METTL3调控miR-126-5p对人肾小球系膜细胞焦亡的影响及机制研究

目的:研究甲基转移酶样蛋白3(METTL3)调控miR-126-5p对人肾小球系膜细胞(HRMC)焦亡的影响并探讨潜在机制。方法:将HRMC分为7组,即对照组、高糖处理组、pcD-null组、pcD-METTL3组、pcD-METTL3+miR-126-5p抑制剂(inhibitor)组、pcD-METTL3+inhibitor-NC组、pcD-METTL3+inhibitor+AKT抑制剂(AZD5363)组。用流式细胞仪检测细胞焦亡,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-126-5p表达,western blotting检测METTL3、Gasdermin D、NLRP3、磷酸化(p-)AKT、p-NF-κB表达。用RNA甲基化免疫沉淀技术(Me-RIP)测定miR-126-5p前体的m6A修饰水平。结果:与对照组比较较,高糖处理组细胞焦亡增多,miR-126-5p前体N6-甲基腺苷(m6A)修饰增加,p-AKT和p-NF-κB表达水平升高,METTL3和miR-126-5p表达水平降低(均P<0.05)。转染METTL3过表达载体后,高糖处理的细胞上述指标发生了显著逆转(均P<0.05)。而在过表达METTL3的基础上加入miR-126-5p inhibitor后,miR-126-5p表达下调,细胞焦亡增多,p-AKT、p-NF-κB表达上调(均P<0.05),但METTL3表达水平和miR-126-5p前体m6A修饰无显著变化(P>0.05)。在过表达METTL3的基础上加入AZD5363后,细胞焦亡减少(P<0.05),p-AKT、p-NF-κB表达下调,METTL3和miR-126-5p表达及miR-126-5p前体m6A修饰无显著改变(P>0.05)。结论:METTL3促进miR-126-5p的m6A甲基化,并通过抑制AKT/NF-κB信号通路减少高糖诱导的肾小球系膜细胞焦亡。

转运RNA衍生片段15:31对TGF-β_(1)诱导的小鼠肾小球系膜细胞增殖和炎症反应的影响

目的 观察转运RNA衍生片段15:31-Arg-CCT-3-1(tRF-15:31)对转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))诱导的小鼠肾小球系膜细胞增殖和炎症反应的影响。方法 体外培养小鼠肾小球系膜细胞,将细胞分为tRF组、NC组、模型组和对照组。对照组使用正常糖培养基培养细胞。tRF组、NC组、模型组以含10 ng/mL TGF-β_(1)的培养基培养24 h诱导CKD细胞模型;tRF组、NC组分别转染tRF-15:31 mimic和阴性对照。各组干预24 h后,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力,采用Western blotting法检测各组细胞中的纤维化指标[纤维连接蛋白(FN)、Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)]和炎症指标[白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)]蛋白,采用逆转录定量PCR法检测FN、ColⅠ、α-SMA、IL-6、TNF-α mRNA,采用ELISA法检测各组细胞培养液上清中的IL-6、TNF-α。结果模型组增殖活力高于对照组,模型组FN、ColⅠ、α-SMA、IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表达和培养液上清中IL-6、TNF-α水平高于对照组(P均<0.05);tRF组增殖活力低于NC组,tRF组FN、ColⅠ、α-SMA、IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表达和培养液上清中IL-6、TNF-α水平低于NC组(P均<0.05)。结论 tRF-15:31可抑制TGF-β_(1)诱导的小鼠肾小球系膜细胞增殖,并减少炎症因子分泌。

