α),构建了RK13细胞的全长cDNA真核表达文库。鉴定结果表明,该文库插入的cDNA片段平均长度达到1.0 kb,库容量达到2.55×105CFU。

罗红霉素对转染HERG基因人胚肾上皮细胞HERG钾通道的抑制作用

目的:研究罗红霉素对转染HERG基因人胚肾上皮细胞(HEK-293)HERG钾通道的抑制作用。方法:采用磷酸钙瞬时转染法分别将野生型、Y652A和F656C突变型HERG基因转染HEK-293细胞。观察不同浓度的罗红霉素对野生型HERG钾通道电流量效曲线、激活和失活曲线的影响,以及对突变型HERG钾通道电流的作用;HERG钾通道电流的记录采用全细胞膜片钳技术。结果:罗红霉素(0.1、1、3、10、30、100和300μmol/L)浓度依赖性地抑制野生型HERG钾通道电流,其IC50为(55.8±9.1)μmol/L,对野生型HERG钾通道电流的激活曲线和失活曲线无影响(激活曲线:tV1/2=1.011,tk=1.824;失活曲线:tV1/2=0.749,tk=0.859,P均>0.05);与野生型HERG比较,Y652A和F656C突变型HERG可显著减弱100、300和1000μmol/L罗红霉素对HERG钾通道电流的阻断作用(tY652A=18.908、18.184和26.738,tF656C=2.926、4.260和4.143,P均<0.05)。结论:罗红霉素能阻断HEK-293细胞HERG钾通道,Y652A和F656C是罗红霉素与HERG钾通道结合的关键位点。

丙烯酰胺对新生大鼠肾上皮细胞增殖分化影响

目的研究丙烯酰胺(ACR)对新生大鼠肾上皮细胞增殖分化的影响。方法利用新生大鼠肾上皮细胞进行原代培养,观察不同剂量ACR(0.1,1.0,10.0,50.0,100.0μg/ml)对细胞形态学及细胞生长与分化过程影响,同时测定蛋白质含量、丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。结果ACR处理各组细胞体积小,组集落存活率分别为对照组的97%,86%,80%,56%,38%;蛋白质相对含量分别为对照组的92%,90%,85%,53%,33%。ACR剂量为10.0,50.0,100.0μg/ml时和对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01),并显示剂量-效应关系;ACR处理各组MDA含量有升高的趋势,SOD活性有下降的趋热,ACR剂量为10.0,50.0,100.0μg/ml时与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论ACR能抑制新生大鼠肾上皮细胞增殖和分化,可能与其能抑制蛋白质合成、DNA有关。

二磷酸腺苷对肾上皮细胞的细胞骨架的作用

目的：探讨二磷酸腺苷（ＡＤＰ）对细胞的促生长作用。方法：用间接免疫荧光法观察ＡＤＰ对ＢＳＣ－１细胞骨架成分的影响。结果：在用ＡＤＰ前，荧光下非洲绿猴肾上皮细胞（ＢＳＣ－１）的细胞骨架中角质蛋白纤维成分８（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ８，ＣＫ８）以星形位于细胞核周围，ＡＤＰ作用２ｍｉｎ后，ＣＫ８开始伸长，６ｈ后伸长到最大程度，充满整个细胞，１２ｈ后开始萎缩，２４ｈ后ＣＫ８又以星形位于细胞核的周围。而其它细胞骨架成分未见变化。结论：ＡＤＰ是肾小管上皮细胞最强的一种有丝分裂源。

活性氧作用下肾上皮细胞的药物保护及机理

观察了三磷酸腺苷（ＡＴＰ）、过氧化氢酶（ＣＡＴ）及异搏停（ＶＥＲ）对活性氧作用下的肾上皮细胞（ＲＥＣ）的保护效果，以探讨其可能机制。结果显示预先应用ＡＴＰ、ＣＡＴ和ＶＥＲ均使处于活性氧作用下肾上皮细胞培养基中的乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）活性及细胞活力维持或接近正常水准。提示能量危机、氧自由基（ＯＦＲ）毒性和钙超载可能是细胞缺血／再灌注（Ｉ／Ｒ）损伤病理生理中的重要环节，向细胞供能、清除ＯＦＲ及维持钙稳态是防治肾Ｉ／Ｒ损伤的重要措施。

淫羊藿苷联合胚胎干细胞对造影剂肾病大鼠模型肾上皮细胞凋亡的影响

目的:探讨淫羊藿苷联合胚胎干细胞对造影剂肾病(CIN)大鼠模型肾上皮细胞的作用及其可能的机制,为临床上淫羊藿苷联合应用提供实验依据。方法:选取SD大鼠50只,随机分为对照组、模型组、淫羊藿苷组、干细胞组和联合给药组,每组10只,除对照组外其他各组大鼠尾静脉注射吲哚美辛(INDO)、N-硝基-LO-精氨酸甲酯(L-NAME)和泛影葡胺建立CIN大鼠模型。检测造模前后血肌酐(Scr)值;采用半定量RT-PCR和Western blotting法检测细胞凋亡相关因子p38MAPK和caspase 3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术定量检测肾上皮细胞凋亡率。结果:Scr测定,注射造影剂48h后,大鼠Scr值明显升高,提示造模成功。与模型组比较,联合给药组大鼠Scr值明显下降(P<0.05)。与模型组比较,淫羊藿苷组、干细胞组和联合给药组大鼠p38MAPK和caspase-3mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05);联合给药组大鼠肾上皮细胞凋亡率明显低于淫羊藿苷组和干细胞组(P<0.05)。结论:联合给药对CIN模型大鼠的肾上皮细胞有保护作用,其作用机制可能与抑制细胞凋亡通路中相关因子有关。

