Podocin蛋白对肾小球足细胞的影响

目的:探讨肾小球足细胞裂隙膜蛋白podocin对足细胞形态及蛋白尿的影响。方法:32只体重160g～220g的雄性SD大鼠按阿霉素给药剂量随机分成小剂量组(3．0mg/Kg)、肾病剂量组(7．5mg/Kg)、超剂量组(10．0mg/Kg)、正常对照组。于给药第三周末处死大鼠,用氯化苄乙氧铵比浊法检测大鼠24h尿蛋白量,用免疫胶体金电镜检测大鼠肾小球蛋白podocin的表达和足细胞形态。结果:阿霉素组大鼠24h尿蛋白排泄量明显高于正常对照组,尤以肾病组最明显(P＜0．05);正常对照组大鼠podocin分布在靠近肾小球基底膜(GBM)的足突基底部,主要定位于裂隙隔膜的胞质面,部分金颗粒也可发现于GBM稍远的足突细胞表面．肾病组肾小球足突广泛融合,免疫胶体金颗粒几乎见不到;超剂量组和小剂量组podocin分布在靠近肾小球基底膜(GBM)的足突基底部,免疫胶体金颗粒数明显少于正常对照组,有部分足突退缩。结论:(1)podocin表达减少或消失可能是导致肾小球足突细胞融合的关键因素(2)蛋白尿的发生与肾小球足细胞裂隙膜蛋白podocin的减少或缺失有关。

局灶节段性肾小球硬化患者足细胞钙神经蛋白的表达

目的:观察成人局灶节段性肾小球硬化(focal segmental glomerulosclerosis,FSGS)患者足细胞钙神经蛋白的表达并探讨其意义。方法:选取临床表现为肾病综合征且经肾活检确诊的成人特发性FSGS63例,微小病变(minimal change disease,MCD)24例和肾移植供肾组织10例作为对照。免疫组化法检测肾组织钙神经蛋白A(CnA)异构体α、β、γ的表达。免疫荧光法行肾组织CnAα和synaptopodin双标记,并采用胶体金免疫电镜对肾小球CnAα的表达定位。两位病理医生分别盲法评分染色结果。结果:供肾组织肾小球CnAα、β、γ免疫组化染色均阴性,肾小管CnAα、β微弱表达,CnAγ阴性。26例FSGS患者肾小球足细胞CnAα表达上调,其阳性率为41.27%;而MCD患者肾小球CnAα阴性(P<0.01);两者肾小球CnAα、β、γ染色均阴性。足细胞CnAα阳性患者肾小管损伤指标尿视黄醇结合蛋白[20.91(0.17～54.37)mg/L]、血清肌酐[(128.18±56.58)μmol/L]高于阴性患者(P<0.05);两者间病理类型构成差异存在统计学意义(P<0.01);而年龄、性别、尿蛋白、尿N-乙酰-β-葡萄糖苷酶、血清白蛋白及胆固醇无统计学差异。塌陷型、细胞型、顶部型、门周型FSGS中足细胞CnAα阳性病例分别为5例(83.33%)、10例(66.67%)、8例(61.54%)、3例(20%),14例经典型FSGS患者均阴性。多因素Logistic回归分析示血清肌酐(OR4.855,P<0.01)、塌陷型(OR11.069,P<0.05)为FSGS患者足细胞CnAα过表达的主要相关因素。69.23%足细胞CnAα阳性患者肾小球syanptopodin表达减弱且不连续。结论:本研究首次发现部分FSGS患者足细胞上CnAα表达增强,这可能参与了FSGS的发病。FSGS与MCD患者足细胞CnAα的表达差异,提示二者发病机制不同。对临床怀疑FSGS而未见明确节段病变的患者,足细胞CnAα阳性有助于诊断。

荔枝核总黄酮对高糖联合肿瘤坏死因子诱导大鼠肾小球系膜细胞纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白表达的影响

目的观察荔枝核总黄酮(total flavonoids of litchi,TFL)对高糖联合TNF-α诱导大鼠肾小球系膜细胞分泌纤维黏连蛋白(FN)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)蛋白表达的影响。方法以大鼠肾小球系膜细胞(HBZY-1)为研究对象,用不同浓度荔枝核总黄酮干预高糖联合TNF-α诱导的大鼠肾小球系膜细胞,作用48 h后,采用酶联免疫分析法(ELISA)和细胞免疫组化法检测HBZY-1表达FN、ColⅣ蛋白情况。结果高糖联合TNF-α刺激大鼠肾小球系膜细胞48 h,FN、ColⅣ蛋白表达明显增高〔(59.946±0.307)vs.(66.825±0.929);(46.445±0.653)vs.(59.443±4.102),P<0.01〕,经荔枝核总黄酮干预后FN、ColⅣ蛋白表达明显降低〔(66.825±0.929)vs.(59.496±1.258)、(62.553±1.022)、(52.541±0.608);(59.443±4.102)vs.(51.252±3.676)、(47.742±1.396)、(48.438±0.207)、(47.046±1.810),P<0.01〕。结论高糖联合肿瘤坏死因子能够促进大鼠肾小球系膜细胞纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白的表达,且荔枝核总黄酮干预后FN、ColⅣ蛋白表达明显降低,提示荔枝核总黄酮干预糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)肾纤维化作用的部分机制可能与下调纤维黏连蛋白、Ⅳ型胶原蛋白的表达有关。