Sublytic C5b-9上调KLF5促进Thy-1肾炎大鼠肾小球系膜细胞生成IL-23的作用

目的:研究亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)上调转录因子Krüppel样因子5(Krüppel-like factor 5,KLF5)促进Thy-1肾炎(Thy-1 nephritis,Thy-1N)大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)产生炎症因子白细胞介素(interleukin,IL)-23的作用。方法:(1)建立大鼠Thy-1N模型和体外培养大鼠GMC,用Western blot(WB)检查Thy-1N大鼠肾组织和受sublytic C5b-9刺激的GMC中KLF5和IL-23的表达。(2)分别将KLF5过表达质粒(pIRES2-KLF5)或KLF5小干扰质粒(shKLF5)转染GMC,通过实时荧光定量PCR和WB检测KLF5和IL-23的mRNA和蛋白水平。(3)将IL-23全长启动子荧光素酶报告基因质粒(p GL3-IL-23-FL)转染GMC,再给予sublytic C5b-9刺激,或将p GL3-IL-23-FL与pIRES2-KLF5或shKLF5共转染GMC,用荧光素酶报告基因实验检测IL-23启动子活性的变化。(4)将慢病毒(lentivirus,LV)包装的LV-shKLF5和LV-shCTR行肾动脉灌注术导入大鼠肾组织,经小动物脏器可见光三维成像和冰冻切片观察GFP表达,证实LV-shCTR在肾组织中富集效率。之后再复制大鼠Thy-1N,用WB检查肾组织中KLF5和IL-23的蛋白表达。结果:(1)Thy-1N大鼠的肾组织和sublytic C5b-9刺激的GMC中,KLF5和IL-23的表达均显著升高,且KLF5的表达高峰稍早于IL-23。(2)在GMC中过表达或敲低KLF5能分别引起IL-23表达的升高或降低。(3)Sublytic C5b-9刺激或KLF5过表达均可增加GMC中IL-23启动子的活性,但敲低KLF5后可明显下调由sublytic C5b-9刺激GMC诱导的IL-23启动子活性。(4)敲低Thy-1N大鼠肾组织中KLF5的表达后,其肾组织中IL-23的表达水平明显降低。结论:大鼠Thy-1N发病早期,sublytic C5b-9刺激GMC后可通过上调KLF5促进IL-23基因的转录与表达。

川陈皮素调节AMPK/NLRP3信号通路对脂多糖诱导的肾小球系膜细胞炎性损伤的影响

目的探讨川陈皮素(Nobiletin)调节AMP激活的蛋白激酶(AMPK)/NOD样受体蛋白3(NLRP3)信号通路对脂多糖(LPS)诱导的肾小球系膜细胞HBZY-1炎性损伤的影响。方法将HBZY-1细胞分为5组:正常组、LPS组(100 ng·m L^(-1)LPS)、川陈皮素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素)、AMPK/NLRP3信号通路抑制剂雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)、川陈皮素+雷帕霉素组(100 ng·m L^(-1)LPS+40μmol·L^(-1)川陈皮素+0.5μmol·L^(-1)雷帕霉素)。MTT法检测HBZY-1细胞毒性和增殖;ELISA法检测HBZY-1细胞白细胞介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)含量;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot法检测AMPK/NLRP3信号通路蛋白水平。结果与正常组比较,LPS组CAT、SOD、GSH水平、细胞OD值以及AMPK蛋白水平明显降低(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显升高(P<0.05)。与LPS组比较,川陈皮素组CAT、SOD、GSH水平、OD值以及AMPK蛋白水平明显升高(P<0.05),细胞凋亡率、IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及NLRP3蛋白水平明显下降(P<0.05);而雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。与川陈皮素组比较,川陈皮素+雷帕霉素组以上指标均呈现与川陈皮素组相反的趋势(P<0.05)。结论川陈皮素可能通过上调AMPK/NLRP3信号通路减轻LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤。下调AMPK/NLRP3信号通路可消除川陈皮素对LPS诱导的肾小球系膜细胞细胞炎性损伤的改善作用。

丙泊酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激和炎症反应的影响

目的探讨丙泊酚对高糖诱导的人肾小球系膜细胞损伤的影响。方法该研究于2021年3月至2022年3月进行。体外培养人肾小球系膜细胞,采用30 mol/L葡萄糖诱导建立人肾小球系膜细胞细胞损伤模型,用丙泊酚浓度10、20、40μmol/L处理细胞,细胞分为对照组、高糖组、高糖+低、中、高剂量丙泊酚组。酶联免疫吸附测定(ELISA)检测超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛、活性氧、白细胞介素(IL)-10、肿瘤坏死因子α(TNF-α)IL-1β表达;蛋白质印迹法检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达。结果高糖组的丙二醛[(16.7±1.7)mmol/L比(3.8±0.4)mmol/L]、活性氧[(9.6±0.9)μg/L比(3.5±0.3)μg/L]、IL-10[(65.3±6.9)ng/L比(26.9±3.2)ng/L]、TNF-α[(105.6±10.9)ng/L比(42.8±4.8)ng/L]和IL-1β[(79.7±8.2)ng/L比(31.2±3.6)ng/L]明显高于对照组;iNOS、ICAM-1、MCP-1、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显高于对照组;SOD、GSH-Px明显低于对照组,均P<0.05。高糖+低剂量丙泊酚组、高糖+中剂量丙泊酚组、高糖+高剂量丙泊酚组的丙二醛、活性氧、IL-10、TNF-α和IL-1β明显低于高糖组;iNOS、ICAM-1、MCP-1、IL-10、TNF-α、IL-1β蛋白表达明显低于高糖组,均P<0.05;SOD、GSH-Px明显高于高糖组,均P<0.05。结论丙泊酚能减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞氧化应激和炎症反应,发挥保护肾脏的作用。