伏马毒素B1对猪肾上皮细胞增殖的影响

研究旨在探究伏马毒素B1(FB1)对猪肾上皮细胞增殖的影响,通过MTT检测FB1对PK15细胞活力和qPCR检测周期相关基因的mRNA表达水平.结果表明,FB1显著减少细胞活力,降低细胞核增殖抗原PCNA和周期蛋白Cyclin B和Cyclin D的mRNA表达水平,升高P21和P27的mRNA表达水平.说明FB1可通过调控细胞周期相关基因的表达抑制猪肾上皮细胞增殖.

锁阳多糖对H_2O_2诱导非洲绿猴肾上皮细胞氧化损伤的保护作用

目的研究锁阳多糖对过氧化氢(H2O2)诱导非洲绿猴肾上皮(Verda Reno,简称VERO)细胞损伤的保护作用。方法建立H2O2致VERO细胞氧化损伤模型,MTT法检测细胞存活率;通过荧光光度法检测caspase-3活性;利用荧光探针DCFH-DA对荧光染色的胞内活性氧(ROS)检测其荧光强度;化学比色法测定细胞中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,以及细胞培养液中丙二醛(MDA)水平。结果锁阳多糖能明显改善H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤,与模型组相比,锁阳多糖组可使细胞存活率升高,细胞内的ROS的积累量显著降低(P<0.01),caspase-3活性下降(P<0.05),同时细胞内的SOD和GSH-Px活性明显增加(P<0.01),细胞培养液中的MDA水平明显降低(P<0.01)。结论锁阳多糖能对H2O2诱导的VERO细胞的氧化损伤保护提示其具有潜在的防治肾脏相关疾病的作用。

猪肾上皮细胞Ⅰ型干扰素受体1敲除对伪狂犬病毒复制的影响

目的探讨Ⅰ型干扰素受体1 (IFNAR1)对伪狂犬病病毒(PRV)复制的影响。方法以慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建猪肾上皮细胞(PK15)敲除IFNAR1基因的稳定细胞系。运用细胞活力检测、荧光观察、流式细胞术检测、滴度测定、Real-time PCR等技术进行IFNAR1功能验证。结果随着PRV感染时间延长,敲除IFNAR1基因可以显著促进PRV-TK mRNA的转录,PRV-gE蛋白的翻译以及子代病毒的毒力。结论IFNAR1在抑制PRV增殖中发挥重要作用。

非洲绿猴肾上皮细胞损伤及诱导草酸钙晶体

采用非洲绿猴肾上皮细胞系（Vero）为研究对象，建立了其H2O2氧化性损伤模型，研究了正常与损伤不同程度的Vero细胞诱导草酸钙（CaOxa）结晶的差异，采用CCK-8法检测了细胞的活力；采用流式细胞术检测了细胞的线粒体膜电位的变化；采用扫描电子显微镜（SEM）观察了Vero细胞的形态变化和所诱导的晶体．结果表明，损伤程度不同的Vero细胞在过饱和的CaOxa溶液中，诱导CaOxa晶体的情况存在差异，细胞损伤程度越严重，就会加剧诱导CaOxa晶体的生长．

猪肾上皮细胞SLA-1基因的克隆及分子结构特征分析

【目的】利用猪肾上皮细胞15(PK15)建立系统的猪白细胞抗原1(SLA-1)抗原表位筛选系统。【方法】提取PK15细胞总RNA,设计特异性引物,应用RT-PCR方法扩增SLA-1基因(SLA-1*PK15),将该基因克隆到pMD18-T载体上,并进行双酶切及测序鉴定;利用DNAMAN 5.2.2、Mega 5.0、Multalin及同源建模进行系统进化树、二级结构、三级结构分析。【结果】RT-PCR扩增获得约1400 bp条带,质粒提取和酶切鉴定结果表明SLA-1成功插入pMD18-T载体;测序结果证实该基因共1419 bp,其中2-1087 bp为编码区,共编码361个氨基酸,信号肽为21个氨基酸,符合SLA-1基因特征。进化树分析结果显示,SLA-1*PK15与SLA-1*wxd(中国梅山猪)和SLA-1*0401(中国巴马小型猪)进化关系最近,而与SLA-1*lr02(丹麦长白猪)及SLA-1*0509(中国西藏野猪)进化关系较远。胞外区氨基酸比较分析表明,PK15细胞SLA-1基因与其他SLA-1基因胞外区主要变异位点存在于α1区和α2区,α3区的变异位点较少,无特征性氨基酸变异位点。PK15细胞SLA-1蛋白的二级结构主要以α-螺旋和β-折叠为主。同源建模结果显示,SLA-1蛋白具有SLA classⅠ典型的三级结构,α1区和α2区构成抗原多肽结合区。【结论】SLA-1基因稳定存在于PK15细胞,PK15细胞具有作为SLA-1抗原表位筛选系统的潜在应用价值。

