基于hnRNPF调控的TLR4/NF-κB信号通路研究肾元颗粒对糖尿病肾脏病炎症的影响

目的:基于hnRNPF调控的TLR4/NF-κB信号通路探讨肾元颗粒对db/db糖尿病肾脏病小鼠炎症的影响及其作用机制。方法:将16只SPF级db/db小鼠随机分为模型组和肾元颗粒组,予0.2%腺嘌呤模型饲料;另取8只同背景系野生小鼠作为空白组,予普通饲料。肾元颗粒组予以肾元颗粒混悬液灌胃给药,模型组和空白组小鼠予等量双蒸水灌胃,连续12周。给药12周后代谢笼收集小鼠24 h尿液,取各组小鼠血清、肾脏组织。生化检测各组小鼠血清肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT);ELISA法检测尿液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)水平;PAS染色光镜观察肾组织病理改变;R-T PCR法检测小鼠肾脏组织中TLR4 mRNA、IL-6mRNA、IKKαmRNA、NF-κB P65 mRNA、TNF-αmRNA、hnRNPF mRNA表达水平;Western blotting检测肾脏组织中hnRNPF、TLR4蛋白表达及IKKα、NF-κB P65磷酸化水平。结果:模型组小鼠血清SCr、BUN、ALT显著高于空白组(P<0.05);肾元颗粒组小鼠血清SCr、BUN、ALT显著低于模型组(P<0.05)。模型组小鼠尿液NGAL水平显著高于空白组(P<0.05);肾元颗粒组小鼠尿液NGAL水平明显低于模型组(P<0.05)。与空白组比较,模型组小鼠肾脏组织病变严重;与模型组比较,肾元颗粒组小鼠肾脏病变有所改善。模型组小鼠肾脏组织中TLR4 mRNA、IL-6 mRNA、IKKαmRNA、NF-κB P65 mRNA、TNF-αmRNA相对表达量高于空白组(P<0.05),hnRNPF mRNA相对表达量低于空白组(P<0.05);肾元颗粒组小鼠肾脏组织中TLR4 mRNA、IL-6 mRNA、IKKαmRNA、NF-κB P65mRNA、TNF-αmRNA相对表达量低于模型组(P<0.05),hnRNPFmRNA相对表达量高于模型组(P<0.05)。模型组小鼠肾脏组织中hnRNPF蛋白相对表达量低于空白组(P<0.05),TLR4蛋白相对表达量及IKKα、NF-κB P65磷酸化水平高于空白组(P<0.05);肾元颗粒组小鼠肾脏组织中hnRNPF蛋白相对表达量高于模型组(P<0.05),TLR4蛋白相对表达量及IKKα、NF-κB P65磷酸化水平低于模型组(P<0.05)。结论:肾元颗粒可能通过hnRNPF调控的TLR4/NF-κB信号通路,抑制db/db糖尿病肾脏病小鼠炎症反应,从而改善相关生化指标,减轻肾脏损害。