甘草素调节Hippo/YAP/TAZ信号通路对高糖诱导的肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响

目的探讨甘草素(LQ)调节Hippo/Yes相关蛋白(YAP)/含有PDZ结合位点转录共激活因子(TAZ)通路对高糖(HG)诱导的肾小球系膜细胞炎症反应及纤维化的影响。方法将HBZY-1细胞分为对照组(Ct组)、高糖组(HG组)、低剂量LQ组(LQ-L组,20μmmol/L)、高剂量LQ组(LQ-H组,40μmmol/L)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-YAP/TAZ组(转染pcDNA3.1-YAP/TAZ)、LQ-H+pcDNA3.1组(40μmmol/L+转染pcDNA3.1)、LQ-H+pcDNA3.1-YAP/TAZ组(40μmmol/L+转染pcDNA3.1-YAP/TAZ)。qRT-PCR、Western blot检测转染效果。CCK-8法检测细胞增殖;ELISA检测细胞上清中TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-1β水平;免疫荧光检测IV型胶原纤维(Collagen IV)、纤连蛋白(FN)蛋白表达;Western blot检测结缔组织生长因子(CTGF)、TGF-β1、YAP1、TAZ蛋白表达。结果HBZY-1细胞成功高表达YAP1/TAZ;与Ct组比较,HG组HBZY-1细胞OD450值、TNF-α、MCP-1、IL-1β、Collagen IV、FN蛋白相对荧光强度、CTGF、TGF-β1、YAP1、TAZ蛋白表达升高(P<0.05);与HG组比较,LQ-L组、LQ-H组HBZY-1细胞OD450值、TNF-α、MCP-1、IL-1β、Collagen IV、FN蛋白相对荧光强度、CTGF、TGF-β1、YAP1、TAZ蛋白表达降低(P<0.05);与HG组、pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-YAP/TAZ组HBZY-1细胞OD450值、TNF-α、MCP-1、IL-1β、Collagen IV、FN蛋白相对荧光强度、CTGF、TGF-β1、YAP1、TAZ蛋白表达升高(P<0.05);pcDNA3.1-YAP/TAZ减弱了高剂量LQ对HG诱导的HBZY-1细胞炎症反应及纤维化的抑制作用。结论LQ可能通过抑制Hippo/YAP/TAZ通路抑制HG诱导的HBZY-1细胞炎症反应及纤维化。

甘草酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞炎性因子及纤维化因子的影响

目的探讨甘草酸(GA)对高糖诱导的肾小球系膜细胞(SV40 MES13)炎性因子及纤维化因子的影响。方法将培养的小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)分为对照(NG)组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖(HG)组(30 mmol/L葡萄糖)及HG+GA组(30 mmol/L葡萄糖+200μmol/L GA)。采用Western blotting检测各组细胞炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-8及纤维化因子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达水平,免疫荧光检测各组IL-1β、TNF-α、α-SMA在细胞内的荧光表达强度,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组细胞培养上清中IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-8的表达水平。结果Western blotting检测结果显示,与NG组比较,HG组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8及α-SMA蛋白的表达水平明显升高(P<0.01);与HG组比较,HG+GA组IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和α-SMA蛋白表达量降低(P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示,与NG组比较,HG组细胞内IL-1β、TNF-α和α-SMA因子的荧光强度明显增强(P<0.05);与HG组相比,HG+GA组细胞内IL-1β、TNF-α和α-SMA因子荧光强度明显降低(P<0.05)。ELISA检测结果显示,与NG组比较,HG组细胞培养上清中IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8蛋白表达水平升高(P<0.01);与HG组比较,HG+GA组IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-8表达水平明显降低(P<0.05)。结论甘草酸对高糖诱导的肾小球系膜细胞的炎性因子及纤维化因子的表达均具有不同程度的抑制作用,可能在糖尿病肾病的预防方面发挥重要作用。

