miR-181a在肾透明细胞癌中的表达及对肾透明细胞癌细胞786-O功能的影响

目的探讨miR-181a在肾透明细胞癌中的表达及miR-181a对肾透明细胞癌细胞系786-O功能的影响。方法通过q RT-PCR的方法检测miR-181a在42对肾透明细胞癌肿瘤及瘤旁组织和细胞系786-O、769-P、A498、Caki-1中的表达水平;以miR-181a mimics、miR-181a inhibitor转染786-O细胞系,通过MTS实验观察其增殖能力的改变,并通过流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的变化。结果 miR-181a在肾透明细胞癌中的表达明显高于瘤旁组织,同时其在细胞系786-O、769-P、A498、Caki-1中的表达明显高于其在人肾小管上皮细胞HKC中的表达。在786-O细胞系中,转染miR-181a mimics可以明显促进其增殖,诱导G1/S期转换并抑制凋亡;而miR-181a inhibitor则抑制增殖,诱导G1期阻滞并促进凋亡。结论 miR-181a在肾透明细胞癌中高表达并参与肿瘤的发生和发展,提示miR-181a可能成为肾癌治疗的潜在靶点。

EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞EphA2和ERK表达影响的研究

目的:探讨EphrinA1-Fc对人肾透明细胞癌786-O细胞系促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(EphA2)和细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化程度的影响。方法:应用可溶性配体EphrinA1-Fc干预人肾透明细胞癌786-O细胞系,采用Wstern blot方法分析不同时间点细胞内EphA2和ERK1/2的磷酸化程度。结果:EphrinA1-Fc干预5、10、30、60 min后,p-EphA2、p-ERK的相对表达量逐渐增加(F=9.392,P=0.025;F=4.428,P=0.041),p-EphA2、p-ERK在EphrinA1-Fc干预前均未见表达。结论:Eph rinA1-Fc抑制肿瘤转移复发的可能机制之一是其促使肾透明细胞癌786-O细胞EphA2磷酸化而导致其降解实现。

miR-19a-3p靶向细胞黏附分子2阻断AKT通路抑制肾癌细胞786-O的增殖和迁移

目的:探讨肾癌组织高表达的miR-19a-3p靶向调控细胞黏附分子2(cell adhesion molecule 2,CADM2)并通过AKT信号通路影响肾癌细胞增殖和迁移的机制。方法:收集2012年4月至2017年11月苏州大学附属第一医院肾内科收治的42例资料完整的肾癌患者手术切除的肾癌组织和癌旁组织标本。采用qPCR检测肾癌组织和786-O等4种肾癌细胞系中mi R-19a-3p的表达水平,CCK-8、Transwell和免疫荧光法检测miR-19a-3p敲减对肾癌786-O细胞增殖、侵袭和上皮间质转化的影响,双荧光素酶报告基因验证miR-19a-3p与CADM2的靶向关系。采用Wb检测miR-19a-3p通过CADM2对AKT信号通路的调控作用。结果:miR-19a-3p在肾癌组织及细胞系中均高表达(均P<0.01)。敲减miR-19a-3p可显著抑制786-O细胞增殖、迁移和上皮间质转化,且miR-19a-3p靶向作用CADM2并下调其表达水平(P<0.05或P<0.01)。敲减miR-19a-3p通过靶向上调CADM2并阻断AKT信号通路进而显著抑制786-O细胞增殖、迁移和上皮间质转化(均P<0.05或P<0.01),从而缓解肾癌发生发展。结论:肾癌组织中miR-19a-3p高表达,敲减miR-19a-3p可显著抑制肾癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化,其机制可能是通过miR-19a-3p/CADM2/AKT分子轴起作用。

