SMYD2介导高糖诱导小鼠肾成纤维细胞活化的机制研究

目的 探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶2(SMYD2)介导体外高糖环境下小鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)活化的可能机制。方法 复制糖尿病(DM)小鼠模型,经全自动生化分析仪检测各组小鼠血糖(BG)、血肌酐(Scr)水平,经苏木精-伊红、Masson染色观察小鼠肾组织病理改变,经Western blotting检测各组小鼠肾组织纤维连接蛋白(Fibronectin)、Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、组蛋白H3赖氨酸4三甲基化(H3K4me3)、SMYD2、核转录因子-κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65(NF-κB p-p65)蛋白表达,经免疫荧光检测各组小鼠肾组织α-SMA及SMYD2表达。复制体外DM细胞模型,使用正常糖(含5.5mmol/L葡萄糖)或高糖(含30.0 mmol/L葡萄糖)处理NRK-49F细胞,经Western blotting检测SMYD2、α-SMA及细胞外基质(ECM)成分蛋白表达;经CCK-8法检测SMYD2特异性抑制剂AZ505的细胞毒性;在AZ505处理/不处理的条件下,经Western blotting检测SMYD2、α-SMA、H3K4me3、Fibronectin、CollagenⅠ、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表达,经免疫荧光检测α-SMA、SMYD2及NF-κB p-p65在细胞中的表达及空间定位情况。结果 DM组血清BG、Scr水平高于NC组(P <0.05)。DM组肾组织α-SMA、Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2、H3K4me3、NF-κB p-p65蛋白相对表达量高于NC组(P <0.05),两组NF-κB p65蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。HG刺激不同时间点NRK-49F细胞α-SMA、Collagen I、Fibronectin、SMYD2蛋白相对表达量比较,差异均有统计学意义(P <0.05)。40μmol/L组、60μmol/L组NRK-49F细胞存活率较0μmol/L组低(P <0.05)。HG组NRK-49F细胞Fibronectin、CollagenⅠ、SMYD2蛋白相对表达量较NG组高(P <0.05),HG+AZ505(20μmol/L)组较HG组低(P <0.05)。HG组NRK-49F细胞Fibronectin、CollagenⅠ、α-SMA、H3K4me3、SMYD2蛋白相对表达量较NG组高(P <0.05),HG+AZ505组较HG组低(P <0.05)。HG组NRK-49F细胞NF-κB p-p65蛋白相对表达量较NG组高(P <0.05),HG+AZ505组较HG组低(P <0.05),各组小鼠NRK-49F细胞NF-κB p65蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论SMYD2可介导高糖诱导的NRK-49F细胞活化,其机制可能与激活NF-κB细胞信号通路有关。

SMYD2特异性抑制剂对高糖环境下大鼠肾成纤维细胞活化的影响及其机制

目的:明确赖氨酸甲基转移酶SMYD2(SET and MYND domain containing 2)特异性抑制剂对体外高糖(HG)环境下大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)活化的影响并探索其可能机制。方法:采用CCK-8法检测SMYD2特异性抑制剂LLY507对体外培养的NRK-49F细胞活力的影响。实验分组为正常糖(NG;含5.5 mmol/L葡萄糖)组、HG(含30 mmol/L葡萄糖)组、NG+LLY507(1.5μmol/L)组和HG+LLY507(1.5μmol/L)组,37℃培养48 h后收集各组细胞蛋白。采用Western blot实验检测SMYD2、组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化(H3K4me3)、纤维连接蛋白(fibronectin)、I型胶原蛋白(Col I)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、转化生长因子β1(TGF-β1)、p-Smad3、Smad3、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、核因子κB(NF-κB)p65、NF-κB p-p65、白细胞介素6(IL-6)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)及p-STAT3蛋白水平。结果:LLY507浓度低于1.6μmol/L对NRK-49F细胞的活力无显著影响;与NG组相比,HG组SMYD2、H3K4me3、fibronectin、Col I、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3,TNF-α、NF-κB p-p65、NF-κB p65、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平均显著升高(P<0.05);与HG组相比,HG+LLY507组SMYD2、H3K4me3、fibronectin、Col I、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、TNF-α、NF-κB p-p65、NF-κB p65、IL-6、p-STAT3和STAT3蛋白水平均显著降低(P<0.05)。结论:SMYD2特异性抑制剂LLY507可明显抑制HG诱导的NRK-49F细胞活化和细胞外基质分泌,其机制可能与阻断TGF-β1/Smad3、NF-κB和STAT3细胞信号通路激活相关。

