肾脑蛋白介导的突触可塑性下降在慢性脑低灌注认知功能障碍中的作用及机制

目的探讨肾脑蛋白(kidney brain protein, KIBRA)下调在慢性脑低灌注所致认知功能障碍中的作用和机制。方法 90只雄性SPF Sprague Dawley (SD)大鼠, 按照随机数字表法分为四组:假手术组(n=15)、慢性脑低灌注组(2VO组, n=25)、慢性脑低灌注脑立体定位注射AAV-KIBRA组(2VO+AAV-KIBRA组, n=25)、慢性脑低灌注脑立体定位AAV-vector组(2VO+AAV-vector组, n=25)。采用双侧结扎颈总动脉方法建立慢性脑低灌注模型, 脑立体定位注射2 μL AAV-KIBRA或AAV-vector, 观察30 d。利用Morris水迷宫、离体电生理、p21激活的蛋白激酶3(p21-activated kinase 3, PAK3)酶活性检测、蛋白印迹、免疫共沉淀和Golgi染色方法, 分别检测大鼠的空间学习记忆能力、长时程增强(long-term potentiation, LTP)、KIBRA水平表达、PAK3酶活性的变化, 并观察树突棘的分布。用SPSS 16.0统计软件分析实验数据, 采用单因素方差分析(one-way ANOVA)比较各组间差异, 采用LSD检验进行两组间数据差异显著性比较, 方差不齐则采用Welch检验。结果大鼠慢性脑低灌注1月后, 取大鼠海马进行匀浆和蛋白印迹检测KIBRA水平, 发现2VO组KIBRA水平较假手术组明显下降[(73.49±4.12)%](P<0.01), 海马CA1区注射AAV-KIBRA显著上调KIBRA水平[(91.91±7.01)%](P<0.01)。Morris水迷宫检测发现:2VO组大鼠在7 d的平台位置学习训练中的潜伏期[第3~7天学习结果:(48.18±2.82)s、(43.45±2.27)s、(32.27±2.22)s、(26.55±2.37)s、(17.18±2.67)s]显著长于假手术组[(41.67±2.74)s、(32.58±2.57)s、(22.50±2.94)s、(16.91±2.39)s、(8.75±1.52)s](均P<0.05), 2VO+AAV-KIBRA组在7 d的平台位置学习潜伏期[第3~7天分别为:(43.83±2.95)s、(35.25±2.15)s、(26.58±2.03)s、(19.92±2.17)s、(17.75±1.35)s]显著短于2VO组(均P< 0.01)。撤除平台的Morris水迷宫检测, 短期记忆结果显示2VO组大鼠达到平台区域的潜伏期显著长于假手术组, 而2VO+AAV-KIBRA组大鼠到达平台潜伏期显著短于2VO组(P<0.01)。同时2VO大鼠的平台区域滞留时间和穿梭次数均少于假手术组(P<0.01), 而2VO+AAV-KIBRA组的平台区域滞留时间和穿梭次数则显著多于2VO组(P<0.01)。离体脑片电生理记录显示:高频刺激后, 2VO组相对兴奋性突触后场电位(1.43±7.43)显著低于假手术组(2.21±6.54), 而2VO+AAV-KIBRA组相对兴奋性突触后场电位(1.90±8.15)高于2VO组(P<0.01)。大鼠海马组织进行免疫共沉淀发现沉淀KIBRA时, 蛋白免疫印迹实验可以检测到PAK3。PAK3酶活性检测结果显示:2VO海马组织PAK3的相对酶活性(0.64±0.04)显著低于假手术组(1.02±0.07), 而2VO+AAV-KIBRA组PAK3的相对酶活性(0.86±0.03)显著高于2VO组。Golgi染色显示:2VO海马神经元树突棘密度[(6.85±0.43)个/10 μm]显著低于假手术组[(11.83±0.58)个/10 μm], 而2VO+AAV-KIBRA组神经元树突棘密度[(10.22±0.39)个/10 μm]显著高于2VO组。结论慢性脑低灌注后KIBRA下降在认知功能障碍中发挥重要作用, 与突触功能可塑性下降有关, KIBRA下调通过调控PAK3活性而参与树突的结构可塑性。因此, KIBRA可能是防治慢性脑低灌注认知功能的重要靶点。

肾脑表达蛋白过表达载体对于β-淀粉样蛋白诱导神经细胞凋亡的作用机制

目的探究肾脑表达蛋白(KIBRA)过表达载体对于β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导神经细胞凋亡的作用机制。方法本研究以原代海马神经细胞为研究对象,利用20μmol/L Aβ25-35诱导,构建体外稳定的AD细胞模型,利用siRNA技术构建KIBRA过表达载体,由慢病毒载体转染AD细胞模型,按照处理方法将AD细胞模型分成3组,即空白对照组、阴性对照组和过表达载体组。利用RT-PCR和Western blot检测KIBRA、Caspase-3以及Caspase-9的表达水平,利用AV-PI试剂盒检测细胞凋亡。结果 AD细胞模型中,可见细胞核汇聚,细胞形态不规则,触角形成。慢病毒滴度的检测结果显示KIBRA慢病毒过表达载体慢病毒转染滴度为7×106TU/ml。空白对照组、阴性对照组和过表达载体组的KIBRA的mRNA的相对表达量比较差异有统计学意义(F=9. 068,P <0. 05),过表达载体组的KIBRA的mRNA的相对表达量高于空白对照组和阴性对照组(q值分别为2. 021、2. 981,P <0. 05)。过表达载体组的Caspase-3、Caspase-9的mRNA的相对表达量低于空白对照组和阴性对照组(P <0. 05)。Western blot结果与RT-PCR表达趋势相同。AV-PI结果显示,过表达载体组的细胞总凋亡率低于空白对照组和阴性对照组(q值分别为2. 551、3. 003,P <0. 05)。结论 KIBRA的过表达载体可以抑制AD细胞模型的凋亡,可以作为阿尔茨海默病的潜在治疗靶点。