LncRNA-NEAT1调控miR-182-5p表达对狼疮性肾炎肾系膜细胞损伤的影响

目的探讨长链非编码RNA(LncRNA)核旁丛组装转录本1(NEAT1)在狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)中通过微小RNA(miR)-182-5p/叉头盒蛋白O1(FoxO1)/β-连环蛋白(β-catenin)轴对肾系膜细胞损伤的影响。方法收集2019年3月至2021年7月凉山州第二人民医院收治的32例LN患者(LN组)外周血和32例体检健康者(健康对照组)外周血,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测外周血单个核细胞中NEAT1以及miR-182-5p、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平,酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清炎症因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-1β含量。采用20%LN患者血清处理肾系膜细胞的方法构建LN肾系膜细胞模型,造模完成后将细胞分为对照组(正常培养,不转染)、模型组(加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NC组(转染si-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1组(转染si-NEAT1后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-NC组(共转染si-NEAT1和anti-miR-NC后加入5μg/mL脂多糖培养)、si-NEAT1+anti-miR-182-5p组(共转染si-NEAT1和anti-miR-182-5p后加入5μg/mL脂多糖培养)。qRT-PCR法检测各组细胞NEAT1、miR-182-5p表达水平;ELISA法测定各组细胞炎症因子水平;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒检测各组细胞LDH含量;细胞计数试剂盒8(CCK-8)实验检测各组细胞增殖活力;流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况;免疫印迹法检测各组细胞FoxO1、β-catenin蛋白表达水平。结果与健康对照组比较,LN组患者外周血单个核细胞中NEAT1、FoxO1、β-catenin mRNA表达水平以及血清中炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著上升,miR-182-5p表达水平显著下降(P<0.05)。与对照组比较,模型组肾系膜细胞增殖活力、FoxO1和β-catenin蛋白水平以及LDH、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均明显增加,miR-182-5p表达水平明显降低(P<0.05)。敲低NEAT1后,细胞增殖活力和炎症反应减弱,FoxO1和β-catenin蛋白表达明显下调(P<0.05);抑制miR-182-5p表达可减轻NEAT1敲低对LN肾系膜细胞模型细胞增殖、炎症因子及FoxO1、β-catenin蛋白表达的影响(P<0.05)。各组细胞间凋亡率无显著变化(P>0.05)。结论敲低NEAT1可通过靶向负调控miR-182-5p表达,抑制LN肾系膜细胞过度增殖,降低炎症反应,其可能与抑制FoxO1/β-catenin通路有关。

抑制长链非编码RNA-C920021L13Rik靶向miR-2861减轻糖尿病肾脏疾病系膜细胞损伤

目的探讨长链非编码RNA C920021L13Rik(简称L13Rik)对高糖(high glucose,HG)培养的肾小球系膜细胞(mesangial cell,MC)损伤的影响及分子机制。方法荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测L13Rik和miR-2861在HG培养的肾小球MC中的表达水平;设计合成L13Rik siRNA(siL13Rik)转染细胞,流式细胞术检测细胞周期,[35S]-甲硫氨酸标记实验评估细胞蛋白质合成,蛋白免疫印迹检测MC合成细胞外基质能力;双荧光素酶报告实验、RNA pull-down及RNA免疫沉淀实验评估L13Rik和miR-2861的靶向关系。结果HG诱导的MC中L13Rik水平显著增加(P<0.001),而miR-2861水平降低(P<0.001)。L13Rik消耗和miR-2861过表达都有效地降低了HG诱导的MC损伤和细胞外基质集聚(P<0.001)。L13Rik靶向并负调控miR-2861表达。结论抑制L13Rik通过靶向miR-2861可减轻HG诱导的MC损伤。

外源性硫化氢对肾小球系膜细胞缺氧/复氧损伤的影响及其机制

目的探讨外源性硫化氢(hydrogen sulfide,H_(2)S)对肾小球系膜细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)损伤的影响,并阐明其相关作用机制。方法H/R诱导小鼠肾小球系膜细胞系(SV40MES13)建立细胞损伤模型。细胞增殖试剂盒(CCK8)检测细胞活力,荧光探针技术分别检测H_(2)S和活性氧(ROS)含量,生化试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量,Hoechst 33342染色检测细胞凋亡率;Western blot检测胱硫醚-γ-裂解酶(cystathione-gamma-lyase,CSE)、细胞凋亡相关蛋白(cleaved-caspase-3、Cyt c和Bcl-2)表达及信号通路相关蛋白(ERK1/2、Phospho-ERK1/2)活性。结果与对照(Control)组相比,缺氧/复氧(H/R)组细胞活力、内源性H_(2)S含量CSE蛋白表达、SOD活性及Bcl-2蛋白表达均明显降低;细胞凋亡率、MDA和ROS含量、Cyt c及cleaved caspase-3蛋白表达均显著升高;同时,磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)活性明显降低。与H/R比较,H/R+NaHS(外源性H_(2)S供体)逆转了H/R对上述指标的影响。另外,PD98059(ERK1/2抑制剂)减弱了NaHS对磷酸化ERK1/2的作用。结论肾小球系膜细胞H/R损伤与内源性CSE/H_(2)S系统下调有关;外源性H_(2)S通过上调ERK1/2通路抑制氧化应激和细胞凋亡,减轻肾小球系膜细胞H/R损伤。