雷公藤内酯醇对小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜核心蛋白表达干预作用的研究

目的观察雷公藤内酯醇(TP)干预高糖环境培养的小鼠肾小球足细胞裂孔隔膜nephrin、podocin和CD2AP的表达,探讨雷公藤治疗糖尿病肾病(DN)蛋白尿的分子生物学机制。方法培养成熟的小鼠足细胞随机分为对照组1、对照组2、高糖组和TP干预组,TP干预组进一步分为低剂量、中剂量和高剂量组。用不同浓度的TP(8、16和32ng/ml)干预高糖(25mmol/L的Glu)培养24h后的小鼠足细胞,用RT-PCR法检测干预前后nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达;用间接免疫荧光法检测16ng/ml TP干预后nephrin和podocin蛋白的表达。结果(1)与对照组相比,高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA表达均明显减弱(均P<0.01)。(2)TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP mRNA的表达(均P<0.05)。(3)16ng/ml TP能明显上调高糖对足细胞nephrin和podocin(均P<0.05)蛋白表达的抑制。结论 TP显著上调高糖诱导的足细胞nephrin、podocin和CD2AP的表达,可能是其降低DN蛋白尿的机制之一。

CD2AP突变对肾小球足细胞骨架蛋白F-actin分布的影响

目的构建突变型CD2相关蛋白(CD2AP)荧光表达载体并转染肾小球足细胞,观察细胞内骨架蛋白F-actin分布的变化。方法定点诱变真核表达质粒pcDNA6-V5-CD2AP致CD2AP第2外显子160G>A杂合突变,测序鉴定。利用野生型和突变型质粒和pEGFP-C1荧光表达载体,分别构建野生型和突变型重组质粒pEGFP-C1-CD2AP荧光表达载体并转染小鼠肾小球足细胞,荧光显微镜观察处于不同细胞周期的足细胞内F-actin分布情况。结果测序结果显示,pcDNA6-V5-CD2AP真核表达载体CD2AP的2号外显子第160位碱基G诱变为A,而其他碱基未发生改变。在细胞分裂间期,未转染足细胞内F-actin平行排列成纤维束;野生型重组质粒转染足细胞内F-actin在细胞核周围呈点、块状浓聚;而突变型重组质粒转染足细胞内F-actin主要在细胞膜上勾出轮廓。在细胞分裂中期,野生型重组质粒转染足细胞内F-acin纤维丝呈粗纤维状,环细胞浓聚;突变型重组质粒转染足细胞则仅见胞质内F-acin纤维丝增多,部分区域浓聚。结论成功构建野生型和突变型重组CD2AP荧光表达载体。CD2AP基因160G>A杂合突变使肾小球足细胞分裂间期和分裂中期的F-actin纤维骨架发生改变。

IgA肾病大鼠肾组织中T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域基因1的表达和意义

目的观察Ig A肾病(Ig AN)大鼠肾组织中T细胞免疫球蛋白与黏蛋白域基因1(TIM-1)的表达,探讨TIM-1在Ig AN大鼠发病中的作用。方法 20只雄性SD大鼠随机分成Ig AN模型组和对照组,每组10只。在复制模型完成后处死大鼠,取肾脏,肾组织切片行PAS染色,免疫荧光观察大鼠肾脏病理变化,并行免疫组织化学法检测肾组织中TIM-1的表达,实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测TIM-1 m RNA的表达。结果 Ig AN组TIM-1主要分布在肾小球和肾小管,表达量较对照组增加(P<0.05)。Ig AN组肾组织中TIM-1 m RNA表达量均较对照组升高。TIM-1 m RNA相对表达量和肾脏病理Katafuchi评分呈正相关,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 TIM-1可能参与了Ig AN的发生发展。

足细胞蛋白Nephrin、Podocin与肾小球疾病

肾小球疾病是指累及两侧肾小球的一类疾病,多以蛋白尿为主要临床表现,由于发病机理尚不明确,因此疾病早期缺乏准确有效的检测和诊断手段。近来研究发现足细胞蛋白Nephrin和Podocin在多种肾小球疾病发生发展和诊断预测中起重要作用。本文就近几年Nephrin、Podocin与肾小球疾病的相关研究进行综述。