基于IRE-1α/NF-κB通路探讨肾元颗粒干预糖尿病肾病的作用机制

目的基于IRE-1α/NF-κB通路探讨肾元颗粒干预糖尿病肾病(DN)的作用机制。方法选取40只SPF级7周龄db/db雄性小鼠,体重(40±2)g,按随机数字表法将其分为模型组及肾元颗粒低、中、高剂量组,每组10只;另选SPF级7周龄同系雄性野生型WT小鼠10只,体重(20±2)g,作为空白对照组。模型组及肾元颗粒低、中、高剂量组适应性饲养1周后,检测空腹血糖,以连续3次空腹血糖≥16.7 mmol/L,尿量>空白对照组的150%且持续出现蛋白尿确定为DN,随后肾元颗粒低、中、高剂量组分别予以肾元颗粒1.5、3.0、6.0 g/(kg·d)灌胃,模型组与空白对照组给予等量双蒸水灌胃,五组均连续灌胃12周。实验结束后,取五组肾脏组织,苏木精-伊红染色观察肾脏病理情况改变;实时聚合酶链反应检测五组肾脏GRP78、XBP-1S、IRE-1α、NF-κB m RNA表达情况,蛋白质印迹法检测五组肾脏GRP78、XBP-1S蛋白表达情况及IRE-1α、NF-κB磷酸化水平。结果空白对照组未见明显病变,模型组肾组织结构异常,可见肾小球萎缩变性及部分肾小管扩张,与模型组比较,肾元颗粒低、中、高剂量组均有所改善。模型组GRP78、XBP-1S、IRE-1α、NF-κB mRNA表达及GRP78、XBP-1S蛋白表达均高于空白对照组,p-IRE-1α/IRE-1α、p-NF-κB/NF-κB水平均高于空白对照组,差异有高度统计学意义(P<0.01)。肾元颗粒高、中、低剂量组GRP78、XBP-1S、IRE-1α、NF-κB mRNA表达及GRP78、XBP-1S蛋白表达均低于模型组,pIRE-1α/IRE-1α、p-NF-κB/NF-κB水平均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。肾元颗粒高剂量组GRP78、XBP-1S、IRE-1α、NF-κB mRNA及XBP-1S蛋白表达均低于肾元颗粒中、低剂量组,p-IRE-1α/IRE-1α、p-NF-κB/NF-κB水平均低于肾元颗粒中、低剂量组;肾元颗粒高剂量组GRP78蛋白表达低于肾元颗粒低剂量组;肾元颗粒中剂量组IRE-1αm RNA、GRP78蛋白、XBP-1S蛋白及p-IRE-1α/IRE-1α水平均低于肾元颗粒低剂量组,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论肾元颗粒可能通过IRE-1α/NF-κB通路抑制过度的内质网应激反应来降低肾脏的炎症反应,改善肾功能,抑制DN的进程。

肾元颗粒对慢性肾脏病3~5期非透析患者血清成纤维细胞生长因子23、成纤维细胞生长因子受体4、Klotho蛋白的影响

目的观察肾元颗粒对慢性肾脏病(CKD)3~5期非透析患者的血清成纤维细胞生长因子23(FGF23)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)和Klotho蛋白含量的影响,以探讨肾元颗粒对CKD患者血管钙化的可能作用机制。方法选取湖北省中医院2018年6月—2019年6月收治的CKD患者60例,按随机数字表法将其分为对照组(28例)和治疗组(32例)。对照组采用尿毒清颗粒治疗,治疗组采用肾元颗粒治疗。连续治疗3个月,观察两组治疗前后生化指标[血清钙、磷、甲状旁腺激素(PTH)及估算的肾小球滤过率(eGFR)]水平及血清FGF23、FGFR4和Klotho蛋白含量。结果治疗前,两组钙、磷、PTH、eGFR比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后,治疗组血清中磷、PTH含量低于对照组,钙、eGFR高于对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。治疗前,两组FGF23、FGFR4、Klotho蛋白含量比较,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后治疗组血清FGF23、Klotho蛋白含量高于对照组,FGFR4含量低与对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论肾元颗粒能够抑制FGF23、FGFR4水平,提高Klotho蛋白含量,这可能是肾元颗粒治疗CKD患者血管钙化作用机制之一。

FGF2/FGFR1/ERK信号通路在高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化中的机制及肾元颗粒的干预作用