三七总甙对人肾成纤维细胞的影响

目的 :研究三七总甙 (PNS)对人肾成纤维细胞 (KFB)增殖、分泌I型胶原、表达整合素 β1的影响。方法 :体外培养KFB ,分别采用四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法、ELISA法、流式细胞仪检测PNS对KFB增殖、分泌Ⅰ型胶原及表达整合素β1的影响。结果 :PNS在最佳浓度范围和作用时间内可明显抑制KFB细胞增殖及分泌Ⅰ型胶原 (与空白对照组比较 ,P <0 0 5 ) ,同时显著降低了KFB上整合素β1的表达 (与空白对照组比较 ,P <0 0 5 )。结论 :PNS可成为防治肾间质纤维化的有效药物。

大黄素对血管紧张素Ⅱ刺激人肾成纤维细胞增殖、胶原表达的抑制效应研究

目的 研究大黄素对血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )刺激人肾成纤维细胞 (KFB)增殖、胶原表达等的抑制效应。方法 用3 H TdR掺入法 ,流式细胞仪及免疫组织化学技术观察了AngⅡ对KFB增殖 ,细胞周期及Ⅰ型胶原表达的影响以及大黄素对AngⅡ作用于KFB的保护效应。结果 ①AngⅡ 10 -10 mol/L至 10 -6mol/L增加KFB3 H TdR掺入率 ,第 1、3天呈计量依赖关系 (r1=0 .70 9,P <0 .0 1;r3 =0 .80 6,P <0 .0 1) ;不同浓度的大黄素 (3 0～ 10 0 μg/ml)第 1、3和 5抑制了AngⅡ 10 -6mol/L诱导的KFB3 H TdR掺入率 ,呈剂量依赖性特点 (r = 0 .890 , 0 .947和 -0 .891;P <0 .0 1) ;而且大黄素本身也可抑制KFB3 H TdR掺入率 ,呈剂量依赖性特点。②AngⅡ在 10 -6mol/L明显促进KFBG1向S期转化 (P <0 .0 1) ;大黄素在 10 0 μg/ml抑制了KFBG1向S期转化 (P <0 .0 1)。③AngⅡ在 10 -6mol/L增加了KFBⅠ型胶原表达 (P <0 .0 5 ) ,大黄素明显降低了AngⅡ诱导的Ⅰ型胶原表达 (P <0 .0 5 )。结论 大黄素可抑制AngⅡ诱导的KFB增殖 ,Ⅰ型胶原表达 。

三七总皂苷对人肾成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原及转化生长因子-β_1的影响

目的探讨三七总皂苷(PNS)对人肾成纤维细胞(KFB)分泌Ⅰ型胶原及转化生长因子-β1的影响。方法体外培养人肾成纤维细胞(KFB)。传代培养后选取第3～4代细胞,分为对照组(不含PNS)和PNS1组(含PNS400μg/mL)、PNS2组(含PNS 600μg/mL)和PNS3组(含PNS 800μg/mL),分别于作用24h、48h后采取ELISA法测定各组培养液中Ⅰ型胶原及人转化生长因子-β1(TGF-β1)的含量,对检测数据进行对比分析。结果作用24h后,对照组Ⅰ型胶原分泌量与PNS各组相比均无显著性差异(P>0.05),但对照组TGF-β1分泌量与PNS2组和PNS3组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。作用48h后,对照组Ⅰ型胶原分泌量与PNS2组和PNS3组相比差异具有统计学意义(P<0.05),对照组TGF-β1分泌量与PNS1组、PNS2组和PNS3组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PNS可明显抑制人肾成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原及转化生长因子-β1,且此种抑制效应存在剂量-效应关系,显示PNS可能对肾间质纤维化具有一定的抑制作用。

血管紧张素Ⅱ对人肾成纤维细胞的影响

目的 :观察血管紧张素Ⅱ (AngⅡ )对人肾成纤维细胞 (KFB)的影响。 方法 :采用ELISA法、四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法、流式细胞仪、免疫组织化学法分别检测AngⅡ对KFB分泌的胶原酶活性、KFB增生、凋亡、Ⅰ型胶原表达的影响。 结果 :AngⅡ能提高KFB分泌的总胶原酶活性、促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFBⅠ型胶原的表达。 结论 :AngⅡ能通过促进KFB增生、抑制KFB凋亡、促进KFBⅠ型胶原的表达来促进肾间质纤维化。