锌指蛋白28对肾透明细胞癌细胞增殖、代谢、运动的影响及其机制

目的:探讨锌指蛋白28(ZFP28)对肾透明细胞癌(ccRCC)细胞增殖、代谢、运动的影响及其机制。方法:采用免疫印迹和qPCR检测786-O和HK-2细胞中ZFP28的表达。CCK-8实验、集落形成实验、Edu实验、ATP合成实验、葡萄糖摄取实验、流式细胞术检测细胞的增殖及代谢能力;免疫印迹实验显示ZFP28对AKT/mTOR通路的影响;Transwell实验揭示ZFP28对细胞迁移与侵袭的影响。结果:ZFP28在ccRCC细胞786-O中与正常肾近端小管的上皮细胞系HK-2相比高表达(P<0.05)。通过siRNA导致的ZFP28下调抑制786-O细胞的生长与集落形成、ATP合成和葡萄糖摄取,并抑制786-O细胞的迁移及侵袭(P<0.05)。ZFP28下调抑制786-O细胞的AKT/mTOR通路(P<0.05)。结论:ZFP28通过AKT/mTOR轴抑制ccRCC细胞的生长、代谢和运动,可作为ccRCC治疗的潜在靶点。

lncRNA LUCAT1通过靶向调控miR-199a-5p/HIF-1α促进肾透明细胞癌786-O细胞的增殖和迁移

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)肺癌相关转录物1(lung cancer associated transcript 1,LUCAT1)对肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)786-O细胞的增殖和迁移能力的影响及其作用机制。方法:选取2013年6月至2017年6月宜昌市第一人民医院泌尿外科行手术切除的40例ccRCC患者癌组织及相应的癌旁组织样本,组织均经病理检查诊断明确。ccRCC细胞株786-O、ACHN、UM-RC-2及正常肾上皮细胞系KiMA培养完成后,用qPCR法检测cc RCC组织和细胞株中miR-199-a-5p、HIF-1α和LUCAT1T mRNA的表达,用CCK-8实验检测786-O细胞的增殖能力,Transwell法检测786-O细胞的迁移能力,双荧光素酶报告基因实验验证LUCAT1与miR-199a-5p的靶向作用关系,Western blotting实验检测LUCAT1、miR-199a-5p对HIF-1α蛋白表达的影响。结果:LUCAT1在ccRCC组织和细胞系786-O、ACHN和UM-RC-2中呈高表达(均P<0.01),敲低LUCAT1后可明显抑制786-O细胞的增殖和迁移(均P<0.01)。miR-199a-5p在ccRCC组织和细胞系中呈低表达(均P<0.01),StarBase数据库分析结果显示LUCAT1含有miR-199a-5p的保守目标位点,miR-199a-5p对LUCAT1-Wt的报告活性具有明显的抑制作用(P<0.01);敲低LUCAT1可明显降低miR-199a-5p的表达(P<0.01)。LUCAT1在转染miR-199a-5p模拟物的786-O细胞中呈低表达,但在LUCAT1+miR-199a-5p模拟物共转染的786-O细胞中出现逆转(P<0.05或P<0.01)。转染miR-199a-5p模拟物的786-O细胞中HIF-1αmRNA和蛋白表达水平升高,而LUCAT1过表达可逆转该效应(P<0.05或P<0.01)。转染miR-199a-5p模拟物抑制786-O细胞的增殖和迁移,而转染LUCAT1可部分消除转染miR-199a-5p模拟物对786-O细胞增殖和迁移的影响(P<0.05或P<0.01)。结论:lncRNA LUCAT1通过靶向调节miR-199a-5p/HIF-1α的表达从而在ccRCC中发挥促癌效应。

Survivin在肾透明细胞癌786-O细胞株中表达的实验研究

目的:检测抗凋亡基因survivin在肾透明细胞癌786-O细胞株中的表达并探讨其临床意义。方法:运用MTT(四唑盐比色)法检测细胞生长状态并绘制生长曲线,运用RT-PCR(逆转录聚合酶链反应)法和免疫组化法检测786-O细胞株中survivin mRNA及survivin蛋白的表达情况。结果:检测出786-O细胞株中有survivin mRNA的表达,survivin蛋白的表达亦呈阳性,而正常肾细胞无阳性表达。结论:survivin mRNA及survivin蛋白在肾透明细胞癌中均有明显的表达,利用这一表达特异性,为以survivin基因为靶点的肾癌基因治疗研究提供了实验依据。

Survivin基因及蛋白表达与人786-0肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡的相关性研究

