整合素β_1在新生猪肾小管上皮细胞缺氧损伤中的变化

目的 探讨新生儿窒息所致肾脏损害机制。方法 运用抗霉素 ( antimycin) A无糖血清的培养基 ,建立 3 0、60、90和 12 0 min肾小管上皮 ( RTE)细胞缺氧模型 ,检测 RTE细胞中三磷酸腺苷 ( ATP)含量 ,采用流式细胞技术测定 RTE细胞整合素β1 数量的变化。结果 成功建立了 3 0、60、90、12 0 min低 ATP管上皮细胞模型。各时段( 3 0、60、90和 12 0 m in)组 ATP含量较正常组明显降低 ( P<0 .0 0 1)。随缺氧时间的延长 ,整合素 β1 水平有逐渐下降趋势 ,3 0、60、90和 12 0 min组较正常组明显降低 ( P均 <0 .0 0 1) ,各组间比较 ,P均 <0 .0 0 1。结论 整合素β1 在缺氧新生猪 RTE细胞的减少 。

肾损伤分子-1在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的保护作用

目的观察肾损伤分子-1(KIM-1)对肾小管上皮细胞缺氧损伤时增殖及凋亡的影响,证实KIM-1对肾缺氧损伤的保护作用。方法以人近端肾小管上皮细胞HK-2为研究对象,用pcDNA-hKIM-1质粒转染HK-2细胞,获得稳定表达KIM-1的pcDNA-hKIM-1-HK2细胞株。观察pcDNA-hKIM-1-HK2细胞(A组)和KIM-1抗体预处理pcDNA-hKIM-1-HK2细胞(C组)在缺氧损伤后细胞活力、凋亡指标及凋亡相关信号分子表达,以未转染缺氧HK-2细胞(B组)作为对照。结果 A组细胞活力指数高于B组(0.427±0.046 vs.0.210±0.036,P<0.05),细胞凋亡数量及流式细胞仪检测的缺氧早、晚期凋亡指数明显低于B组(P<0.05)。A组细胞缺氧时磷酸化ERK、磷酸化Akt表达较C组明显升高(P<0.05)。结论 KIM-1对肾小管上皮细胞缺氧损伤具有保护作用,其机制与激活PI3K-Akt/PKB和ERK信号通路抑制凋亡有关。

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠肾小管上皮细胞缺氧损伤的干预作用

目的:观察体外缺氧损伤的大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡情况以及分离纯化人脐带间质干细胞来源的外切体(hucMSCs-exosomes)对其干预作用。方法:将体外培养的NRK-52E细胞随机分为对照组、缺氧损伤模型组和hucMSCs-exosomes(0.5,1.0 mg/ml)预处理组。随后进行细胞计数,蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白(Bcl-2,bax)的表达变化,流式细胞仪检测细胞周期以及凋亡率的变化。结果:与对照组相比,模型组细胞凋亡相关指标均明显升高,细胞计数下降(P<0.01),Bcl-2/bax表达下调(P<0.01),细胞周期S期阻滞以及凋亡细胞比例明显增多。而hucMSCs-exosomes预处理组可明显改善缺氧损伤时的细胞活力,上调Bcl-2/bax的表达,改善细胞周期和凋亡细胞的比例(P均<0.05)。结论:NRK-52E在缺氧损伤时有明显的细胞凋亡,而hucMSCs-exosomes预处理可能通过抗凋亡途径减轻缺氧时细胞的损伤。本实验可为进一步研究hucMSCs-exosomes在组织损伤修复中的生物学功能和相关机制提供实验基础。

