中药复方制剂消可宁对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响

目的:观察中药复方制剂消可宁对高糖培养的大鼠肾小球系膜细胞增殖的抑制作用。方法:实验于2004-04/11在南京医科大学第一附属医院内分泌代谢研究中心细胞培养研究室完成。①中药复方制剂消可宁(由制大黄、制附子、生黄芪组成,南京军区南京总医院制剂科生产,药品批号:院临(2003)第01017号,规格为90mL/袋)。大鼠系膜细胞株HBZY-1购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。②将购入的系膜细胞株消化培养,取培养4～8代的细胞,吸去培养瓶中的上清液,消化离心后混匀,锥虫蓝染色观察细胞活性。③不同刺激时间系膜细胞增殖实验设立3组,正常糖浓度组每孔加入5.6mmol/L葡萄糖溶液200μL,高糖对照组每孔加入30mmol/L葡萄糖溶液200μL,高糖+消可宁组每孔加入30mmol/L葡萄糖与0.06g/mL消可宁混合液200μL,6孔/组。各组分别于培养24,48,72h后向板孔中加5g/L的4-甲基偶氮四唑蓝20μL,于酶标仪492nm波长处检测吸光度值。④不同浓度消可宁刺激高糖环境下系膜细胞增殖实验设立7组,高糖对照组每孔加入30mmol/L葡萄糖溶液200μL,消可宁20,40,60,80,120,200g/L组每孔加入30mmol/L葡萄糖+对应浓度的消可宁混合液200μL,6孔/组。培养72h后各组向板孔中加5g/L的4-甲基偶氮四唑蓝20μL,同法检测吸光度值。结果:①系膜细胞活性观察:原代培养的4～8代系膜细胞,经锥虫蓝染色,着色的死亡细胞数<5%,未着色活细胞数>95%。②不同刺激时间各组系膜细胞增殖情况的比较:与正常糖浓度组比较,高糖对照组于高糖刺激24h即可促进系膜细胞的增殖,且这种作用在刺激48h时最为明显,至72h细胞数量开始减少,但仍明显高于正常糖浓度组(0.527±0.047,0.659±0.018,P<0.05)。与高糖对照组比较,高糖+消可宁组在24h内并未表现出抑制系膜细胞增殖的作用,而刺激48h后显示出抑制趋势,但差异无显著性意义,于72h后表现出较强的抑制系膜细胞增殖的效应(0.659±0.018,0.538±0.023,P<0.05)。③不同浓度消可宁刺激对高糖环境下系膜细胞增殖的影响:刺激72h后与高糖对照组比较,20,40g/L的消可宁能够部分阻止系膜细胞的增殖;60,80g/L的消可宁则表现出明显阻止高糖对系膜细胞的过度刺激作用,且随着浓度的增加,抑制作用逐渐增强;浓度升至120g/L时出现细胞脱落死亡,高达200g/L时则不见存活的细胞。结论:消可宁能够有效抑制高糖诱导的系膜细胞增殖,可能是其早期防治糖尿病肾病的细胞学基础。

苦参素对LPS诱导的人肾小球系膜细胞中p-STAT3和SOCS-3的影响

目的:观察苦参素对LPS诱导的人肾小球系膜细胞(HMC)中磷酸化信号转导和转录活化因子3(p-STAT3)和细胞因子信号抑制因子3(SOCS3)的表达及相互关系.方法:体外原代培养的HMC,分为正常组、LPS(10 mg/L)组、LPS(10mg/L)+苦参素(320 mg/L)组,每组分3个时间点(12,24,48h).采用MTT法检测HMC的增殖,RT-PCR方法检测STAT3和SOCS3 mRNA的表达,Western Blot方法检测p-STAT3和SOCS3蛋白的表达.结果:苦参素能明显抑制LPS诱导的HMC增殖,与正常组相比,p-STAT3和STAT3 mRNA的表达在12,24,48 h均上调,SOCS3蛋白和mRNA的表达也同步上调.与LPS诱导组相比,苦参素组p-STAT3和STAT3 mRNA的表达在12,24,48 h均下调,而SOCS3蛋白和mRNA表达有明显上调的趋势.结论:苦参素能抑制LPS诱导的HMC的增殖,且能上调LPS诱导的HMC中SOCS3 mRNA和蛋白表达,下调P-STAT3和STAT3 mRNA的表达,其作用可能与上调SOCS3、抑制STAT3磷酸化有关.