目的:探讨FGF2/FGFR1/ERK在高糖诱导人肾小管上皮细胞转分化中的信号转导机制及肾元颗粒的干预作用。方法:以高糖(30 mmol/L)诱导HK-2细胞上皮-间充质细胞转分化建立模型,分为正常组、模型组、高渗对照组、肾元颗粒组、厄贝沙坦组及ERK阻断剂组。采用CCK-8法确定大鼠血清加入浓度,Western blot及RT-PCR检测FGF2、CollgenⅣ蛋白及mRNA表达水平,ELISA法分析各组细胞ERK及磷酸化ERK(p-ERK)水平。结果:与正常组比较,模型组FGF2、CollgenⅣ蛋白及mRNA表达显著增高(P<0.05),p-ERK水平显著增高(P<0.05)。与模型组比较,肾元颗粒组FGF2、CollgenⅣ蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.05),p-ERK水平显著降低(P<0.05)。结论:肾元颗粒含药血清能通过下调高糖诱导的HK-2细胞FGF2的表达,抑制FGF2/FGFR信号转导途径从而改善肾小管上皮细胞转分化,这可能是其防治糖尿病肾病的机制之一。

基于网络药理学探讨肾元颗粒治疗糖尿病肾病的作用机制

目的基于网络药理学探讨肾元颗粒治疗糖尿病肾病的作用机制。方法通过中药系统药理学数据库与分析平台收集肾元颗粒药物成分及作用靶点;通过GeneCards、OMIM、PharmGKB、TTD和DrugBank数据库收集糖尿病肾病靶标基因,将药物和疾病靶点取交集得到该方治疗糖尿病肾病交集靶点;采用Cytoscape 3.7.2软件构建肾元颗粒成分-交集靶点-疾病网络;采用STRING数据库分析交集靶点构建蛋白互作网络;采用CytoNCA拓扑属性构建关键靶点蛋白拓扑图,根据节点度值和中介中心度值对交集基因靶点及化合物成分进行排序;借助R语言对关键靶点行GO生物学过程和KEGG代谢通路分析。结果筛选得到肾元颗粒化合物成分35种,预测作用靶点292个,药物与糖尿病肾病交集靶点数67个;将交集蛋白上传至STRING数据库,获得55个交集蛋白;关键靶点拓扑图显示前3个化合物成分是槲皮素、7-O-甲基异丁香酚、山柰酚;关键靶点是蛋白激酶B、血管内皮生长因子A、表皮生长因子受体;GO富集分析显示主要涉及G蛋白偶联受体等生物过程,突触前膜、后膜等细胞成分;G蛋白偶联胺受体活性等分子功能;KEGG代谢通路富集分析结果显示主要涉及刺激神经组织作用通路等。结论初步验证了肾元颗粒组方合理性及其治疗糖尿病肾病科学性,并为深入探讨肾元颗粒治疗糖尿病肾病机制奠定理论基础。

肾元颗粒影响糖尿病小鼠肾脏中miR-199b-5p与钙磷代谢的研究

目的:探讨肾元颗粒对糖尿病小鼠肾脏中miR-199b-5p/Klotho/FGFR-1/EGR-1通路及钙磷代谢的影响。方法:链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)诱导小鼠糖尿病模型,模型成功后随机分为肾元颗粒组[4.55 g/(kg·d)]10只和模型对照组10只,另设空白对照组10只。给予相应药物灌胃8周,给药前后检测血糖以及血清中肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、钙(Ca)和磷(P),采用RT-q PCR检测肾脏组织中miR-199b-5p、Klotho、FGFR-1和EGR-1核糖核酸表达情况,采用western-blot(WB)法检测Klotho、FGFR-1和EGR-1蛋白表达情况,检测小鼠右下肢平均骨密度。结果:用药后与空白对照组相比,模型对照组P、SCr升高(P<0.05),Ca、骨密度明显降低(P<0.05),同时miR-199b-5p和EGR-1表达上调(P<0.05),Klotho和FGFR-1表达下调(P<0.05)。用药后与模型对照组比较,肾元颗粒组P、SCr降低(P<0.05),Ca升高(P<0.05),miR-199b-5p、EGR-1表达下调(P<0.05),Klotho、FGFR-1表达上调(P<0.05)。结论:肾元颗粒缓解糖尿病肾损害和改善钙磷代谢异常的作用机制,或与miR-199b-5p/Klotho/FGFR-1/EGR-1通路有关。