HIF-2α通过调控NEK1表达减轻肾小管上皮细胞缺氧损伤的研究

目的探讨缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)在肾小管上皮细胞缺氧损伤中的作用及机制。方法体外培养人近曲小管上皮细胞(HK-2细胞),以2.5μmol/L抗霉素A作用24 h构建缺氧HK-2细胞模型,采用qRT-PCR法和Western blot法检测HIF-2α在正常HK-2细胞和缺氧HK-2细胞中的表达;将HIF-2α干扰序列(siRNA-HIF-2α)及其阴性对照(siRNA-NC)、NIMA相关激酶-1(NEK1)过表达质粒(pcDNA3.0-NEK1)及空载体质粒(pcDNA3.0-NC)转染至缺氧HK-2细胞后,采用CCK-8法检测缺氧HK-2细胞增殖活性,Annexin V-FITC/PI双染法检测缺氧HK-2细胞凋亡率,qRT-PCR法和Western blot法检测缺氧HK-2细胞中NEK1表达。结果与正常HK-2细胞比较,缺氧HK-2细胞中HIF-2αmRNA和蛋白表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与Control组比较,Hypoxia组细胞增殖活性降低、细胞凋亡率升高、细胞中NEK1 mRNA和蛋白表达量均升高,差异均有统计学意义(P<0.05);与Hypoxia组比较,si-NC组细胞增殖活性、细胞凋亡率、细胞中NEK1 mRNA和蛋白表达量均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与si-NC组比较,si-HIF-2α组细胞增殖活性降低、细胞凋亡率升高、细胞中NEK1 mRNA和蛋白表达量降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与si-HIF-2α组比较,si-HIF-2α+pcDNA3.0-NC组细胞增殖活性、细胞凋亡率均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05);与si-HIF-2α+pcDNA3.0-NC组细胞比较,si-HIF-2α+pcDNA3.0-NEK1组细胞增殖活性升高、细胞凋亡率降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-2α可能通过调控NEK1表达促进缺氧HK-2细胞增殖、抑制细胞凋亡,从而减轻HK-2细胞缺氧损伤。

miR-15b-5p靶向FOXO1对缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤的调控作用及其机制

目的探讨miR-15b-5p靶向叉头框蛋白O1(FOXO1)对缺氧/复氧(H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的调控作用及其机制。方法取对数生长期HK-2细胞,设置:(1)对照组(正常培养)与H/R组(H/R诱导培养)。倒置显微镜下观察HK-2细胞形态,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测mi-15b-5p、FOXO1 mRNA的表达,Western blotting检测FOXO1蛋白的表达。(2)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+mimic对照组(转染mimic对照质粒后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic+OE-NC组(共转染mi R-15b-5p mimic和OE-NC质粒后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和FOXO1过表达质粒后H/R诱导培养)。采用qRT-PCR检测mi-15b-5p的表达,Western blotting检测FOXO1、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的表达,CCK-8法检测细胞活力,TUNEL染色检测细胞凋亡情况。(3)对照组(正常培养)、H/R组(H/R诱导培养)、H/R+miR-15b-5p mimic组(转染miR-15b-5p mimic后H/R诱导培养)与H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组(共转染miR-15b-5p mimic和OE-FOXO1后H/R诱导培养)。采用Western blotting检测LC3、p62、Beclin-1蛋白的表达,LC3免疫荧光检测细胞自噬水平。双荧光素酶报告实验检测miR-15b-5p与FOXO1之间的靶向关系。结果倒置显微镜下观察显示,对照组细胞数量较多,细胞大多呈典型鹅卵石形态,铺路石状生长;H/R组大部分细胞收缩变圆,贴壁细胞数量明显减少。与对照组比较,H/R组miR-15b-5p表达水平明显降低,FOXO1 mRNA和蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。荧光素酶报告实验结果显示miR-15b-5p直接靶向作用于FOXO1的3'-UTR。miR-15b-5p过表达抑制H/R诱导的HK-2细胞活力,降低细胞凋亡,抑制细胞自噬(P<0.05)。与H/R+miR-15b-5p mimic组相比,H/R+miR-15b-5p mimic+OE-FOXO1组HK-2细胞存活率降低,细胞凋亡和自噬水平增高(P<0.05)。结论miR-15b-5p通过靶向抑制FOXO1降低细胞自噬减缓H/R诱导的HK-2细胞损伤。