高糖对人肾小球系膜细胞分泌单核细胞趋化蛋白1及层黏连蛋白的影响

目的通过体外试验研究高糖对人肾小球系膜细胞(HMC)分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和层黏连蛋白(LN)的影响。方法用高糖干预体外培养的HMC,以ELISA法检测细胞培养上清的MCP-1和LN水平。结果高糖组培养上清在不同时点(24,48,72h)MCP-1和LN的表达水平明显高于正常糖组和甘露醇组(P<0.05)。高糖干预24h后,培养上清MCP-1和LN水平开始升高,于72h达峰值,正常糖组和甘露醇组未见显著升高(P<0.05)。结论高糖呈时间依赖方式增加HMC对MCP-1和LN的分泌,而正常糖和甘露醇无此作用。MCP-1和LN的增加是由于高糖而非高渗所致,提示高糖所致的炎性反应可能参与糖尿病肾病的发生和发展。

沉默FAM40A基因对小鼠肾小球足细胞F-肌动蛋白分布的影响

目的探究FAM40A在肾小球足细胞中的表达和定位,及其是否影响肾小球足细胞的细胞骨架和细胞形态。方法通过体外培养永生化的小鼠肾小球足细胞,观察FAM40A在小鼠足细胞上的表达和定位。应用小干扰RNA(siRNA)转染沉默技术,构建FAM40A基因沉默的肾小球足细胞模型,通过细胞免疫荧光、PCR和Western印迹法,观察FAM40A基因沉默后足细胞F-肌动蛋白(F-actin)分布的改变。结果在小鼠足细胞,FAM40A主要表达于细胞核和细胞核周围的细胞质内。分化成熟的肾小球足细胞在FAM40A基因沉默后,F-actin在靠近细胞膜的区域分布增加,而在细胞质的中央区域分布明显减少,细胞边缘变得毛糙,细胞形态发生了较大改变。结论 FAM40A参与了足细胞的细胞骨架动态调节过程,沉默FAM40A基因可促使肾小球足细胞骨架蛋白F-actin向细胞膜再分布,影响细胞形态。

他克莫司对嘌呤霉素损伤的肾小球足细胞重组人帕金森蛋白7表达的影响

目的探讨嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)对小鼠肾小球足细胞(mouse podocyte clone 5,MPC-5)凋亡及重组人帕金森蛋白7(Parkinson's disease 7,Park7)表达的影响,以及他克莫司(tacrolimus,FK506)对MPC-5损伤的保护机制。方法体外培养MPC-5,分为空白对照组(对照组)、PAN组和FK506组。PAN组滴加PAN(浓度50 mg/L)构建MPC-5损伤模型,FK506组同时滴加PAN(浓度50 mg/L)和FK506(浓度5 mg/L)。分别于12、24、48 h在倒置显微镜下观察MPC-5的形态结构;采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率;采用实时荧光定量PCR法检测Park7 mRNA的表达;采用Western blot、免疫荧光染色法检测Park7蛋白表达。结果对照组各时间点细胞体足突数量多,细胞之间连接紧密,呈正常形态;PAN组各时间点细胞体积较对照组明显缩小,细胞间连接松散,可见破碎细胞;FK506组各时间点细胞体积较PAN组增大,细胞之间的连接较紧密,形态好转。PAN组各时间点细胞凋亡率较对照组明显升高,FK506组各时间点细胞凋亡率较PAN组均下降(P<0.05)。PAN组各时间点的Park7 mRNA表达量均较对照组显著增高,FK506组各时间点Park7 mRNA表达量较PAN组均下降(P<0.05)。Western blot结果显示PAN组中各时间点Park7蛋白表达量均较对照组显著增高,FK506组各时间点Park7蛋白表达量较PAN组均下降(P<0.05)。免疫荧光染色显示PAN组Park7蛋白分布在细胞膜和细胞质中,较对照组明显增加,呈密集团状分布,荧光强度增加;FK506组Park7蛋白分布较PAN组明显降低。结论PAN作用于MPC-5可引起细胞形态结构损伤及凋亡,以及Park7 mRNA及其蛋白的表达上调;FK506可使MPC-5损伤模型的Park7 mRNA及其蛋白表达下调,维持细胞功能稳态,减轻蛋白尿,延缓肾小球硬化。