基于FGF23-Klotho轴探讨肾元颗粒对db/db糖尿病肾病小鼠骨骼的保护作用

目的观察肾元颗粒对db/db糖尿病肾病小鼠FGF23-Klotho轴的影响,并探讨其对骨骼保护的可能机制。方法 30只db/db小鼠随机分为模型组(20 mL·kg-1)、肾元颗粒组(6.0 g·kg-1)和厄贝沙坦组(30mg·kg-1),10只同窝野生(wild type,WT)小鼠作为空白组(20 mL·kg-1),各组小鼠给药容量均为(20 mL·kg-1)。连续灌胃12周后,采用生化检测仪检测血钙、血磷含量;酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组血清成纤维化生长因子23(Fibroblast growth factor 23,FGF23)含量,以及骨骼钙盐含量、骨骼碱性磷酸酶(ALP)活性;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测骨骼骨保护素(osteoprotegerin,OPG)蛋白表达水平;免疫荧光双标检测肾脏Klotho和成纤维化生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)蛋白,并于激光共聚焦下观察拍照。结果与正常组比,模型组小鼠血钙减少,血磷含量升高(P <0.05),小鼠血FGF23含量显著升高(P <0.05),小鼠骨骼中钙盐含量减少,ALP活性降低(P <0.05),小鼠骨骼OPG蛋白表达减少(P <0.05),小鼠肾脏Klotho和FGFR1免疫荧光双标阳性细胞数显著减少(P <0.05);与模型组比,肾元颗粒组小鼠血钙升高,血磷减低(P <0.05),血FGF23含量降低(P <0.05),骨骼钙盐含量升高,骨骼ALP活性升高(P <0.05),骨骼OPG蛋白表达量增加(P <0.05),肾脏免疫荧光双标阳性细胞数增多(P <0.05)。结论肾元颗粒能改善db/db糖尿病肾病小鼠骨质的流失,而其作用机制可能与FGF23-Klotho轴平衡恢复有关。

肾元颗粒对db/db糖尿病肾病小鼠血管钙化的改善作用及其机制

目的:通过高磷诱导db/db糖尿病肾病(DN)小鼠血管钙化,探讨肾元颗粒对db/db DN小鼠血管钙化的改善作用及其可能机制。方法:将20只SPF级db/db小鼠随机分为模型组和肾元颗粒组(n=10),同系背景野生型(WT)小鼠作为空白组(n=10)。给药12周后,取各组小鼠血清、肾脏和胸主动脉组织。ELISA法检测各组小鼠血清FGF23水平,HE和von Kossa法检测各组小鼠胸主动脉病理形态表现以及钙盐沉积情况,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)法检测各组小鼠肾脏组织中Klotho mRNA和胸主动脉组织中Pit-1、Runx2及SM22αmRNA表达水平,Western blotting法检测各组小鼠肾脏组织中Klotho蛋白和胸主动脉组织中Pit-1、Runx2及SM22α蛋白表达水平,免疫组织化学法检测各组小鼠胸主动脉组织中Pit-1蛋白表达水平,免疫荧光法检测各组小鼠胸主动脉组织中SM22α和Runx2蛋白表达水平。结果:与空白组比较,模型组小鼠血清FGF23水平明显升高(P<0.05),肾脏组织中Klotho mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),胸主动脉组织中Pit-1和Runx2 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.01),SM22αmRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),胸主动脉组织中Pit-1和Runx2蛋白表达水平明显升高(P<0.01),SM22α蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。与模型组比较,肾元颗粒组小鼠血清FGF23水平降低(P<0.05),肾脏组织中Klotho mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01),胸主动脉组织中Pit-1和Runx2 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.01),胸主动脉组织中SM22αmRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。结论:肾元颗粒可通过上调小鼠肾脏组织中Klotho蛋白表达水平,减少Pit-1表达水平,抑制FGF23/Pit-1信号通路,调节血管平滑肌细胞(VSMC)的表型转化,达到血管保护作用。