地参多糖的制备及其对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的影响

目的:探讨地参多糖不同醇沉组分的制备工艺,考察其对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)的影响。方法:地参水提液经脱蛋白、大孔树脂柱层析分离,得地参粗多糖,对地参粗多糖进行分级醇沉获得待测组分,以高糖诱导HBZY-1为模型细胞进行体外活性测试。结果:得到的3个不同醇沉组分(LLP-30%、LLP-60%、LLP-90%)在0.25~4.00 mg/mL浓度下,对正常HBZY-1细胞均无毒性;LLP-60%、LLP-90%对高糖诱导HBZY-1细胞的增殖具有显著抑制作用(P<0.01),且能促进细胞超氧化物歧化酶含量上升,丙二醛和活性氧含量降低。结论:地参多糖组分的提取和分离制备工艺切实可行,其中活性组分LLP-90%不仅含量最高,而且抑制高糖诱导HBZY-1细胞的增殖及缓解细胞氧化应激效果最为显著,为地参作为糖尿病肾病功能性食品开发提供基础。

草石蚕多糖的制备及其对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的影响

为研究草石蚕多糖对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)的影响。草石蚕水提液经脱蛋白、AB-8大孔树脂柱层析分离,得草石蚕粗多糖并进行分级醇沉分离得到30%醇沉组分(SSMP-30%)、60%醇沉组分(SSMP-60%)和90%醇沉组分(SSMP-90%),其中SSMP-90%的含量最高。以高糖诱导HBZY-1为细胞模型对醇沉组分进行体外活性测试。结果表明,不同醇沉组分对模型细胞均无毒性,与高糖对照组比较,SSMP-30%和SSMP-90%组分对高糖诱导HBZY-1的增殖具有显著抑制作用(P<0.01),且呈浓度依赖性,其中SSMP-90%的活性最强。提示其对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞具有保护作用。

circ_WBSCR17通过调节miR-30a-5p/JAK1轴减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和炎症反应

目的探讨circ_WBSCR17通过调节miR-30a-5p/JAK1轴对高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和炎症的影响。方法将人肾小球系膜细胞HMCL分为NG组(5.5 mmol/L葡萄糖处理HMCL细胞)、HG组(30 mmol/L葡萄糖处理细胞)、si-NC组(30 mmol/L葡萄糖+转染si-NC)、si-circ_WBSCR17组(30 mmol/L葡萄糖+转染si-circ_WBSCR17)、si-circ_WBSCR17+inhibitor-NC组(30 mmol/L葡萄糖+si-circ_WBSCR17和inhibitor-NC共转染)、si-circ_WBSCR17+miR-30a-5p inhibitor组(30 mmol/L葡萄糖+si-circ_WBSCR17和miR-30a-5p inhibitor共转染);RT-qPCR检测细胞中circ_WBSCR17、miR-30a-5p的表达;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡;ELISA法检测肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6和IL-8表达水平;Western blot检测细胞中JAK1、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bax、转化生长因子-β1(TGF-β1)、纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原蛋白(collagenⅣ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;荧光原位杂交(FISH)实验检测circ_WBSCR17的分布情况,双荧光素酶报告基因实验分别验证circ_WBSCR17和miR-30a-5p、JAK1的关系。结果与NG组比较,HG组HMCL细胞增殖能力降低,TNF-α、IL-6和IL-8水平、p-JAK1/JAK1、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3、Bax、TGF-β1、FN、collagenIV、α-SMA蛋白表达升高(P<0.05);与HG组和si-NC组比较,si-circ_WBSCR17组HMCL细胞中miR-30a-5p表达、OD450值、PCNA表达升高,TNF-α、IL-6和IL-8水平、circ_WBSCR17、p-JAK1/JAK1、p-STAT1/STAT1、p-STAT3/STAT3、Bax、TGF-β1、FN、collagenIV、α-SMA表达降低(P<0.05);抑制miR-30a-5p减弱了敲低circ_WBSCR17对HMCL细胞增殖的促进作用,增强了细胞凋亡、细胞纤维化和炎症反应;FISH实验证实circ_WBSCR17主要分布在细胞质中;双荧光素酶报告基因实验证实circ_WBSCR17、JAK1与miR-30a-5p存在靶向调控关系。结论敲低circ_WBSCR17可通过调节miR-30a-5p/JAK1轴,进而减轻高糖诱导的人肾小球系膜细胞纤维化和炎症。