山松醇同源物1在缺氧/复氧诱导的人肾小管上皮细胞损伤中的作用及机制研究

目的探究山松醇同源物1(pumilio homolog 1,PUM1)在缺氧/复氧(hypoxia/reoxy-genatio,H/R)诱导的人肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HK-2)损伤中的作用及机制。方法体外建立HK-2细胞的H/R模型;通过小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)敲低HK-2细胞的PUM1表达;细胞等量随机法分为对照(Control)组、H/R组、H/R+siRNA组。蛋白质印迹法用以检测PUM1蛋白表达水平;细胞计数试剂盒8用以检测细胞活力;过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)评估氧化应激水平;流式细胞术用以检测细胞凋亡水平。结果与Control组相比,H/R 3 h组(1.76±0.11比0.98±0.05)、H/R 6 h组(2.89±0.14比0.98±0.05)、H/R 12 h组(3.78±0.08比0.98±0.05)PUM1的蛋白表达水平随着缺氧时间的延长逐渐增高(均P<0.05)。与H/R组相比,H/R+si-PUM1组敲低PUM1的表达能够显著改善H/R后HK-2细胞的细胞活力(73.67±3.42比29.60±2.94)、氧化应激[H_(2)O_(2):(13.53±0.85)μmol/L比(22.43±1.12)μmol/L、MDA:(16.03±0.70)μmol/L比(31.20±1.50)μmol/L、SOD:(34670±1800)U/L比(5730±1220)U/L]及凋亡水平[(14.89±1.65)%比(39.71±1.94)%](均P<0.05)。结论PUM1在H/R诱导的HK-2细胞中上调,抑制PUM1的表达可以减少氧化应激及细胞凋亡水平,从而减轻H/R损伤。

远隔缺血预处理分离液对人肾小管上皮细胞缺氧性损伤的保护作用

目的:研究远隔缺血预处理(RIPC)分离液对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧(H/R)损伤的影响及机制。方法:将HK-2细胞分为时间对照组、H/R、RIPC处理组、自噬干预组。时间对照组细胞在正常条件下培养,RIPC组细胞使用RIPC分离液预处理,自噬干预组细胞在RIPC处理基础上,加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3MA),后三组细胞使用三气培养箱进行H/R构建损伤模型。模型成功后使用光学显微镜观察各组细胞状态,应用Western blot观察LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白的表达水平。结果:镜下示RIPC分离液可明显减轻H/R对HK-2细胞的损伤,加入自噬抑制剂,RIPC分离液对HK-2细胞H/R损伤的保护作用被阻断。Western blot结果显示,RIPC分离液可使HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达水平增高。Real-time PCR结果显示,与H/R组比,RIPC组LC3及Beclin1的mRNA表达量明显升高;加入自噬抑制剂,HK-2细胞线粒体中的自噬特异性蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1表达降低,LC3及Beclin1的mRNA表达量同时也明显降低。结论:RIPC分离液对HK-2细胞H/R后损伤具有保护作用,作用机制可能与线粒体自噬相关。

骨髓间充质干细胞来源的外泌体对缺氧/复氧诱导的肾小管上皮细胞损伤的影响

目的探讨骨髓间充质干细胞来源外泌体(BMSCs-Exo)对缺氧/复氧(H/R)诱导的肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用及其分子机制。方法外泌体试剂盒提取BMSCs-Exo,透射电镜观察其形态,Western blot检测外泌体表面特异性标志蛋白,采用PHK67绿色荧光标记外泌体并观察HK-2细胞摄取现象。将HK-2细胞分为对照组(NC)、正常组+外泌体组(Exo)、H/R诱导组(H/R)、H/R+外泌体组(H/R+Exo),采用CCK-8法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡,活性氧(ROS)荧光法测试盒检测ROS水平,氧化应激相关检测试剂盒测定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量。qRT-PCR、Western blot及免疫荧光法检测细胞自噬标志蛋白Beclin1的表达水平。结果成功获得BMSCs-Exo并观察到它可被HK-2细胞摄取。与NC组相比,H/R组HK-2细胞活力、GSH水平显著降低,而凋亡率、ROS、MDA水平显著升高(均P<0.05);与H/R组相比,H/R+Exo组细胞活力、GSH水平则显著增强,凋亡率、ROS、MDA水平下降(均P<0.05);与NC组相比,H/R组Beclin1表达升高,在H/R组加入外泌体后,H/R+Exo组Beclin1表达显著降低(均P<0.05)。结论BMSCs-Exo能通过上调Beclin1改善H/R诱导的HK-2的损伤。