罗格列酮对高糖时人肾小球系膜细胞单核细胞趋化蛋白-1表达的影响

【目的】探讨高糖对人肾小球系膜细胞(HRMC)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响,以及过氧化物酶增殖体激动剂罗格列酮对其影响及作用机制。【方法】将HRMC分为三组处理:①正常对照组(糖浓度5.5 mmol/L);②高糖(30 mmol/L)组;③高糖加罗格列酮(5μmol/L,10μmol/L)组。用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测MCP-1 mRNA表达,用ElISA方法测定细胞上清MCP-1蛋白浓度。【结果】高糖刺激系膜细胞后MCP-1 mRNA表达明显升高,蛋白浓度增加,加入罗格列酮后MCP-1表达明显下降。且随罗格列酮浓度增大,作用更明显。【结论】高糖刺激HRMC,其MCP-1表达增强,可能是糖尿病肾病(DN)发病机制中的一个重要途径。罗格列酮能抑制MCP-1mRNA表达及蛋白合成,说明其具有抑制炎症的作用,在预防DN的发生发展中可能有重要意义。

肾小球系膜细胞结缔组织生长因子在高氨基酸环境下表达及氨基胍的抑制效应

目的:检测高氨基酸环境下肾小球系膜细胞结缔组织生长因子表达的变化,以及糖基化终末产物抑制剂氨基胍对其的干预调节。方法:实验于2005-04/10在同济医院肾病实验室完成。①大鼠肾小球系膜细胞由上海长征医院梅长林教授惠赠;复方氨基酸注射液(商品名:乐凡命,华瑞制药有限公司,批号041203701);L-精氨酸(上海生工生物工程技术服务有限公司,批号0421S04);氨基胍(Germany)。②参照本实验室以往系膜细胞培养的生长曲线,取对数生长期肾小球系膜细胞,接种时细胞密度按1×105常规培养6瓶,目测待铺满培养瓶底60%～80%时,随机数字表法分为3组:低糖组、高氨基酸+低糖组、氨基胍+高氨基酸+低糖组,2瓶/组。③各组在不同培养环境下继续培养。低糖组:5.5mmol/L的普通低糖DMEM培养液;高氨基酸+低糖组:在低糖组基础上加入85g/L的复方氨基酸注射液+2.48mmol/L的L-精氨酸;氨基胍+高氨基酸+低糖组:在高氨基酸+低糖组基础上加入0.5mmol/L的氨基胍。④各组细胞经培养液处理24h后,反转录聚合酶链反应检测结缔组织生长因子mRNA的表达;处理48h后,Western-blot检测结缔组织生长因子蛋白的表达。结缔组织生长因子基因和蛋白的表达检测均在相同的条件下重复3次。结果:①各组细胞经培养液处理24h后结缔组织生长因子mRNA的表达:高氨基酸+低糖组结缔组织生长因子mRNA的表达明显高于低糖组(1.895±0.142,0.564±0.238,P<0.05);氨基胍+高氨基酸+低糖组结缔组织生长因子mRNA水平下降至0.882±0.189,明显低于高氨基酸+低糖组(P<0.05),与低糖组基本相似(P>0.05)。②各组细胞经培养液处理48h后结缔组织生长因子蛋白的表达:高氨基酸+低糖组结缔组织生长因子蛋白的表达明显高于低糖组[(2.125±0.271)×105,(1.125±0.104)×105,P<0.05];当加入糖基化终末产物抑制剂氨基胍后,氨基胍+高氨基酸+低糖组结缔组织生长因子蛋白的表达下降为(1.391±0.193)×105,明显低于高氨基酸+低糖组(P<0.05),与低糖组基本相似(P>0.05)。结论:高氨基酸可使肾小球系膜细胞产生大量结缔组织生长因子,氨基胍可显著抑制其表达,提示高氨基酸诱导的结缔组织生长因子表达增多可能与晚期糖基化终末产物形成有关。

