肿瘤内皮标志物8同型物Ⅰ基因真核表达载体的构建及其在HEK293F细胞中的表达

目的:构建肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因真核表达载体,实现TEM8在HEK293F细胞中的外源表达。方法:用PCR技术扩增TEM8基因,经限制性酶切、连接、转化,插入pcDNA3.1(+)-EGFP真核表达载体,并通过脂质体将TEM8表达质粒转染至HEK293F细胞中,Western印迹检测TEM8的表达。结果:PCR扩增得到TEM8基因,构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-TEM8-EGFP并转染HEK293F细胞,经G418加压筛选及有限稀释法得到生长性状良好、表达效率高的单克隆细胞系TEM8-EGFP/HEK293F;Western印迹证明过表达细胞系TEM8-EGFP/HEK293F显著表达TEM8蛋白。结论:构建了表达TEM8的重组HEK293F工程细胞系TEM8-EGFP/HEK293F,为进一步研究TEM8的生理功能奠定了基础。

肿瘤内皮标志物(TEM8)及其与肿瘤关系的研究进展

根据Parkin等[1]报道,预计到2020年,全球恶性肿瘤新发病例和死亡病例将达到2 000万和1 200万,癌症即成为人类健康的第一杀手。传统的放、化疗疗效都非常有限,且常伴有难以忍受的不良反应,因此迫切需要新的诊治手段。

抗人肿瘤内皮标志物1 ( TEM1)抗体的表达及活性鉴定

目的构建抗人肿瘤内皮标志物1(TEM1)全抗体IgG78的真核表达载体,进行表达纯化后鉴定其生物学活性。方法利用PCR分别从单链抗体ScFv78中扩增TEM1抗体的轻、重链可变区基因,并克隆入带有小鼠抗体恒定区的真核表达载体Bichim-L,瞬时转染HEK293F细胞,表达产物用蛋白G亲和层析柱进行纯化,所得蛋白用SDS-PAGE和Western blot法进行鉴定,采用流式细胞术和活细胞ELISA检测该抗体与TEM1阳性细胞的结合特异性及亲和力。结果成功构建了TEM1全抗体IgG78的真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达。SDS-PAGE和Western blot法证实目的蛋白符合预期大小,流式细胞术及细胞ELISA结果显示该抗体可特异性结合TEM1阳性肿瘤细胞,且有较高的亲和力。结论成功获得了一株具有良好结合特异性和较高亲和力的TEM1抗体。

沉默肿瘤内皮标志物8基因对XWLC-05肺癌细胞活性的影响

目的探讨沉默肿瘤内皮标志物8(TEM8)基因对XWLC-05肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法将XWLC-05肺癌细胞随机分为3组:空白组(空白试剂)、第1转染组和第2转染组,按照Lipofectamine 2000说明,后2组分别转染TEM8阴性对照物和TEM8 siRNA。用MTT法检测XWLC-05细胞增殖能力(OD值),用Transwell小室检测XWLC-05细胞侵袭能力,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率。结果转染后48 h时,空白组、第1转染组和第2转染组的增殖能力分别为0.93±0.15,0.94±0.16和0.39±0.12;上述3组的穿膜细胞数分别为(93±8),(95±12)和(38±8)个;上述3组细胞凋亡率分别为(2.48±0.24)%,(2.51±0.38)%和(9.24±0.35)%。第1转染组与空白组比较,上述指标差异均无统计学意义(均P>0.05);第2转染组与第1转染组和空白组比较,上述指标差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论沉默TEM8可降低XWLC-05细胞的增殖、迁移和侵袭,增加XWLC-05细胞凋亡,可能成为肺癌治疗的新靶点。

肿瘤血管内皮标志物的研究进展

肿瘤血管内皮标志物（tumor endothelial markers,TEMs）是近年来在使用基因微阵列技术对肿瘤和非肿瘤的血管内皮进行比较时发现的,其在肿瘤组织中的特异表达模式及跨细胞膜定位的独特结构对于肿瘤的诊断、预后和靶向治疗具有重要意义。现对TEMs的研究进展进行综述。