高糖环境HGF和TGF-β表达对肾成纤维细胞周期的影响

目的探讨HGF和TGF-β对高糖作用下的肾间质成纤维细胞周期的影响,以及作用机理。方法取肾肿瘤切除的正常极肾脏组织,贴壁法培养肾间质成纤维细胞。细胞分别培养于不同的葡萄糖培养液中,另设相同渗透压的甘露醇组。采用流式细胞仪检测细胞周期,MTT方法检测细胞增殖,RT-PCR方法对细胞表达HGF和TGF-β进行检测。结果 高浓度葡萄糖作用早期,细胞增殖旺盛,然而随着高糖的持续刺激,细胞增殖发生停滞,同时诱导细胞发生肥大反应。同时观察到高糖作用的早期HGF表达升高,随着作用的持续时间延长,其表达量下降,而TGF-β出现持续的高表达,同时外源加入HGF可以抑制TGF-β的表达。结论高糖作用下的肾间质成纤维细胞早期出现自限性增殖后细胞增殖停滞,出现肥大。这与HGF和TGF-β的表达差异相关。

血管紧张素Ⅱ对肾成纤维细胞增殖及分泌白细胞介素-6的影响

目的 研究血管紧张素 (Ang) 对人肾成纤维细胞 (KFB)增殖及分泌白细胞介素 (IL ) - 6的影响 ,为完善 Ang 致肾纤维化机理提供新的实验依据。方法 分离培养人胎肾成纤维细胞 ,经鉴定后分别采用MTT法和放射免疫分析法 (RIA )检测 Ang 对 KFB增殖及分泌 IL - 6的影响。结果 10 - 6 mol/ L Ang 作用于人KFB后 48及 72小时 ,可明显促进细胞增殖 ;无 Ang 刺激时 ,体外培养的正常人 KFB可分泌微量的 IL - 6,且呈时间依赖性 ,10 - 7～ 10 - 6 mol/ L Ang 作用于细胞 6小时 ,即可迅速而显著地刺激细胞分泌 IL - 6,10 - 6 mol/ L Ang 作用 2 4～ 48小时 ,均可显著增加细胞 IL - 6的分泌。结论 不同浓度的 Ang (10 - 7～ 10 - 6 mol/ L )作用于人 KFB后 ,可促进细胞增殖 ,提高细胞对 IL - 6的分泌量。推测这可能是在各种肾脏疾病进展时 ,Ang 参与肾小管间质病变、促进肾纤维化的机制之一。

血管紧张素II对人肾成纤维细胞增殖的影响

目的 观察血管紧张素 (AgII)对培养的人肾间质成纤维细胞 (HRIF )增殖的影响。方法 分离培养的HRIF经鉴定后 ,利用3 H -TDR掺入法 ,流式细胞仪及免疫组织化学技术观察了AgII对HRIFDNA合成、细胞周期的影响。结果 ①AgII 10 -10 M至 10 -6M均增加了HRIF3 H -TDR掺入率 ,第 1、3天呈剂量依赖关系(γ1=0 .70 9,P <0 .0 10 ;γ3 =0 .80 6 ,P <0 .0 10 )。②AgII(10 -8M至 10 -5M)明显促进了HRIFG1期向S期转化 (P<0 .0 1)。结论 AgII能够直接诱导HRIF细胞的增殖。

骨形态发生蛋白-7诱导人肾成纤维细胞间质-上皮转化的研究

目的探讨骨形态发生蛋白-7(bone morphogenic protein-7,BMP-7)能否诱导人肾成纤维细胞出现间质-上皮的转化。方法原代培养获得人肾间质成纤维细胞,传至第3代用于本实验。培养液中添加1000ng/L BMP-7 72h后,观察细胞形态变化,MTT法检测细胞增殖,ELISA法测定上清Ⅰ胶原含量,Western blot分析E-cadherin和Pax2蛋白表达。结果细胞与BMP-7孵育72h后,出现细胞聚集类似小管细胞团块。与对照组相比,成纤维细胞增殖活性减低,Ⅰ型胶原分泌下降,上皮标志物E-cadherin和肾发生的标志分子Pax2表达增加。结论肾成纤维细胞至少保持部分它胚胎时的印迹和可塑性,BMP-7可诱导人肾成纤维细胞呈现间质-上皮的转化。