消旋羟蛋氨酸钙对人肾系膜细胞增殖影响及其机制研究

【目的】体外观察消旋羟蛋氨酸钙对人肾系膜细胞(HMC)的影响。【方法】10 mM消旋羟蛋氨酸钙对HMC体外干预,检测干预后转化生长因子-β1(TGF-β1)和乳酸脱氢酶(LDH)的变化,并采用MTT和流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。【结果】10 mM消旋羟蛋氨酸钙干预HMC,实验组与对照组相比,TGF-β1含量增加;细胞LDH表达水平没有改变;同时细胞出现增殖抑制。细胞流式分析发现,实验组干预后出现了细胞周期G1期阻滞并观测到了细胞凋亡。【结论】10 mM的消旋羟蛋氨酸钙可以诱导TGF-β1的表达增加;同时诱导细胞周期G1阻滞并伴随细胞凋亡。

核因子-κB对阿霉素肾病大鼠肾小球细胞凋亡的影响

目的探讨核转录因子κB（NF-κB）对阿霉素肾病大鼠肾小球细胞凋亡的影响。方法SD雄性大鼠分成两大组，A组（假手术组）6只，B组（硬化组）6只。采用右肾切除加尾静脉注射阿霉素制成肾小球硬化动物模型。分别在8周、9周两个不同时上间点，应用免疫组化检测肾组织Caspase-3、NF—κBp65的表达，TUNEL检测肾小球细胞凋亡指数。结果在不同的时间点，B组NF-κB阳性表达指数比A组明显增高（P〈0.05）；肾小球系膜细胞（MC）凋亡指数、Caspase-3的表达与NF-κB呈正相关关系。结论NF-κB参与肾小球系膜细胞凋亡的调控，促进肾小球硬化的进程。

IgA1对人肾小球系膜细胞TGF-β_1、Smad7和纤连蛋白表达的影响

目的:研究IgA1对人肾小球系膜细胞(HMCL)转化生长因子β1(TGF-β1)、Smad7和纤连蛋白(FN)表达的影响。方法:分别以正常人IgA1(NIgA1)、正常人聚合IgA1(aNIgA1)、IgA肾病(IgAN)患者IgA1(PIgA1)和IgAN患者聚合IgA1(aPIgA1)剌激体外培养的HMCL;RT-PCR法检测HMCL TGF-β1、Smad7和FN mRNA的表达,Western印迹法检测HMCL Smad7蛋白水平,ELISA法检测HMCL TGF-β1和FN蛋白水平。结果:PIgA1和aPIgA1能显著上调TGF-β1、Smad7F、N mRNA和蛋白的表达,且aPIgA1刺激组明显强于PIgA1刺激组(P<0.01或P<0.05)。在对照组、NIgA1刺激组和aNIgA1刺激组间,TGF-β1、Smad7、FN表达水平的差异无统计学意义(P>0.05)。在aPIgA1刺激HMCL不同时间组,TGF-β1、Smad7和FN表达水平逐渐升高,mRNA分别在12 h、12 h和24 h达高峰,蛋白水平分别在12 h2、4 h和24 h达高峰。结论:PIgA1和aPIgA1能上调HMCLTGF-β1、Smad7和FN的表达,aPIgA1的作用强于PIgA1,且呈一定的时间依赖性,提示IgAN患者血清IgA1,而且主要是aIgA1可通过影响TGF-β1、Smad7和FN而在IgAN进展中发挥作用。

高糖对系膜细胞产生纤维联接蛋白、Ⅳ型胶原及PAF的影响

目的探讨高浓度葡萄糖条件下，系膜细胞产生纤维联接蛋白、IV型胶原、血小板活化因子（PAF）的变化。方法人系膜细胞单独培养，分为对照组、甘露醇组、高糖组、BN52021组，ELISA法检测各组细胞上清液中纤维联接蛋白（Fn）、Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）、PAF含量，实时荧光定量检测系膜细胞血小板活化因子受体（PAF-RmRNA）表达。结果高糖刺激下，系膜细胞培养上清液Fn和colⅣ含量升高（P均〈0．05），BN52021可抑制高糖刺激的Fn和colⅣ含量升高（P〈0．05）。高糖可引起系膜细胞培养上清液PAF含量升高（P均〈0．05）。高糖可上调系膜细胞PAF-R mRNA表达（P均〈0．05）。结论（1）高糖刺激系膜细胞Fn、ColⅣ、PAF产生，高糖刺激的Fn、Col Ⅳ分泌增加部分与PAF有关。（2）高糖可促进系膜细胞PAF-R基因表达，放大PAF的生物效应。