基于Traf6/TAK1通路探讨维生素D对甲状腺功能减退肾损伤幼鼠肾小管上皮细胞间充质转化的影响

目的探讨维生素D(VD)对甲状腺功能减退(HT)肾损伤幼鼠肾小管上皮细胞间充质转化(EMT)的影响,以及其对肿瘤坏死因子受体相关因子6(Traf6)/转化生长因子-β活化激酶1(TAK1)通路的调控机制。方法通过丙基硫尿嘧啶(PTU)灌胃构建幼鼠HT模型,以过表达TAK1(pc DNA3.1-TAK1)作功能挽救实验;50只SPF级雄性SD大鼠分为正常组、HT组、VD低剂量(HT+VD-L)组、VD高剂量(HT+VD-H)组、HT+VD-H+pc DNA3.1-TAK1(HT+VD-H+pc)组,每组10只。全自动生化仪检测各组大鼠血清血肌酐(Scr)和血尿素氮(BUN)的含量;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法试剂盒(TUNEL)检测肾组织中的细胞凋亡;免疫组化检测肾组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cadherin)的表达;Western blot法检测肾组织中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Traf6、TAK1和磷酸化TAK1(p-TAK1)的表达。结果VD能明显降低HT幼鼠血清中Scr和BUN的含量,下调肾组织中的细胞凋亡率,降低肾组织中TGF-β1和α-SMA的表达,上调E-cadherin的表达;抑制肾组织中Traf6、p-TAK1和Bax的表达,升高肾组织中Bcl-2的表达,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论维生素D能抑制HT幼鼠肾小管上皮细胞的EMT,降低肾组织中的细胞凋亡率,减轻肾组织的病理损伤,改善其肾功能,这与抑制Traf6/TAK1信号的激活有关。

近端肾小管上皮细胞代谢重编程在急性肾损伤中的研究进展

肾脏是一个高代谢器官,尤其是近端肾小管上皮细胞,在生理情况下主要依赖脂肪酸氧化供能,但是在急性肾损伤(AKI)期间,线粒体和过氧化物酶体功能障碍,近端肾小管上皮细胞发生代谢重编程,能量供应转向糖酵解,生成乳酸,并伴脂肪酸氧化紊乱及糖异生受损,短期内代谢重编程可能是对肾脏有益的能量代偿,但是该过程中也会加重肾损伤。本文就近端肾小管上皮细胞代谢重编程在AKI中的作用进行综述。

人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的建立一种新的人近曲肾小管上皮细胞HK2缺氧/复氧损伤模型。方法本实验使用人近曲HK2。实验分为缺氧4、12和24h及缺氧24h后复氧4、12和24h组,每个实验组均设立空白对照组。采用经高温灭菌的液体石蜡覆盖法造成缺氧环境;苔盼兰摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,生化法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果人肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,苔盼兰摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高。说明缺血再灌注损伤导致了细胞膜的完整性破坏,甚至细胞发生了不可逆转的损伤。结论采用液体石蜡覆盖法建立人近曲肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法操作简单、易行、可靠。

内质网应激在大鼠肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤炎症反应中的作用

目的观察大鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)缺氧复氧损伤时内质网应激蛋白和炎症细胞因子表达的改变及其意义,以探讨缺氧复氧诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激与炎症反应的关系。方法 NRK-52E细胞用含5%胎牛血清的DMEM液培养于37℃、5%CO2恒温培养箱。将细胞分为正常对照组和缺氧/复氧损伤(hypoxia reoxygenation,H/R)组。采用全自动生化分析仪检测细胞培养液上清LDH活性,Western blot方法检测GRP78、CHOP蛋白表达,ELISA法检测细胞上清IL-β水平。结果①与对照组细胞培养液上清LDH(22.07±1.23)U/L比较,H/R损伤组(45.93±6.42)U/L显著增加(P<0.05)。②与对照组肾小管上皮细胞GRP78表达(0.80±0.04)比较,H/R损伤组(1.24±0.04)明显增加(P<0.05)。③与对照组肾小管上皮细胞CHOP表达(0.81±0.05)比较,H/R损伤组(1.19±0.05)明显增加(P<0.05)。④与对照组IL-1β水平(6.55±2.03)pg/ml比较,H/R损伤组(14.93±2.26)pg/ml显著增加(P<0.01)。结论缺氧复氧可以诱导大鼠肾小管上皮细胞内质网应激与炎症反应。内质网应激上调CHOP表达可能在肾小管上皮细胞缺氧复氧损伤炎症反应中具有重要作用。