目的研究Survivin基因及蛋白表达与人786-0肾透明癌细胞增殖和凋亡的相关性。方法人肾癌细胞系786-0作为Survivin转染组,肾小管上皮细胞系HK-2作为阴性对照组,分别用Survivin模拟物转染;转染72 h后测定Survivin基因及蛋白表达;对比两组细胞吸光值、细胞数及凋亡细胞比值;对Survivin基因和蛋白表达水平与细胞吸光值、细胞数和凋亡细胞比值进行Pearson相关性分析。结果转染后,Survivin转染组Survivin mRNA、Survivin蛋白表达水平显著高于阴性对照组(P<0.05);吸光值从第1 d开始显著低于阴性对照组(P<0.05);细胞数从第2d开始显著少于阴性对照组(P<0.05)。786-0细胞的凋亡比例从第1d开始显著低于阴性对照组(P<0.05)。Pearson相关性分析结果显示,Survivin基因和蛋白表达水平与吸光值和细胞数呈负相关,与凋亡细胞比值呈正相关。结论 Survivin基因和蛋白表达可以抑制786-0肾透明癌细胞增殖,促进细胞凋亡。

BMI1小分子抑制剂PTC-209对人肾癌细胞786-O干细胞的干性抑制作用

目的观察PTC-209对人肾癌细胞786-O干细胞的干性抑制作用。方法用成球实验培养786-O干细胞,用Western blot法检测BMI1蛋白的表达水平。用对照载体和PTC-209处理786-O细胞,记录786-O细胞的成球效率和侵袭能力。建立裸鼠人786-O肾癌移植瘤模型,实验分为对照组和PTC-209干预组。测量皮下移植瘤体积并记录肿瘤生长情况。结果 Western blot结果显示BMI1蛋白表达水平在肾癌干细胞的表达与对照组相比,PTC-209能显著抑制786-O细胞的成球能力较强(17.6±6.0 vs.6.1±2.5,P<0.05),对照组侵袭的细胞,高于PTC-209干预组(116.5±10.7)个vs.(32.3±4.8)个(P<0.05),PTC-209干预组在裸鼠体内786-O细胞成瘤速度及瘤体生长速度均较对照组慢。结论 BMI1参与786-O肾癌干细胞的干性调节与移植肿瘤的生长。

腺病毒重组人白细胞介素24对肾癌细胞株786-O细胞生长和凋亡的影响

目的探讨腺病毒重组人白细胞介素24(IL-24)对肾癌细胞株786-O细胞的生长和凋亡的影响。方法将培养的肾癌细胞株786-O细胞随机分为空白对照组、阴性对照组(转染腺病毒重组人IL-24对照组)及实验组(转染腺病毒重组人IL-24组)。取对数生长期肾癌细胞株786-O,构建腺病毒重组人IL-24及对照并转染至肾癌细胞株786-O实验组细胞及阴性对照组细胞。使用四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测肾癌细胞株786-O生长能力;采用流式细胞术检测肾癌细胞株786-O凋亡情况;应用Western Blot检测肾癌细胞株786-O中MMP-9蛋白的表达水平。结果实验组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞表面磷脂酰丝氨酸表达水平高于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组肾癌细胞株786-O细胞中MMP-9蛋白表达水平低于空白对照组和阴性对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。空白对照组与阴性对照组肾癌细胞株786-O细胞增殖能力、细胞膜表面磷脂酰丝氨酸表达水平、MMP-9蛋白表达水平比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论转染腺病毒重组人IL-24可抑制肾癌细胞株786-O细胞的生长并诱导细胞凋亡,腺病毒重组人IL-24可能通过下调MMP-9诱导肾癌细胞株786-O细胞的凋亡。

肾癌细胞系SN12C和786-O无血清培养的干细胞球特性的比较

目的:本研究通过比较SN12C和786-O两株肾癌细胞系中肿瘤干细胞特征的差异性,初步探讨筛选肾癌干细胞更有效的方法。方法:以无血清培养法培养SN12C和786-O细胞,比较其在不同时间形成肿瘤干细胞球的差异;应用流式细胞术分析SN12C和786-O球体细胞中干细胞标志物的表达情况;利用裸鼠体内成瘤模型检测SN12C和786-O球体细胞成瘤能力。结果:SN12C较786-O更易形成肿瘤干细胞球且所需时间更短,即786-O在无血清培养的第7天开始形成规则的球体,而SN12C则在第5天就已形成规则的球体。SN12C和786-O球体细胞中干细胞指标表达量亦有显著性差异,在SN12C球体细胞中CD133、CD44、Nanog和Oct3/4比例明显高于786-O球体细胞,差异具有统计学意义(P<0.05)。裸鼠体内的成瘤能力实验发现SN12C明显强于786-O球体细胞。结论:SN12C肾癌细胞系通过无血清培养方法富集肿瘤干细胞球明显多于786-O,是获得肿瘤干细胞较好的研究对象。