基于网络药理学探讨肾元颗粒治疗慢性肾疾病——矿物质和骨代谢异常的作用机制

目的筛选肾元颗粒有效化合物成分,构建肾元颗粒-成分-预测靶点网络,分析关键靶点间的相关作用,探讨肾元颗粒治疗慢性肾疾病-矿物质和骨代谢异常(CKD-MBD)的潜在机制。方法通过TCMSP、TCMID和Batman-TCM数据库,收集肾元颗粒化合物成分和作用靶点,采用Cytoscape软件绘制肾元颗粒-成分-预测靶点网络。通过Genecards、OMIM、CTD、TTD、DisGeNET和PharmGKB数据库检索CKD-MBD的靶点,与肾元颗粒预测靶点取交集获得共同靶点。采用String数据库分析共同靶点的蛋白与蛋白相互作用网络,并用ClueGO插件工具进行GO生物学过程和KEGG代谢通路的富集分析。结果筛选得到肾元颗粒的化合物成分39种,预测作用靶点112个,其中与CKD-MBD相关的靶点56个。GO生物学功能显示这些靶点主要涉及机械刺激反应、体外凋亡信号、酮反应、细胞对异种生物刺激反应和铁离子应答等生物学过程,KEGG富集分析显示主要涉及的通路有细胞凋亡信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、p53信号通路、TNF信号通路和IL-17信号通路等。结论该研究表明肾元颗粒含有多种活性化合物成分,可以作用于多个靶点和多种信号通路发挥防治CKD-MBD的作用,体现了肾元颗粒复方具有多成分、多靶点和多途径的作用特点,并为后续研究肾元颗粒防治CKD-MBD的机制提供了新的线索和思路。

基于Klotho调控的TGF-β1/Egr1信号通路探讨肾元颗粒对db/db糖尿病肾病小鼠肾脏保护作用

目的:探讨肾元颗粒对db/db糖尿病肾病(DN)小鼠肾脏保护的可能作用机制。方法:将db/db小鼠随机分为模型组、肾元颗粒组、厄贝沙坦组,同窝野生(WT)小鼠作为空白对照组。观察各组小鼠肾脏病理变化;RT-PCR法检测小鼠肾组织Klotho、Egr1、TGF-β1、Fibronectin、CollagenⅠmRNA表达;Western blot检测肾组织Egr1、TGF-β1、Fibronectin、CollagenⅠ蛋白表达;免疫荧光法检测肾脏Klotho蛋白表达。结果:与空白对照组比较,模型组血清BUN、Scr水平显著升高(P<0.01),病理改变较重,Egr1、TGF-β1、Fibronectin、CollagenⅠmRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01),Klotho mRNA表达显著减少(P<0.01)。与模型组比较,厄贝沙坦组和肾元颗粒组小鼠血清BUN、Scr水平显著降低(P<0.01,P<0.05),病理改变均较模型组轻,Egr1、TGF-β1、Fibronectin、CollagenⅠmRNA表达显著降低(P<0.01),Klotho mRNA和蛋白表达显著增加(P<0.01)。结论:肾元颗粒能够改善db/db DN小鼠的肾功能,其作用机制可能与Klotho调控的TGF-β1/Egr1信号通路有关。