三七总皂苷调控miR-1231保护高糖下肾小球系膜细胞的研究

目的探讨三七总皂苷(PNS)调控miR-1231对高糖诱导的肾小球系膜细胞(HMCs)增殖及炎症反应的影响。方法将人肾小球系膜细胞(HMCs)分为空白对照组(CON),高糖组(HG)和三七总皂苷组(PNS)。采用CCK-8法检测PNS对高糖下HMCs增殖的抑制作用。采用Real-time PCR法检测miR-1231在各组的相对表达量,生物信息学分析法筛选与miR-1231相关的信号通路及其参与的生物学功能。采用ELISA法和Western blot法检测炎症因子的分泌情况。结果CCK-8结果表明,与高糖组相比PNS在浓度为6.25~200μg/mL状态下,对细胞过度增殖的抑制作用呈现明显的浓度依赖性(P<0.05),且50μg/mL的PNS已能够显著改善高糖诱导下HMCs的异常增殖(P<0.01)。PCR的结果显示,与对照组相比,高糖组miR-1231表达显著下降;与高糖组相比,PNS干预后显著升高(P<0.01)。对miR-1231进行生物信息学分析,预测到miR-1231的靶基因有IGF1、TMED1、GSTT2等;用GeneOntology和KEGG数据库对miR-1231进行通路富集和生物学功能分析,确定miR-1231与MAPK信号通路紧密相关,miR-1231的靶基因参与调控肾小球系膜细胞内蛋白质转运等生物功能。ELISA的结果表明,与对照组比较,高糖组上清液中TNF-α、IL-6表达增多(P<0.01);与高糖组比较,PNS组上述两种炎症因子表达下降(P<0.01)。Western blot的结果表明,高糖组细胞中TNF-α、IL-6蛋白表达水平较对照组显著升高(P<0.01);PNS组较高糖组相比TNF-α、IL-6蛋白表达量显著降低(P<0.01)。结论PNS可通过上调miR-1231的表达,缓解炎症,发挥对HMCs的保护作用。

LncRNA-Gm4419对小鼠肾小球系膜细胞炎症、纤维化和增殖的影响

目的:探讨在高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞(MGMC)中lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p结合对炎症、纤维化和增殖的影响。方法:qRT-PCR测定低糖组(5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)和高糖组(25 mmol/L葡萄糖)MGMC中miR-7214-3p的表达水平;生物信息学预测lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p的结合位点;荧光素酶报告基因方法检测MGMC中lncRNA-Gm4419与miR-7214-3p的结合能力;qRT-PCR检测单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、纤维蛋白(Fn)和胶原蛋白Ⅳ(Col.Ⅳ)的表达水平,流式细胞术和细胞计数试剂盒(CCK8)方法测定细胞增殖能力。结果:在高糖培养下,MGMC中miR-7214-3p的表达水平显著降低(P<0.05)。在低糖组中,沉默miR-7214-3p后MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平升高,系膜细胞增殖能力增强(P<0.05);在高糖组中,过表达miR-7214-3p后MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平降低,系膜细胞增殖能力减弱(P<0.05)。MGMC过表达lncRNA-Gm4419后MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平升高,系膜细胞增殖能力增强(P<0.05);同时过表达lncRNA-Gm4419和miR-7214-3p组较单独过表达lncRNA-Gm4419组,MCP-1、TNF-α、IL-1β、Fn和Col.Ⅳ表达水平降低,系膜细胞增殖能力减弱(P<0.05)。结论:在高糖条件下,lncRNA-Gm4419通过抑制miR-7214-3p的表达来促进系膜细胞的炎症反应、纤维化形成和增殖。

基于NLRP3/Caspase-1信号通路探讨益肾降糖饮对人肾小球系膜细胞焦亡相关蛋白表达的影响

目的基于NLRP3/Caspase-1信号通路探讨益肾降糖饮含药血清对高糖高胰岛素培养下人肾小球系膜细胞焦亡相关蛋白表达的影响。方法取对数生长期的人肾小球系膜细胞分为空白组、模型组和益肾降糖饮含药血清低、中、高剂量组。空白组采用10%的大鼠空白血清DMEM培养液;模型组和低、中、高剂量组在4.5 mg/mL葡萄糖和10μg/mL胰岛素诱导后,分别加浓度为10%的大鼠空白血清和浓度为0.39、0.78、1.56 g/mL的益肾降糖饮含药血清干预,培养48 h。qPCR检测5组细胞NOD样受体热蛋白结构域3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)mRNA相对表达水平,Western blot检测5组细胞NLRP3、Caspase-1的蛋白表达量。结果与空白组比较,模型组Caspase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平均升高(P<0.05);与模型组比较,低剂量组Cas⁃pase-1、NLRP3的mRNA相对表达水平及NLRP3蛋白表达量均下降(P<0.05),Caspase-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05);中剂量组Caspase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平及蛋白表达量均下降(P<0.05);高剂量组Cas⁃pase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平及蛋白表达量均下降(P<0.05)。与低剂量组比较,中、高剂量组Caspase-1、NLRP3 mRNA相对表达水平及蛋白表达量均下降(P<0.05)。结论益肾降糖饮含药血清可通过调控NL⁃RP3/Caspase-1信号通路上NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达水平和蛋白表达量,从而抑制高糖及高胰岛素刺激引起的肾小球系膜细胞焦亡。中、高剂量组对NLRP3、Caspase-1 mRNA相对表达水平和蛋白表达量的调控优于低剂量组。