重组hCGPx腺病毒对人肾小管上皮细胞(HK-2)缺氧再复氧损伤的保护作用

目的:研究重组腺病毒介导的人胞质型谷胱甘肽过氧化物酶(hCGPx)转染对人肾小管上皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用。方法:将含hCGPXcDNA的质粒pGEM-T-hCG-Px和重组腺病毒穿梭质粒pACCMV-pLpA重组,构建pACC-MV-hCGPx穿梭质粒后,与包装质粒pJM17共转染293细胞,构建重组腺病毒AdCMV-hCGPx。以重组腺病毒载体AdCMV-hCGPx转染体外培养的人肾小管上皮细胞株HK-2,以转染空载体的HK-2细胞为对照组,检测转染细胞中CGPx的表达水平。将HK-2细胞经缺氧再复氧损伤处理后,分别检测细胞的存活率、凋亡率及死亡率。结果:各转染组细胞中CGPx的表达率显著高于对照组(P<0.01)。经缺氧再复氧损伤处理后,AdCMV-hCGPx转染组细胞的存活率较对照组明显增强,死亡细胞明显减少,细胞凋亡明显受到抑制。结论:重组腺病毒介导的hCGPx转染人肾小管上皮细胞可保护缺氧再复氧引起的损伤。

BCG感染巨噬细胞对肾小管上皮细胞损伤和修复的影响

目的:探讨肾结核发生过程中结核分枝杆菌BCG感染巨噬细胞对肾小管上皮细胞损伤和修复的影响。方法:Transwell建立BCG感染的M0型巨噬细胞(上室)与HK-2细胞(下室)共培养模型,100 ng/ml佛波酯(PMA)诱导THP-1人单核巨噬细胞24 h成为M0型巨噬细胞,建立BCG感染细胞模型,分别于感染12 h和24 h收集细胞总蛋白,Western blot检测M1型巨噬细胞标志物CD86及M2型巨噬细胞标志物CD206蛋白表达,ELISA检测细胞培养上清中M1型巨噬细胞极化标志因子IL-6和TNF-α表达、M2型巨噬细胞极化标志因子TGF-β表达;实验分为HK-2组、BCG+HK-2组、BCG+M0+HK-2组及M0+HK-2组,CCK-8检测各组HK-2细胞活力,Hoechst实验检测各组HK-2细胞凋亡,蛋白免疫印迹检测各组HK-2细胞上皮细胞标志物E-cadhren及成纤维细胞标志物α-SMA等转分化指标表达。结果:BCG感染M0型巨噬细胞后,M1型巨噬细胞活力12 h高于24 h(P<0.05),M2型巨噬细胞活力24 h高于12 h(P<0.05);BCG感染的巨噬细胞与HK-2细胞共培养后,HK-2细胞活力24 h高于12 h(P<0.001),凋亡水平12 h高于24 h,上皮细胞标志蛋白E-cadherin蛋白水平24 h高于12 h(P<0.001),成纤维细胞标志蛋白α-SMA蛋白水平12 h高于24 h(P<0.01)。结论:肾结核发生发展过程中,早期BCG感染巨噬细胞可能通过M1型极化促进肾小管上皮细胞炎症损伤;随着感染时间延长,可能通过M2型极化修复肾小管上皮细胞损伤,发挥保护作用。