脂质体介导转染犬肾上皮细胞的方法改进与优化

本文使用带绿色荧光蛋白报告基因的真核质粒pCI-neo-EGFP作为外源DNA,将脂质体介导转染犬肾上皮细胞(MDCK)的常规转染法改进为悬浮法,并比较了二者在转染36h后的转染效果,结果显示悬浮法的转染效率显著优于常规法。研究了悬浮转染法不同DNA用量、脂质体/DNA比例和悬浮孵育时间对转染效率和细胞活力的影响。流式细胞术检测结果显示,转染效率与DNA用量呈正相关依赖关系;在DNA用量相同时,转染效率随着脂质体/DNA比例升高呈先上升后下降的趋势;DNA用量为1μg、脂质体/DNA比例为4∶1、悬浮孵育时间为20 min时转染效率最高(21.07%±0.76%)。利用CCK-8细胞毒性试剂盒测定不同条件下的细胞活力,结果表明细胞活力随DNA用量和脂质体/DNA比例的升高及悬浮孵育时间的延长而降低,当DNA用量(0.25μg)和脂质体/DNA比例(2∶1)最低、悬浮孵育20min时,细胞活力最高(95.67%±3.72%),而转染效率最高时细胞活力为69.95%±3.01%。研究结果为进一步建立稳定转染细胞研究模型提供了基础资料。

姜黄素对玉米赤霉烯酮诱导的猪肾上皮细胞凋亡的保护作用

为探究姜黄素(Cur)对玉米赤霉烯酮(ZEA)诱导的猪肾上皮细胞(PK-15)凋亡的影响及其可能的保护机制,体外培养PK-15细胞,给予玉米赤霉烯酮和不同浓度姜黄素(6.25、12.5、25μmol/L)处理24 h,通过MTT法测定姜黄素和ZEA对PK-15细胞活力的影响;荧光显微镜观察Hoechst 33342活细胞染色判断细胞凋亡情况;JC-1法检测细胞线粒体膜电位变化;试剂盒检测细胞上清液中LDH活性;实时荧光定量PCR测定细胞中的Bax、Bcl-2和Caspase-3的mRNA表达水平;Western blot测定Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达水平.结果表明,浓度在25μmol/L以下的姜黄素对PK-15细胞几乎没有毒性,ZEA的半数抑制浓度(IC50)为36.55μg/mL;姜黄素极显著提高ZEA降低的PK-15细胞活力(P<0.01),缓解ZEA引起的细胞凋亡,极显著降低ZEA诱导的LDH活性(P<0.01),显著降低ZEA引起的线粒体膜电位丢失(P<0.01);ZEA极显著(P<0.01)升高细胞中Bax和Caspase-3的mRNA和蛋白表达,极显著(P<0.01)降低Bcl-2的mRNA和蛋白表达;与ZEA组比较,+Cur6.25组的Bax mRNA表达量和Bax、Caspase-3蛋白表达均极显著(P<0.01)降低,Bcl-2的蛋白表达极显著(P<0.01)降低,+Cur12.5组显著降低了Bax和Caspase-3的mRNA表达(P<0.05),极显著(P<0.01)降低Bax和Caspase-3的蛋白表达,极显著升高了Bcl-2的mRNA表达和蛋白表达(P<0.01),+Cur25组的Bcl-2的mRNA表达量和蛋白表达量极显著(P<0.01)的升高,Caspase-3的mRNA表达和蛋白表达极显著(P<0.01)降低.本研究表明ZEA诱导PK-15细胞发生凋亡,姜黄素可通过抑制线粒体凋亡途径减轻其诱导的细胞凋亡,从而起到保护作用提高细胞活力.

Epstein-Barr病毒BARF1基因协同TPA诱发猴肾上皮细胞恶性转化的研究

目的 探讨Epstein Barr病毒 (EBV)BARF1基因单独或协同佛波醇乙酯 (TPA)诱发猴肾上皮细胞恶性转化的作用。方法 用猴肾永生化上皮细胞PT1和PT7单独或进一步加促癌物TPA注射裸鼠或Scid小鼠背部皮下 ,观察成瘤情况。结果 EB病毒BARF1永生化细胞PT1和PT7在裸鼠不能形成肿瘤 ,但在免疫力严重缺陷的Scid小鼠能形成肿瘤 ,成瘤率为 6 6 7%～ 10 0 % ,成瘤时间较长为45～ 6 0d。加TPA后裸鼠及Scid小鼠均能形成肿瘤 ,裸鼠的成瘤时间为 2 0～ 2 2d ,Scid小鼠的成瘤时间为 5～ 7d。用聚合酶链反应 (PCR)可从肿瘤组织中扩增出BARF1基因。结论 EB病毒BARF1基因是致癌基因 ,甚至无需促癌物等辅助条件 。