华蟾素抑制肾癌细胞786-O增殖及促凋亡作用研究

目的研究华蟾素(cinobufotalin)对人肾癌细胞786-O增殖的抑制作用及凋亡的促进作用,并对其作用机制进行探讨。方法将体外培养的肾癌细胞786-O分为对照组、1 mg/mL华蟾素组、10 mg/mL华蟾素组、100 mg/mL华蟾素组,分别给予正常培养液、1 mg/mL华蟾素、10 mg/mL华蟾素、100 mg/mL华蟾素处理,观察并计算细胞增殖抑制率,采用流式细胞仪测定细胞凋亡率,采用Hoechst-PI核染色法观察细胞核凋亡情况,采用Western blot法检测Survivin蛋白表达。结果华蟾素对肾癌细胞786-O增殖率的抑制作用随浓度的升高逐渐增强,且呈时间依赖性;流式细胞术及Hoechst-PI核染色法的检测结果表明,随着华蟾素作用浓度的递增,肾癌细胞786-O凋亡率呈剂量依赖性递增;Western blot结果显示,华蟾素抑制肾癌细胞786-O中Survivin蛋白的表达。结论华蟾素可通过降低肾癌细胞786-O中Survivin蛋白的表达,起到抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。

人肾透明细胞腺癌786-O细胞株的传代培养及其生物学特性初探

目的探讨人肾透明细胞腺癌786-O细胞株体外培养的生长特性,为进一步的实验研究积累经验。方法将786-O细胞株于体外培养,进行传代、冻存、复苏和细胞计数等操作,并绘制细胞生长曲线。结果786-O细胞株在体外被成功培养,生长较快,每3天传代1次。细胞生长曲线呈S形,分为潜伏期、对数生长期和停滞期,细胞倍增时间大约36 h。结论786-O细胞株能在体外稳定地传代培养。

融合PE38的抗CD70纳米抗体免疫毒素的制备及其对肾透明细胞癌786-O细胞的杀伤作用

目的:构建靶向CD70分子的重组免疫毒素,通过表达、纯化制备PE38与抗CD70纳米抗体重组蛋白,体外抗肿瘤实验探究重组蛋白是否对高表达CD70分子的阳性肿瘤细胞具有杀伤活性。方法:通过基因工程手段,将CD70纳米抗体Nb 2B3基因片段通过一个连接子与pET21a-PE38基因片段相连,获得重组表达载体pET21a-Nb 2B3-PE38并转入BL21(DE3)感受态细胞中进行表达、纯化与鉴定。用间接ELISA及FACS法检测Nb 2B3-PE38与CD70分子的结合活性,MTT法检测Nb 2B3-PE38对高表达CD70分子的肾透明细胞癌786-O细胞的体外杀伤活性,AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测Nb 2B3-PE38对786-O细胞凋亡的影响。结果:成功构建抗CD70纳米抗体重组免疫毒素Nb 2B3-PE38,纯化获得纯度>90%的重组蛋白,SDS-PAGE及WB检测结果表明目的蛋白正确表达,分子量为56000。纯化后的Nb 2B3-PE38能与重组CD70抗原及786-O细胞表面的CD70分子特异性结合;25μg/mL Nb 2B3-PE38即对786-O细胞产生极显著的杀伤作用(P<0.001),并且促进786-O细胞的细胞凋亡(P<0.01),其杀伤效应强于阳性对照顺铂(P<0.01)。结论:成功制备了特异性靶向CD70分子的免疫毒素Nb 2B3-PE38,其能够有效杀伤786-O细胞并诱导细胞凋亡且效果强于顺铂。