缺氧诱导因子-1α在新生儿窒息后缺氧／复氧肾脏人近曲肾小管上皮细胞损伤中的表达及丹参干预效果

目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在新生儿窒息后缺氧/复氧肾脏损伤中的表达及丹参的干预作用。方法以人近曲肾小管上皮细胞(HK-2)为研究对象,随机分为实验对照组、模型组、丹参组。采用液体石蜡覆盖法建立新生儿窒息后肾脏缺氧后复氧模型,每组都选择缺氧1、4、8、12、24h,缺氧后复氧1、4、8、12、24h,用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶法(SABC)测定HIF-1α的阳性率。组间比较采用单因素方差分析。结果经免疫组织化学检测,HIF-1α主要表达于HK-2细胞核。在常氧下,HIF-1α有阳性表达,但阳性率低。在缺氧1h,HIF-1α即有明显增高,随着缺氧时间的延长,阳性率渐升高,缺氧24h达最高峰;复氧后HIF-1α的表达仍升高,复氧4h达最高峰,随后逐渐下降,在复氧后24h达最低水平。与模型组相比,丹参组各个时间点的HIF-1α表达阳性率明显降低(Pa<0.01)。结论HIF-1α的表达增加是机体的一种内源性保护机制。丹参可使HIF-1α的表达下降。

脯氨酸羟化酶抑制剂对人肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的探讨脯氨酸羟化酶抑制剂——二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)通过稳定人肾小管上皮细胞(HKC)中低氧诱导因子-1α(HIF-1α)表达抗缺氧/复氧损伤(HRI)的作用及其机制。方法无糖缺氧12 h,复氧6 h制作HKC细胞HRI模型,分别于缺氧前2、4、6、12 h给予DMOG预处理,四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)检测细胞增殖活性,试剂盒检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,Annexin/PI染色流式细胞仪技术检测细胞凋亡,实时荧光定量PCR方法检测bcl-2和bax mRNA的表达,Western印迹检测HIF-1α、bcl-2和bax蛋白的表达。结果 DMOG预处理使HKC中HIF-1α表达增加,细胞损伤明显改善,表现为细胞增殖活性提高,培养上清液中MDA含量下降、SOD活性增强,细胞凋亡率下降(P<0.05);同时baxmRNA和蛋白表达下调(P<0.05),bcl-2 mRNA和蛋白表达上调(P<0.05)。结论 DMOG可通过稳定HIF-1α,影响凋亡相关基因的表达,改善HRI诱导的HKC细胞损伤。

缺氧与氧化损伤后肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架的改变

目的:观察缺氧、氧化损伤后培养的人肾小管上皮细胞能量代谢及细胞骨架改变之间的关系。方法:实验于2002-09/2003-09在解放军第三军医大学西南医院实验动物中心完成。①将人肾小管上皮细胞株HK-2细胞分为正常组、缺氧组、氧化损伤组3组:正常组中加入无血清RMPI1640培养液;缺氧组加入含0.1μmol/L抗霉素A的无血清无底物RMPI1640培养液;氧化损伤组加入含0.1mmol/LH2O2的无血清RMPI1640培养液。②观察各组细胞生长状况和形态及细胞存活率;测定细胞外液乳酸脱氢酶比活性代表肾小管上皮细胞膜通透性变化;采用ATP酶(Na+,K+和Ca2+-ATP)试剂盒直接测定各组细胞能量代谢改变,采用细胞免疫荧光化学方法检测各组细胞细胞骨架改变。结果:①正常组细胞生长状况良好,折光性强;缺氧、氧化损伤组细胞皱缩、突起减少,细胞存活率明显低于正常组[(56.2±2.3)%,(62.5±2.6)%,(96.5±3.2)%,P<0.01]。②缺氧、氧化损伤组乳酸脱氢酶比活性显著高于正常组(P<0.01)。③Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性正常组明显高于缺氧、氧化损伤组[(9.61±0.53),(3.68±0.27),(5.10±0.19)nkat/g;(7.97±0.66),(3.12±0.24),(4.56±0.32)nkat/g,P<0.01],而缺氧组、氧化损伤组之间比较差异不显著(P>0.05)。④免疫荧光标记细胞内细胞骨架(微管、微丝、中间丝)显示正常TEC微管、微丝、中间丝表达丰富,在胞浆内呈均匀一致分布;缺氧、氧化损伤后细胞骨架破坏、塌陷,网络结构和支架作用消失。结论:缺氧、氧化损伤能量代谢障碍可造成细胞骨架破坏,最终导致肾小管上皮细胞的坏死和凋亡。