高糖状态下小鼠肾小球足细胞凋亡和组成型光形态建成1蛋白的表达

背景:组成型光形态建成1蛋白与细胞凋亡有关。目的:观察高糖对体外培养的小鼠肾小球足细胞凋亡和组成型光形态建成1蛋白表达的影响。方法:将不同浓度葡萄糖溶液分别加入体外培养的条件永生性小鼠肾小球足细胞株培养液中,培养不同时间后检测肾小球足细胞凋亡指数和死亡指数,以筛选最佳剂量效应葡萄糖浓度。用30mmol/L葡萄糖溶液干预小鼠肾小球足细胞(高糖组),并设立对照组和采用30mmol/L甘露醇干预的甘露醇组。结果与结论:在一定浓度范围内,葡萄糖呈时间和剂量依赖性诱导肾小球足细胞凋亡和死亡(P<0.05),随着葡萄糖浓度的进一步加大,肾小球足细胞死亡指数明显升高,而凋亡指数变化不大。与对照组比较,高糖组凋亡指数显著增加(P<0.05),其COP1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降(P<0.05)。结果证实,高糖可诱导肾小球足细胞的凋亡,其机制可能与其下调COP1的表达有关。

肾小球足细胞骨架蛋白研究进展

足细胞即肾小囊脏层上皮细胞，附着在肾小球毛细血管襻的外侧，其足突之间的裂孔膜与肾小球基底膜（GBM）及肾小球毛细血管内皮细胞共同组成肾小球的滤过屏障，位于肾小球基底膜的最外层，是阻止蛋白丢失的最后屏障。近年来随着一系列新的表达于足细胞的蛋白分子的发现，显示足细胞是一种具有特殊动力学的上皮细胞，在多种肾小球疾病的发生和发展中起着重要作用。研究足细胞的生物学特性，阐明足细胞损伤的分子机制，

基于蛋白质组学探讨RAB7对肾小球足细胞线粒体自噬的影响

目的通过蛋白质组学探究RAB7作为线粒体自噬生物标志物对肾小球足细胞线粒体自噬的影响。方法将6只SD大鼠随机分为对照组和模型组(n=3),尾静脉注射阿霉素复制慢性肾小球肾炎(CGN)模型。采用蛋白质组学技术联合自噬数据库鉴定CGN大鼠的差异自噬相关蛋白。体内采用Western blot方法验证相关蛋白的表达,体外采用嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导肾小球足细胞损伤模型,使用免疫荧光、透射电镜、Western blot等方法检测线粒体自噬变化。结果共筛选出12个自噬相关蛋白,其中RAB7 degree值最高。体内经Western blot验证的SNRPE、CTNNBI、CAT、RAB7A、SOD2蛋白表达水平与蛋白质组学数据一致。体外实验中,与正常组比较,模型组中RAB7、Parkin和PINK1蛋白表达水平降低(P<0.01);RAB7过表达后,与正常组比较,模型组中自噬标志物LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白表达水平升高(P<0.01),P62蛋白表达水平降低(P<0.01)。结论RAB7可能是CGN中线粒体自噬生物标志物,影响肾小球足细胞线粒体自噬。

基于“肾藏精”理论探讨局灶节段性肾小球硬化中足细胞与蛋白尿的关系

足细胞防止清蛋白等精微物质滤过的功能与“肾藏精”理论相通,足细胞代肾用事,尽封藏之职。局灶节段性肾小球硬化以足细胞损伤为中心,足细胞数量越少,肾气越虚,藏精功能越差,病机以肾虚为本。中医药从不同机制保护足细胞,减少尿蛋白,力图补充肾气,恢复肾的藏精功能。

基质金属蛋白酶-9在IgA肾病足细胞损伤中表达变化的意义

目的探讨基质金属蛋白酶-9（MMP-9）在IgA肾病患者肾组织足细胞损伤中表达变化的意义。方法48例经肾穿刺活检明确诊断的IgA肾病，采用免疫组织化学技术定量肾组织足细胞表面特异性标记物Wilms肿瘤蛋白（WT1）和MMP-9的变化。结果组织学分级Ⅰ～Ⅲ级组IgA肾病患者肾小球MMP-9表达量与足细胞T1表达量呈正相关（r=0．556，P〈0．05），Ⅳ—Ⅴ级组IgA肾病患者肾小球MMP-9表达量与足细胞WT1呈负相关性（r=-0．773，P〈0．01）。IgA肾病患者足细胞WT1表达与血压、尿蛋白无明显相关性，但与血清肌酐水平呈正相关（r=0．756，P〈0．01）。MMP-9在正常肾小球少量表达或无表达；随着新月体、增殖性病变加重表达也增加，肾小球MMP-9的表达与血压无相关性，但与尿蛋白呈正相关（r=0．812，P〈0．01），与血清肌酐呈负相关（r=-0．657，P〈0．01）。结论MMP-9的异常表达可能是影响IgA肾病足细胞损伤的因素之一。