肾元颗粒通过线粒体介导平滑肌细胞凋亡对糖尿病肾病模型小鼠血管钙化的改善作用

目的:探讨肾元颗粒通过线粒体介导平滑肌细胞凋亡对糖尿病肾病小鼠血管钙化的影响。方法:将40只SPF级db/db小鼠随机分为模型组和肾元颗粒高、中、低剂量组,每组10只,10只同系背景野生型(WT)小鼠作为对照组。模型组、肾元颗粒各剂量组予以高磷饲料(含磷1.2%),对照组予以普通饲料,肾元颗粒高、中、低剂量组分别予以6.0、3.0、1.5g·kg^(-1)·d^(-1)肾元颗粒灌胃,对照组、模型组予以等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃,干预12周后,检测血清钙(Ca)、磷(P)、血肌酐(CREA)、尿素氮(UREA)。Von Kossa染色观察小鼠胸主动脉病理形态变化以及钙盐沉积情况,透射电镜观察胸主动脉血管平滑肌细胞线粒体结构形态,RT-PCR法检测各组小鼠胸主动脉B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、B淋巴细胞瘤-2关联X蛋白(Bax)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、成骨细胞特异性转录因子(Osterix)mRNA表达水平,Western blot、免疫组化法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9、细胞色素C(Cyt-C)蛋白表达水平,ELISA法检测胸主动脉匀浆上Bcl-2、Bax蛋白表达含量。结果:透射电镜显示模型组平滑肌细胞呈合成型,线粒体结构肿胀,空泡变,线粒体基质熔解,嵴消失,而肾元颗粒各剂量组平滑肌细胞呈半合成型或收缩型,线粒体结构呈不同程度改善,肿胀减轻,嵴存在,膜较完整。Von Kossa染色显示模型组血管壁可见明显钙盐沉积。与对照组比较,模型组血P、CREA、UREA水平升高显著,血Ca水平显著下降,胸主动脉Osterix mRNA表达显著升高,α-SMA mRNA表达显著下降,Bcl-2表达显著下调,Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C表达显著上调(P<0.01);与模型组比较,肾元颗粒各剂量组血P、CREA、UREA水平显著下降(P<0.01,P<0.05),血Ca水平显著升高(P<0.01)。肾元颗粒中、高剂量组胸主动脉Osterix、Bax、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C表达显著降低,α-SMA、Bcl-2表达显著升高(P<0.01,P<0.05)。结论:肾元颗粒可改善糖尿病肾病db/db模型小鼠的肾功能及血管钙化程度,其机制可能与改善线粒体介导的血管平滑肌凋亡有关。

肾元颗粒含药血清对高糖诱导人肾小管上皮-间充质细胞转分化中Klotho/FGFR1/FGF2信号途径的影响

目的探讨高糖诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)上皮-间充质细胞转分化过程中Klotho/FGFR1/FGF2信号转导途径的表达及肾元颗粒含药血清的干预作用。方法 30只Wistar大鼠采用随机数字表法分为空白组、肾元颗粒组及厄贝沙坦组,每组10只,灌胃7天后门静脉取血。采用CCK-8法测定细胞增殖率以确定大鼠血清加入浓度,以LDH法检测含药血清对HK-2细胞的毒性作用。以高糖(30 mmol/L)诱导HK-2细胞上皮-间充质细胞转分化建立模型,分为正常组、模型组、高渗对照组、肾元颗粒组、厄贝沙坦组及ERK阻断剂组。免疫荧光检测Klotho及FGF2的表达,Western blot及RT-PCR检测Klotho、FGF2、ECadherin、α-SMA、FN、CollgenⅣ蛋白及m RNA表达水平,Western blot分析各组细胞ERK及磷酸化ERK(p-ERK)水平。结果 CCK-8法结果显示大鼠空白血清培养HK-2细胞最佳浓度为20%。LDH结果显示,与10%胎牛血清比较,肾元颗粒含药血清、厄贝沙坦含药血清对细胞LDH活性的影响差异无统计学意义(P> 0. 05)。与正常组比较,模型组Klotho、E-Cadherin蛋白及m RNA表达降低(P <0. 05),FGF2、α-SMA、FN、CollgenⅣ蛋白及m RNA表达增高(P <0. 05),p-ERK水平显著增高(P <0. 05)。与模型组比较,肾元颗粒组Klotho、E-Cadherin蛋白及m RNA表达显著增高(P <0. 05),FGF2、α-SMA、FN、CollgenⅣ蛋白及m RNA表达显著降低(P <0. 05),p-ERK水平显著降低(P <0. 05)。结论肾元颗粒含药血清能改善高糖诱导的人肾小管上皮细胞转分化,其作用机制可能与调节Klotho/FGFR1/FGF2信号通路有关。