慢病毒介导的Clusterin基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

【目的】应用慢病毒介导的RNA干扰技术,检测clusterin(CLU)基因沉默在人肾癌786-O细胞的干扰效果及其对人肾癌786-O细胞增殖、迁移和凋亡的影响。【方法】构建靶向CLU基因的慢病毒干扰载体,利用包装细胞293T获得重组慢病毒,感染人肾癌786-O细胞株。实验分5组:CLU-RNAi-LV1(KD1)、CLU-RNAi-LV2(KD2)、CLU-RNAi-LV3(KD3)为加入靶向CLU基因的慢病毒感染的肾癌细胞组,未处理的慢病毒感染的肾癌细胞组(NC组),肾癌786-O细胞为空白对照组(CON组)。应用Real time-PCR及Western blot检测不同组别干扰前后CLU mRNA及蛋白表达的变化。用细胞划痕实验、MST-1、流式细胞仪等方法检测CLU沉默后肾癌786-O细胞在增殖、迁移、凋亡等生物学行为的改变。【结果】成功构建CLU shRNA慢病毒载体clu-RNAi-LV并获得相应慢病毒。Real time-PCR显示不同感染复数CLU-RNAi-LV处理的KD1、KD2、KD3组CLU mRNA表达水平与对照组相比分别下调69.4%～96.5%和0。Western blot结果显示KD1、KD2、KD3组CLU蛋白表达水平与CON组相比分别下降35.24%、46.26%和58.91%,KD3能显著抑制786-O细胞中CLU基因的表达。划痕实验显示24 h时KD3(si-CLU)组细胞迁移相对距离(408.43±25.92)小于NC组(101.35±6.05)和CON组(68.13±6.64,P<0.05)。WST-1法检测转染后72 h KD3(si-CLU)组细胞生长速度较NC组及CON组明显下降(P<0.05),各组间差异(P<0.05),均有统计学意义。流式细胞仪检测KD3(si-CLU)组与NC组、CON组细胞凋亡率分别为(6.23±2.51)%、(1.05±0.30)%和(1.17±0.29)%,KD3(si-CLU)组与NC组、CON组相比凋亡率增加(P<0.05),差异有统计学意义。肾癌786-O细胞的增殖、迁移受到抑制,而凋亡率增加。【结论】筛选出能稳定干扰CLU基因表达的siRNA序列和肾癌786-O细胞株。CLU慢病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性CLU基因,抑制肾癌786-O细胞的增殖、迁移并促进细胞凋亡。

CLU基因干扰肾癌786-O细胞差异基因表达的研究

目的:观察CLU基因干扰前后肾癌细胞株786-O的基因表达谱差异,探讨肾细胞癌与CLU基因相关基因及传导通路。方法:CLU基因干扰慢病毒载体及空病毒载体转染肾癌786-O细胞样本与RocheNimbleGen表达谱芯片杂交,比较干扰前后基因表达谱差异,并行GO分析及Pathway分析。结果:六份样本中,共筛选出差异表达基因1731个,其中共同上调基因1154个,共同下调基因577个。差异表达基因中生物进程、细胞成分、分子功能方面均以下调为主。通路分析显示29条通路上调,如细胞黏附、异体排斥、吞噬体。31条通路下调,如mTOR、MAPK、非小细胞肺癌。结论:采用全基因组芯片检测CLU基因干扰后肾癌786-O基因表达谱获得差异表达基因,为以CLU基因为靶点的肾癌基因研究提供了实验依据。