核转录因子κB抑制剂PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法:NRK按培养条件分为常糖组:5.6mmol/L葡萄糖;高糖A组:15mmol/L葡萄糖;高糖B组:30mmol/L葡萄糖;PDTC对照组:5.6mmol/L葡萄糖+5.0μmol/LPDTC;PDTCA组:15mmol/L葡萄糖+10μmol/LPDTC;PDTCB组:30mmol/L葡萄糖+20μmmol/LPT-DC。采用半定量RT-PCR方法及ELISA测定各组培养24h、48h后NRK的VEGF及PEDFmRNA及蛋白的表达。结果:与常糖组相比,高糖各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTC干预各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达呈下降趋势(P<0.01,P<0.05)。与常糖组相比,高糖各组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTCB组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论:PDTC能明显抑制高糖培养大鼠NRK的VEGF表达并明显上调PEDF的表达,间接提示NF-κB可能通过参与VEGF和PEDF的表达失衡导致糖尿病肾病(DN)的发生。

肾纤维化和肾成纤维细胞的起源

通过对动物模型的研究提示,上皮间质转化是脊椎动物胚胎分散细胞和损伤组织形成成纤维细胞的原因,肾小管间质纤维化的特点是细胞外多种基质成分累积引起的,如多种胶原、糖蛋白和纤维连接蛋白等,并表现为动态的过程。基质分泌细胞的来源根据潜在疾病和(或)肾纤维化的进程可能不同,分析基质分泌细胞的主要来源可能对治疗有意义。

银杏叶提取物对抑制肾成纤维细胞增殖及整合素β_1表达的作用观察

目的观察银杏叶提取物(GBE)对体外培养的人肾成纤维细胞增殖的抑制作用,以及其对肾成纤维细胞整合素β1表达的影响。方法培养、增殖人肾成纤维细胞,将其分为对照组、低剂量GBE组、中剂量GBE组和高剂量GBE组,分别采取MTT法和流式细胞仪检测技术对各组肾成纤维细胞的增殖及整合素β1的表达进行检测,对检测数据进行对比分析。结果高剂量GBE组作用2 d,低剂量GBE组、中剂量GBE组作用3 d后,成纤维细胞增殖受到明显抑制,差异具有统计学意义(与对照组相比,P<0.05);作用2 d后,低剂量GBE组、中剂量GBE组和高剂量GBE组的整合素β1平均荧光值分别为(0.312±0.028)、(0.258±0.025)、(0.193±0.112),均较对照组(0.486±0.120)明显降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论 GBE在一定浓度和作用时间下,可明显抑制人肾成纤维细胞的增殖和整合素β1的表达,进而抑制肾间质纤维化。

大黄素对人胚肾成纤维细胞产生纤溶酶原激活物抑制剂的影响

目的 :观察大黄素对人胚肾成纤维细胞 (KFB)产生纤溶酶原激活物抑制剂 (PAI) -1的影响作用机制。方法 :利用原代培养的KFB。PAI -1活性采用发色底物法测定。结果 :大黄素 10 μg/ml、2 0 μg/ml可以降低血管紧张素 (Ang)Ⅱ诱导的KFB分泌的PAI -1活性 (P <0 .0 5 )。结论 :大黄素可以降低PAI -1活性 ,增加细胞外基质 (ECM )降解 ,从而在防治肾间质纤维化中起一定的作用。

依那普利及大黄素对人肾成纤维细胞的影响

目的 观察大黄素、依那普利对人肾成纤维细胞产生纤维连接蛋白(FN)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)的影响。方法 利用原代培养的人肾成纤维细胞。FN含量和PAI-1活性分别采用ELISA法和发色底物法。结果 依那普利及不同浓度的大黄素可以抑制血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的肾成纤维细胞分泌FN和PAI-1活性增高。结论 依那普利及大黄素可能通过抑制PAI-1活性,增加FN降解,从而在防治肾间质纤维化中起一定的作用。