肾元颗粒通过调控FGF23/CaMKⅡ信号通路对糖尿病肾病db/db小鼠心肌肥大与凋亡的影响

目的:通过观察db/db糖尿病肾病(DN)小鼠的心肌肥大和心肌损伤,进而探讨肾元颗粒改善DN小鼠心肌肥大和凋亡的可能作用机制。方法:db/db小鼠45只随机分为模型组、厄贝沙坦组和肾元颗粒组,15只同背景野生型(WT)小鼠为空白组。ELISA检测血清成纤维细胞生长因子23(FGF23)和尿微量白蛋白含量;全自动生化仪检测肾功能;小鼠肾脏和心脏病理采用HE和Masson染色;Real-time PCR肾脏Kl和心脏ANP、Bax、Bcl-2 mRNA;Western blot检测肾脏Kl和心脏Bax、Bcl-2蛋白;免疫组化检测心脏ANP、p-CaMKⅡ蛋白含量。结果:与空白组比较,模型组小鼠肾单位出现受损,小球系膜基质增多,基底膜增厚,肾小管上皮细胞肥大,心脏心肌细胞排列紊乱,体积增大,伴有明显的胶原纤维沉积,血清FGF23、BUN、Scr和24h尿微量白蛋白含量增加(P<0.01),肾脏Kl mRNA和蛋白显著减少(P<0.01),心脏ANP mRNA、Bax mRNA和蛋白表达增加(P<0.01),Bcl-2 mRNA和蛋白表达量减少(P<0.01),心脏p-CaMKⅡ蛋白含量增加;灌胃12周后,肾元颗粒组和厄贝沙坦组肾脏和心脏病理表现均显著减轻,血清FGF23含量减少(P<0.05,P<0.01),肾脏Kl和心脏Bcl-2mRNA和蛋白含量增加(P<0.01),心脏ANP mRNA和Bax mRNA及蛋白含量减少(P<0.01),心脏p-CaMKⅡ蛋白表达减少。结论:肾元颗粒可通过上调肾脏Kl蛋白表达,降低CaMKⅡ活性,抑制FGF23/CaMKⅡ信号通路来抑制肥大细胞表达,降低凋亡的发生,达到心肌细胞的保护作用。

Klotho基因调控的FGF23/FGFR1信号通路对人肾小管上皮细胞羟化酶表达的影响及肾元颗粒的干预作用

目的:探讨Klotho/FGFR1/FGF23信号通路对人肾小管上皮细胞(HK-2)羟化酶表达的影响及肾元颗粒含药血清的干预作用。方法:以重组人FGF23加入HK-2细胞培养液建立细胞模型,分为正常组、模型组、FGFR1阻断剂组、ERK阻断剂组及肾元颗粒组。干预48h后,采用Western Blot及RT-PCR检测Klotho、FGFR1、Egr1、CYP24、CYP27B1蛋白及mRNA表达水平,Western Blot分析各组细胞ERK及磷酸化ERK(p-ERK)水平,免疫共沉淀检测法分析Klotho与FGFR1、FGF23与FGFR1抗体复合物。结果:与模型组比较,肾元颗粒组Klotho蛋白及mRNA的表达显著升高(P<0.05),FGFR1的表达差异无统计学意义,Egr1、CYP24蛋白及mRNA的表达显著升高(P<0.05),p-ERK水平显著升高(P<0.05),CYP27B1蛋白及mRNA的表达显著降低(P<0.05);免疫共沉淀显示肾元颗粒组Klotho与FGFR11免疫复合物、FGF23与FGFR1免疫复合物较模型组均显著升高(P<0.05)。结论:外源性FGF23颗粒能增强HK-2细胞表达Klotho/FGFR1/FGF23复合物,诱导Egr1及CYP24表达,抑制CYP27B1表达,肾元颗粒含药血清能显著增强FGF23诱导的这一信号通路的表达,推测肾元颗粒改善CKD钙磷代谢的机制与调节这一信号通路有关。