腺病毒介导的Akt／mTOR基因沉默抑制肾癌786-O细胞增殖并促进细胞凋亡

目的应用腺病毒技术下调Akt／mTOR表达水平，检测Akt／mTOR基因沉默对人肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响。方法收集人肾癌及癌旁样品，RealtimePCR检测两组样品中Akt和mTOR的mRNA水平。利用病毒包装细胞293A获得靶向Akt／mTOR基因的重组腺病毒，感染人肾癌786-O细胞株。实验分2组：加人靶向Akt／mTOR基因的腺病毒感染的肾癌细胞组（rAd5-Am组），未处理的腺病毒感染的。肾癌细胞组（NC组）。应用Real timePCR及Western blot检测干扰前后Akt和mTOR mRNA及蛋白表达水平的变化。用细胞增殖及凋亡试剂盒检测Akt和mTOR沉默后，肾癌786-O细胞增殖、凋亡及PCNA表达水平的改变。结果与癌旁组织相比，Akt和mTOR的mRNA水平在肾癌组织中分别上调了2．613和3．254倍。成功获得knockdownAkt／mTOR的rAd5-Am腺病毒及对照腺病毒，感染肾癌786一O细胞。Real time PCR显示rAd5-Am组与NC组相比Akt／mTOR的mRNA水平分别下调65．3％和77．1％，Westernblot结果显示rAd5-Am组与NC组相比Akt／mTOR的蛋白表达水平分别下调78．4％和89．2％。rAd5．Am能显著降低786-O细胞中Akt／mTOR基因的表达。细胞增殖与凋亡实验表明，Akt／mTOR基因沉默后能显著抑制肾癌细胞786-O的增殖，并促进其凋亡（rAd5-Am组细胞凋亡率是NC组的2．57倍）。进一步的实验结果表明，Akt／mTOR下调后能降低PCNA的蛋白量，从而抑制。肾癌细胞的增殖。rAd5-Am感染的。肾癌786-O细胞的增殖和PCNA蛋白量受到抑制，而凋亡率增加。结论构建出能稳定干扰Akt／mTOR基因表达的。肾癌786-O细胞株。Akt／mTOR腺病毒干扰载体可有效沉默肾癌786-O细胞的内源性Akt／mTOR基因，抑制肾癌786-O细胞的增殖，下调PCNA的表达，并促进细胞凋亡。

人肾透明细胞癌中ki-67 bcl-2 bax p53表达及癌细胞自发凋亡率的临床意义

目的 探讨人肾透明细胞癌中 ki- 6 7、bcl- 2、bax、p5 3表达及癌细胞自发凋亡率的临床意义。方法 选取 4 8例档存的肾透明细胞癌石蜡包埋标本 ,采用免疫组织化学方法检测癌细胞中 ki- 6 7、bcl- 2、bax、p5 3的表达 ,采用缺口末端标记法 ( TU NEL )检测癌细胞的自发凋亡率。结果 ki- 6 7表达率 ( PI)为 0 .15 %～ 36 .4 % ,随TNM分期的增高而增高。癌细胞自发凋亡率 ( AI)为 0 .2 %～ 15 .4 % ,随 TNM分期的增高有上升趋势。各因子之间关系分析 :1高 bax表达组的癌细胞凋亡率高 ;2 p5 3阴性组的 AI高 ,bax高 ,PI低 ;3未发现 bcl- 2与其他因子间有相关关系。预后分析 :PI、AI、p5 3、bax、bcl- 2 / bax、TNM是预后因素 ,PI、p5 3是独立预后因素。结论 细胞增生状态、细胞凋亡状态以及凋亡调控因子的表达情况是影响肾透明细胞癌发生。

番茄红素通过SIRT1/NF-κB轴抑制肾癌786-O细胞增殖且促进其凋亡

目的:探讨番茄红素通过沉默信息调节因子1(SIRT1)/核因子-κB(NF-κB)轴对肾癌786-O细胞增殖、凋亡的影响。方法:常规培养人正常肾细胞HK-2和人肾癌细胞786-O,实验分为对照组(0.1%DMSO)、顺铂组(40μg/mL)、番茄红素低质量浓度(2.5μg/mL)组、番茄红素高质量浓度(5μg/mL)组、番茄红素(5μg/mL)+EX527(SIRT1抑制剂)(3μmol/L)组。CCK-8法、克隆形成实验检测各组HK-2、786-O细胞的增殖能力,流式细胞术检测各组786-O细胞的凋亡,RH123、DCFH-DA染色分别检测各组786-O细胞的线粒体膜电位(MMP)、活性氧(ROS)水平,WB法检测各组786-O细胞中凋亡相关蛋白BAX、Bcl-2、C-casp3和SIRT1/NF-κB轴相关蛋白SIRT1、p-NF-κB蛋白的表达。786-O细胞移植瘤实验检测番茄红素低(5 mg/kg)、高质量浓度(20 mg/Kg)、顺铂(2 mg/kg)、番茄红素(20 mg/kg)+EX527(10 mg/kg)对移植瘤生长的影响,TUNEL法检测各组移植瘤组织中的细胞凋亡。结果:番茄红素呈剂量依赖性地抑制786-O细胞的增殖活性,番茄红素、顺铂均明显抑制786-O细胞的克隆形成能力且促进其凋亡,细胞中MMP损伤率升高而ROS水平降低,凋亡相关蛋白BAX、C-casp3表达均显著升高(均P<0.05)而Bcl-2表达下调(P<0.05),SIRT1表达显著升高(P<0.05)而p-NF-κB的表达显著降低(P<0.05),上述作用均可被EX527逆转;番茄红素、顺铂抑制786-O细胞移植瘤的生长且促进其细胞凋亡,其作用也能被EX527逆转。结论:番茄红素通过上调SIRT1、抑制NF-κB通路的激活进而抑制786-O细胞增殖且诱导其凋亡。

