重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中表达和纯化方法的研究

目的 确定重组大鼠肾胆绿素还原酶在大肠杆菌中的表达条件及纯化方法。方法 将已构建的大鼠肾胆绿素还原酶 (BVR)的重组质粒pMW172a -BVR转入大肠杆菌BL - 2 1,分析不同温度、摇床转速对BVR表达的影响 ,确定可溶性表达最佳条件。使用超速离心、盐析、层析的方法纯化BVR。检测酶活性。结果 确定了BVR可溶性表达最佳条件为 37℃ (12 0± 5 )r/min ;确定了BVR具体纯化路线。所得蛋白纯度为 92 2 %、纯化倍数为 4 3倍、回收率为 19 8%的活性BVR蛋白。结论 获得了纯度高、具有活性的BVR蛋白 ,可作为工具酶用于某些相关酶的研究 。

大鼠肾胆绿素还原酶cDNA克隆、表达及鉴定

目的克隆大鼠肾胆绿素还原酶(BVR)的cDNA序列后在大肠杆菌中表达、纯化并进行鉴定。方法采用RT-PCR方法利用设计合成的一对特异性引物从大鼠肾组织扩增BVR的cDNA序列,构建pMW172a-BVR重组质粒,转化扩增后进行序列测定,证实同GenBank[053850]公布的大鼠肾BVR的cD-NA序列相同后,阳性重组质粒转化到E.coli BL21(DE3)中表达并进行纯化。结果 SDS-PAGE鉴定其分子量为33 ku,分光光度仪检测具有催化胆绿素还原为胆红素的活性,证实为胆绿素还原酶。实验还测定了Km值,以NADH和NADPH分别作供氢体,测得Km值分别是380μmol/L、3.5μmol/L。结论 通过克隆表达获得了有活性的大鼠BVR酶蛋白,为进一步研究BVR的性质及功能奠定了基础,也为血红素加氧酶的研究提供了便利条件。