益肾养元颗粒中大黄素的含量测定

目的:建立益肾养元颗粒中大黄素的含量测定方法。方法:采用C18柱,以甲醇-0.2%磷酸(75∶25)为流动相,检测波长为291nm。结果:大黄素与其他组分峰的分离度>1.5,理论塔板数以大黄素峰计算为4100;大黄素线性范围是0.053～0.840μg,r=0.9996;平均回收率为100.17%,RSD为2.12%。结论:反相高效液相色谱法简便、快速、重现性好,适用于益肾养元颗粒的质量控制。

益肾养元颗粒的薄层鉴别方法研究

目的:建立益肾养元颗粒的薄层鉴别方法。方法:采用薄层色谱法对益肾养元颗粒中的何首乌、金缨子、补骨脂三味药材进行定性鉴别。结果:在薄层色谱中分别检出何首乌、金缨子和补骨脂的特征斑点,阴性对照无干扰。结论:TLC法检验益肾养元颗粒中何首乌、金缨子、补骨脂简便可行,专属性强,重现性好,可用于益肾养元颗粒的质量控制。

益肾养元颗粒中陈皮的鉴别和橙皮苷含量的测定

目的：建立益肾养元颗粒中陈皮的薄层色谱鉴别与橙皮苷含量的测定方法。方法：采用薄层色谱法对陈皮的定性鉴别,采用高效液相色谱法测定橙皮苷的含量;色谱柱为迪马C18柱（150×4.6,5μm）,流动相为乙腈-0.1%磷酸（20∶80）,流速1 m L/min,柱温45℃,检测波长283 nm。结果：薄层色谱鉴别斑点清晰,阴性对照无干扰;橙皮苷进样量为0.114~2.29μg,与峰面积呈良好线性关系（r=0.999 4）,平均回收率为99.67%,平均峰面积（RSD）为2.1%。结论：所建立的方法简便、准确、重复性好,可用于益肾养元颗粒中陈皮的鉴别和橙皮苷的含量测定。

对元肾颗粒长期毒性试验的研究

本研究观察了元肾颗粒连续灌胃3个月对大鼠的体重、血液学指标、尿常规、血清生物化学指标以及主要脏器指数和病理组织学的影响。结果表明:元肾颗粒大剂量(129.2g生药/kg)、中剂量(74.8g生药/kg)、小剂量(43.2g生药/kg),所用剂量分别相当于临床拟用剂量(126g生药/日)的71.8倍、41.6倍和24倍,连续灌胃3个月和停药3周后未发现明显的毒性反应。雄性大剂量组从第3周起、中剂量组从第11周起、雌性大剂量组从第13周起,给药大鼠体重与对照大鼠体重相比即有显著差异;恢复期内,给药组大鼠体重增长明显。

元肾颗粒对甘油致肾功能衰竭大鼠影响的药效学研究

元肾颗粒为主治慢性肾功能衰竭的中药制剂,根据其功能主治进行药效学研究,结果表明:元肾颗粒大、中、小剂量给药七次,与模型对照组相比,大剂量能显著降低甘油致肾衰大鼠的血清肌酐、尿素氮含量,同组给药后的血清肌酐、尿素氮含量也显著低于给药前;中剂量能显著降低甘油致肾衰大鼠的血清尿素氮含量,对血清肌酐含量无显著影响,同组给药前后的血清肌酐、尿素氮含量无显著差异;小剂量同组给药后的血清肌酐含量也显著低于给药前。

对元肾颗粒急性毒性试验的研究

元肾颗粒小鼠一次灌胃给药测不出LD_(50),故测其灌胃给药的最大给药量为66g/kg,相当于临床拟用量的118倍,观察12天未见体重下降,未见动物血液学、生化指标及行为表现、饮食、活动等有明显异常,未见死亡。