敲减 LMNA 后肾癌细胞786-O的基因表达谱分析

目的研究敲减LMNA基因(编码lamin A/C)对肾癌细胞786-O的基因表达谱的影响,从而探讨LMNA在肾癌发生发展中的分子机制。方法在完全培养基RPMI 1640中培养肾癌细胞系786-O,将siRNA(siControl、siLMNA-2)转染786-O细胞,72 h后收集细胞,提取RNA,建立cDNA文库并利用Illumina测序平台进行RNA测序(RNA-seq)。测序结果经联川生物平台分析,鉴定DEGs。细胞经siControl、siLMNA-1、siLMNA-2转染后对部分基因进行实时荧光定量PCR(qPCR)验证。DEGs经Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Gnomes(KEGG)富集分析,并探讨了部分DEGs在临床样本中的表达水平与总生存期(Overall survival,OS)的相关性。结果鉴定到89个DEGs,46个上调,43个下调。GO分析表明转录调控(Regulation of transcription,DNA-templated)、肽修饰(Peptide modification)、真核生物的核糖体生物发生(Ribosome biogenesis in eukaryotes)、牛磺酸和低牛磺酸代谢(Taurine and hypotaurine metabolism)等显著富集。部分受LMNA调控的DEGs如MIEF1、UTP14C、SPIN1等基因在临床标本中较低表达,并与较差的OS相关。结论LMNA基因除了编码lamin A/C作为核纤层主要成分起着核骨架的作用外,还可能通过影响MIEF1、UTP14C、SPIN1等基因的表达,参与到肾细胞癌的发生发展过程。这些基因产物有可能为临床上LMNA扩增或高表达的病人类型,提供诊断标志和潜在的药物靶标。

中药千金子对肾癌细胞株786-0增殖作用的影响及对G250蛋白影响研究

目的 探讨中药千金子对肾癌细胞株786-0增殖作用的影响及对G250蛋白的影响研究.方法 选用肾癌细胞株786-0,分为A组（对照）、B组（5 mg/mL）、C组（10 mg/mL）、D组（20 mg/mL）,各组分别采用不同浓度千金子水溶液处理786-0细胞株.MTT比色法检测细胞增殖抑制率,Hoechst33258染色法观察细胞凋亡形态,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期变化,western blot法检测细胞Fas、Caspase3、Caspase7、G250蛋白表达水平,RT-PCR法检测细胞G250 mRNA表达水平.结果 ①各浓度千金子水溶液在24、48、72h对786-0细胞增殖抑制率较高,差异有统计学意义（P〈0.05）,且浓度越高、作用时间越长,对细胞增殖的抑制作用越强.②B、C、D组细胞核均有明显的凋亡形态学变化.③与A组比较,C、D组细胞凋亡率较高（P〈0.05）,C、D组G1期细胞比例较高（P〈0.05）,C、D组S期及G2期细胞比例较低,差异有统计学意义（P〈0.05）.④与A组比较,B、C、D组Caspase3、Caspase7蛋白表达水平较高（P〈0.05）,C、D组Fas蛋白表达水平较高,差异均有统计学意义（P〈0.05）.⑤与A组比较,B、C、D组G250 mRNA及G250蛋白表达水平较高,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 中药千金子对肾癌细胞株786-0增殖有明显的抑制作用,其机制为上调G250抗原及Fas、Caspase3、Caspase7蛋白表达,促进细胞发生G1期阻滞,引起786-0细胞凋亡.