西红花酸调控Nrf2/HO-1通路抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞铁死亡

目的 探讨西红花酸抑制高糖诱导人肾小球系膜细胞(HGMCs)铁死亡的作用机制。方法 (1)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、阴性对照组(60 mmol·L^(-1)甘露醇)和葡萄糖实验组(30、60、90 mmol·L^(-1)),干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率,采用RT-qPCR法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)mRNA表达,以确定高糖诱导HGMCs的造模条件。(2)体外培养HGMCs,分为空白对照组和西红花酸给药组(5、25、125μmol·L^(-1)),干预培养24 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率。(3)体外培养HGMCs,将细胞分为空白对照组、模型组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖)、西红花酸组(60 mmol·L^(-1)葡萄糖+5、25、125μmol·L^(-1)西红花酸)及阳性对照组[60 mmol·L^(-1)葡萄糖+1μmol·L^(-1)铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1,Fer-1)]。干预培养48 h后,采用CCK-8法检测细胞存活率;流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平;Western Blot法检测细胞GPX4、血红素加氧酶-1(HO-1)、转铁蛋白受体(TFRC)蛋白表达;采用免疫荧光法与Western Blot法检测HGMCs细胞核中核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白表达。结果 (1)与空白对照组比较,阴性对照组的细胞存活率及GPX4mRNA表达水平无明显差异(P>0.05);30、60、90 mmol·L^(-1)葡萄糖实验组的细胞存活率及GPX4 mRNA表达水平均显著降低(P<0.01),且以60 mmol·L^(-1)浓度组作用最为明显。(2)与空白对照组比较,5μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率无明显影响(P>0.05),25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率显著升高(P<0.01),该浓度西红花酸对HGMCs无明显细胞毒性。(3)与空白对照组比较,模型组的HGMCs细胞存活率显著降低(P<0.01);细胞内ROS水平显著上升(P<0.01);GPX4蛋白表达水平明显下降(P<0.05);细胞核内Nrf2蛋白表达显著下调(P<0.001)。与模型组比较,25、125μmol·L^(-1)西红花酸组的HGMCs细胞存活率明显升高(P<0.05);细胞内ROS水平均显著下降(P<0.01),并呈浓度依赖性;西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞GPX4、HO-1蛋白表达水平明显上调(P<0.05,P<0.01),与阳性对照药物Fer-1效果相近(P>0.05);西红花酸125μmol·L^(-1)组HGMCs细胞核内Nrf2蛋白表达显著上调(P<0.001)。各组间的HGMCs细胞TFRC蛋白表达无明显差异(P>0.05)。结论 西红花酸能够抑制高糖诱导HGMCs细胞铁死亡,减少细胞内ROS生成,上调GPX4蛋白表达,可能与上调Nrf2/HO-1通路密切相关。

鼠尾草酸调节PINK1/Parkin信号通路对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞的影响

目的探究鼠尾草酸调节磷酸酶基因(PTEN)诱导假定激酶(PINK)1/E3泛素连接酶(Parkin)信号通路对高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)的影响。方法将HBZY-1细胞分为对照组(含糖量5.8 mmol/L),高糖组(含糖量26 mmol/L),低剂量鼠尾草酸组(含50 mg/kg鼠尾草酸),高剂量鼠尾草酸组(含100 mg/kg鼠尾草酸)。采用透射电镜、流式细胞仪观察高糖诱导大鼠肾小球系膜细胞自噬、凋亡变化状况,Western印迹检测PINK1/Parkin信号通路蛋白的表达量。结果与对照组相比,高糖组、低剂量鼠尾草酸组、高剂量鼠尾草酸组HBZY-1细胞自噬率、PINK1、Parkin、超氧化物歧化酶(SOD)表达显著降低,细胞凋亡率、白细胞介素(IL)-1β、丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子(TNF)-α水平显著升高(P<0.05);与高糖组对比,低剂量鼠尾草酸组、高剂量鼠尾草酸组HBZY-1细胞自噬率、PINK1、Parkin、SOD水平显著升高,细胞凋亡率、MDA、TNF-α、IL-1β表达显著下降(P<0.05);与低剂量鼠尾草酸组相比,高剂量鼠尾草酸组的HBZY-1细胞自噬率、PINK1、Parkin、SOD表达上升,细胞凋亡率、TNF-α、MDA、IL-1β表达降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论鼠尾草酸可加强高糖诱导的肾小球系膜细胞自噬率,抑制HBZY-1的凋亡,可能与其调节PINK1/Parkin信号通路有一定的关联性。