SIRT1减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的实验研究

目的:研究沉默信息调节因子1(SIRT1)对缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的影响。方法:构建缺氧复氧肾小管上皮细胞损伤模型,用qRT-PCR和Western blot方法检测细胞中SIRT1的表达变化。在肾小管上皮细胞中转染pc DNA3. 1-SIRT1,qRT-PCR和Western blot检测过表达效率。ELISA法检测细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平。Western blot检测CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、Caspase-11蛋白水平。全自动生化分析仪检测培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果:缺氧复氧肾小管上皮细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均降低。pc DNA3. 1-SIRT1转染后的肾小管上皮细胞中SIRT1 mRNA和蛋白水平均明显升高。缺氧复氧肾小管上皮细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平升高,细胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平升高,细胞培养液中LDH水平升高。过表达SIRT1的肾小管上皮细胞经缺氧复氧处理以后,细胞分泌的TNF-α、IL-1β水平降低,细胞中CHOP、Caspase-11蛋白水平降低,细胞培养液中LDH水平降低。结论:SIRT1具有减轻缺氧复氧肾小管上皮细胞炎性损伤的作用,其可减少细胞分泌炎性因子,作用机制与内质网应激介导的Caspase-11途径有关。

大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型的建立

目的探讨建立大鼠肾小管上皮细胞NRK-52E缺氧/复氧损伤模型的一种新方法。方法本实验使用大鼠NRK-52E细胞。实验分为对照组和实验组,实验组分为缺氧2,4,6h及缺氧后复氧1,12和24h组。缺氧时换用缺氧液,再置入N294%+O21%+CO25%缺氧环境;缺氧后换用含10%胎牛血清的EMDM/F12,置入95%空气+CO25%有氧环境,制作缺氧/复氧模型;台盼蓝摄取法进行细胞计数及检测细胞存活率,分光光度法检测培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)含量。结果大鼠肾小管上皮细胞经过缺氧/复氧处理后,与对照组相比,台盼蓝摄取率显著提高,细胞存活率显著下降,LDH含量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用三气孵箱法建立大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤模型,较其他制模方法操作简单、易行、可靠。

PPARγ受体在大鼠缺氧性肾小管上皮细胞损伤中的表达及意义

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)在大鼠缺氧性肾小管上皮细胞(RTEC)损伤中的表达及意义。方法将体外传代培养的大鼠RTEC随机分为正常对照组、缺氧模型组、罗格列酮(RGZ)组和GW9662组。RGZ组加入15μmol/L RGZ,GW9662组加入25μmol/L GW9662,将缺氧模型组、RGZ组、GW9662组放入真空罐中制作RTEC缺氧模型。正常对照组细胞不做处理。造模36 h后,采RT-PCR法和Western blot法检测各组RTEC PPARγ、转化生长因子-β1(TGF-β1)的mRNA及蛋白表达。结果与正常对照组比较,缺氧模型组、RGZ组、GW9662组RTEC PPARγmRNA表达显著升高、蛋白表达显著降低(P均<0.05);与缺氧模型组相比,RGZ组RTEC PPARγmRNA表达降低,GW9662组表达上升(P均<0.05)。与正常对照组比较,缺氧模型组、RGZ组、GW9662组RTEC TGF-β1mRNA表达显著降低、蛋白表达显著升高(P均<0.05);与缺氧模型组比较,RGZ组RTEC TGF-β1mRNA表达上升,GW9662组表达降低(P均<0.05)。相关性分析显示,缺氧性RTEC损伤中PPARγ的蛋白表达与TGF-β1的蛋白表达呈显著负相关(r=-0.91,P<0.05)。结论 PPARγ蛋白的低表达可能参与了缺氧性RTEC损伤的发生;RGZ可能通过上调PPARγ蛋白的表达而减轻缺氧性RTEC损伤。