缺氧和高糖对大鼠肾成纤维细胞ICAM-1mRNA表达的影响

目的:探讨缺氧和高糖对肾成纤维细胞(NRK)细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表达的影响。方法:将大鼠NRK分6组进行体外培养:(1)正常浓度葡萄糖组(常糖组):5.6mmol/L葡萄糖;(2)常糖+缺氧组:5.6mmol/L的葡萄糖+100μmol/L的CoCl2;(3)高糖A组:15mmol/L葡萄糖;(4)高糖+缺氧A组:15mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl2;(5)高糖B组:30mmol/L葡萄糖;(6)高糖+缺氧B组:30mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl2。分别于24h、48h取各组NRK采用RT-PCR检测ICAM-1mRNA表达水平。结果:与常糖组相比,高糖A组,高糖B组ICAM-1mRNA表达量逐渐升高(P<0.01),常糖+缺氧组、高糖+缺氧A、B组ICAM-1mRNA表达量也升高(P<0.01);高糖+缺氧A、B组ICAM-1mRNA表达量分别比高糖A、B组明显升高(P<0.01);高糖A、B组和常糖+缺氧组、高糖+缺氧A、B组48hICAM-1mRNA表达量均高于24h表达量(P<0.01)。结论:高糖和缺氧均可导致ICAM-1mRNA高表达,缺氧可能进一步增加高糖上调ICAM-1的表达。

补肾生血颗粒剂对共培养的肾小管上皮细胞和肾成纤维细胞产生细胞外基质的影响

目的观察补肾生血颗粒剂对肾小管上皮细胞和肾成纤维细胞共培养体系产生细胞外基质的影响,并探讨其机理。方法采用血清药理学方法,细胞生物学方法研究共培养的成纤维细胞的增殖及凋亡;用 ELISA 法测定肾小管上皮细胞和肾成纤维细胞共培养体系中细胞外基质的含量。结果补肾生血颗粒剂各剂量组能明显抑制共培养的成纤维细胞增殖,促进其凋亡,减少共培养体系中纤维连接蛋白(FN)、Ⅳ型胶原的含量。结论补肾生血颗粒剂能明显减少肾小管上皮细胞和肾成纤维细胞共培养体系中细胞外基质的含量,其机制可能与抑制成纤维细胞增殖,促进其凋亡有关。

PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞中MCP-1表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法:将NRK分4组进行体外培养:(1)正常组:5.6mmol/L的葡萄糖;(2)高糖组:30mmol/L葡萄糖;(3)高糖+PDTC1组:30mmo/L葡萄糖+5μmol/LPDTC;(4)高糖+PDTC2组:30mmo/L葡萄糖+10μmol/LPDTC,分别于培养24h、48h取各组NRK采用RT-PCR检测其MCP-1mRNA表达水平,采用WesternBlot检测MCP-1蛋白表达水平。结果:与正常组相比,高糖组MCP-1mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),不同浓度PDTC干预后,MCP-1mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.05),且随PDTC浓度增大,下降更明显。结论:高糖可使NRK中MCP-1表达增高,PDTC能抑制NRK中MCP-1表达。

血小板衍化生长因子DD刺激大鼠肾成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞的转化

背景:血小板衍化生长因子可诱导肾小球系膜细胞及肾间质多种细胞增殖、迁移、转化及细胞外基质的过表达。目的:观察血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路激活对大鼠肾成纤维细胞细胞增殖及α-平滑肌肌动蛋白表达的影响。方法:体外培养正常大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F),按照血小板衍化生长因子DD刺激质量浓度分为对照组、1μg/L组、10μg/L组、50μg/L组、100μg/L组,然后根据50μg/L血小板衍化生长因子DD刺激不同时间分为对照组、12 h组、24 h组、48 h组。CCK8检测不同血小板衍化生长因子DD质量浓度及血小板衍化生长因子DD作用不同时间对NRK-49F增殖的影响;Real-time PCR检测各质量浓度组血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白m RNA变化;Western blot检测各浓度组血小板衍化生长因子βR、α-平滑肌肌动蛋白蛋白表达变化。结果与结论:与对照组相比,血小板衍化生长因子DD可明显刺激NRK-49F细胞增殖,呈现剂量依赖性及时间依赖性。血小板衍化生长因子DD可剂量依赖性刺激其相应血小板衍化生长因子βR及α-平滑肌肌动蛋白在m RNA水平及蛋白水平上的表达增加。提示血小板衍化生长因子DD/血小板衍化生长因子βR信号通路的激活可显著刺激NRK-49F细胞的增殖及向肌成纤维细胞的转化。