甘草酸通过下调缺氧诱导因子-1α抑制小鼠肾小球系膜细胞炎症因子的表达

背景甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)在糖尿病肾病保护领域取得了很大进展。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)与糖尿病肾病的发生密切相关,甘草酸与HIF-1α在糖尿病肾病中的作用机制仍有待探索。目的探讨甘草酸是否可通过影响HIF-1α的表达而抑制高糖条件下肾小球系膜细胞(SV40 MES13)炎症因子水平,为糖尿病肾病的治疗提供实验依据。方法培养小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13),分为正常组(NG 5.6 mmol/L)、高糖组(HG 30 mmol/L)、高糖+甘草酸组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L)。Western blot方法检测各分组细胞HIF-1α、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白因子的表达水平,免疫荧光方法检测各分组HIF-1α、VEGF在细胞内的表达。将细胞按照正常组(NG 5.6 mmol/L)、高糖组(HG 30 mmol/L)、高糖+甘草酸组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L)、高糖+KC7F2组(HG 30 mmol/L+KC7F27.5μmol/L)、高糖+甘草酸+KC7F2组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L+KC7F27.5μmol/L)、高糖+DMOG组(HG 30 mmol/L+DMOG 25μmol/L)、高糖+甘草酸+DMOG组(HG 30 mmol/L+GA 200μmol/L+DMOG 25μmol/L)进行培养(48 h),CCK-8检测细胞增殖水平,Western blot和酶联免疫吸附实验(ELISA)检测不同分组细胞白细胞介素(interleukin,IL)-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的表达。结果Western blot、免疫荧光方法实验结果表明,甘草酸能够抑制高糖条件下小鼠肾小球系膜细胞(SV40 MES13)HIF-1α、VEGF蛋白因子的表达。CCK-8实验表明,HIF-1α的上调促进了小鼠肾小球细胞的增殖,甘草酸能够进一步抑制激活剂DMOG所诱导的细胞增殖水平,并且也能够协同抑制剂KC7F2进一步抑制肾小球系膜细胞的增殖。Western blot实验结果表明,甘草酸能显著抑制DMOG诱导的HIF-1α、VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8蛋白因子的高表达(P<0.05),也能够联合KC7F2抑制HIF-1α、VEGF、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8的表达(P<0.05),酶联免疫吸附实验(ELISA)得到同样的结果。结论甘草酸通过下调HIF-1α的表达而抑制高糖条件下肾小球系膜细胞(SV40 MES13)炎症因子的表达。

新型多肽AMPP2在TGF-β1诱导的系膜细胞增殖中的作用及其机制

目的 探究新型多肽AMPP2在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的小鼠系膜细胞增殖中的作用及相关机制。方法 体外用TGF-β1(10μg/L)及AMPP2(10 ng/L)干预系膜细胞,分为Control组、AMPP2组、TGF-β1组及TGF-β1+AMPP2组。CCK-8法检测各组系膜细胞增殖活力;Western blot法检测各组细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)-4、CDK-6、细胞增殖核抗原(PCNA)、α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、纤维连接蛋白(FN)及磷酸化的SMAD同源物3/SMAD同源物3(p-SMAD3/SMAD3)的蛋白表达水平;qPCR法检测各组α-SMA、COL-Ⅰ、FN的m RNA表达水平。结果 与Control组相比,TGF-β1组系膜细胞增殖活力增加(P<0.05),与TGF-β1组相比,TGF-β1+AMPP2组系膜细胞增殖活力下降(P<0.05);与Control组相比,TGF-β1组CDK-4、CDK-6、PCNA蛋白以及α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白和mRNA表达水平升高(P<0.05),与TGF-β1组相比,TGF-β1+AMPP2组上述蛋白及mRNA表达水平均下降(P<0.05);与Control组相比,TGF-β1组p-SMAD3/SMAD3水平显著升高(P<0.05),与TGF-β1组相比,TGF-β1+AMPP2组p-SMAD3/SMAD3的蛋白表达量显著降低(P<0.05)。结论 AMPP2可能通过调控TGF-β1/SMAD3通路抑制系膜细胞增殖。