肿瘤内皮标志物8蛋白在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义

目的探讨肿瘤内皮标志物8(tumor endothelial marker 8,TEM8)蛋白在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)及癌旁正常肺组织中的表达特点及其临床意义。方法采用免疫组织化学法检测110例NSCLC及30例癌旁正常肺组织中TEM8蛋白的表达,并分析TEM8表达与临床病理特征及预后的关系。结果TEM8在NSCLC中的阳性率(52.72%)明显高于癌旁正常肺组织(6.67%)(P<0.01),TEM8的表达与NSCLC的肿瘤分化程度、TNM分期(T指原发灶的情况,N指区域淋巴结受累情况,M指远处转移)和有无淋巴结转移相关(P<0.05)。Kaplan-Meier生存分析显示NSCLC中TEM8蛋白表达与患者术后总生存率呈负相关(P<0.05)。结论 TEM8高表达与NSCLC的进展和预后显著相关,可作为NSCLC患者预后判断的指标。

肿瘤内皮细胞标志物1在卵巢癌诊疗中作用的研究进展

卵巢癌是一种常见的妇科恶性肿瘤,具有发病率高、致死率高的特点。由于其发病隐蔽且缺乏有效检测手段,确诊时一般已处于中晚期,因此提高卵巢癌早期诊断率可有效提高患者的预后及生存率。肿瘤内皮细胞标志物1(tumor endothelial marker 1,TEM1)是一种新近发现的卵巢癌特异性肿瘤标志物,其表达于卵巢癌细胞表面,而在正常组织中不表达或仅极低表达。该特点使TEM1成为极具潜能的卵巢癌诊断和治疗的新靶点。应用TEM1的特异性抗体结合影像学、基因工程学等技术,无论在卵巢癌影像以及治疗方面都显示出了极好的抗肿瘤效果。同时大量基于靶向TEM1的临床试验正在进行中。本文综述TEM1的发现、结构、组织表达以及其在卵巢癌诊断及治疗中的研究进展,以期为卵巢癌的治疗提供新思路。

肿瘤血管内皮抗原TEM8的HLA-2.1限制性低亲和性CTL表位预测及改造分析

目的 初步筛选肿瘤血管内皮标志物8(tumorendothelialmarker 8,TEM 8)HLA A2 1限制性低亲和性CTL表位,并预测修饰后的表位与HLA A2 1之间亲和性的变化。方法 采用超基序、3D QSAR、蛋白酶解预测等相结合的办法筛选HLA A2 1限制性低亲和性CTL表位,并通过氨基酸置换适当修饰,最后对部分候选的多肽进行分子动力学模拟。结果 筛选出8个低亲和性CTL候选表位,经修饰后的表位与HLA A2 1之间的亲和性均有不同程度的提高。结论 初步预测和修饰的表位系列可为下一步实验提供了依据。

TEM8在恶性肿瘤中的研究进展

肿瘤内皮细胞标志物8(TEM8)是一种高度保守的单次跨膜糖蛋白。TEM8是肿瘤内皮标志物家族中较为特别的一员,首次发现于结肠癌组织中,研究表明TEM8在多种恶性肿瘤细胞与肿瘤血管内皮特异性表达,并参与肿瘤增殖、血管形成等恶性生物学行为,是一些恶性肿瘤早期诊断和预后的生物标志物,并可作为恶性肿瘤治疗新靶点。该文将介绍TEM8在恶性肿瘤中的作用机制以及其在临床中的应用进展。

鼻咽癌相关内皮细胞的诱导及其鉴定

目的:通过体外共培养模型,利用人鼻咽癌(NPC)细胞株(5-8F)诱导肿瘤相关人淋巴管内皮细胞(C-HLEC)及肿瘤相关人脐静脉内皮细胞(C-HUVEC)形成,分析其形态学上及相关基因表达的变化。方法:建立两种共培养体系,即嵌入式细胞共培养体系和条件培养基(CM)共培养体系,将5-8F分别与两种内皮细胞(HLEC和HUVEC)共培养,倒置相差显微镜观察共培养后内皮细胞形态学变化,实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测共培养后两种内皮细胞中肿瘤内皮标志物8(TEM8)的表达,划痕实验检测共培养后两种内皮细胞的迁移能力,小管形成实验检测共培养后两种内皮细胞成管能力。结果:与对照组比较,共培养后的两种内皮细胞,形态伸长、触角增多,变成多角形,细胞间连接疏松,细胞结构紊乱,TEM8 mRNA表达水平升高(P<0.05),且迁移能力及成管能力均明显增强(P<0.05)。结论:与NPC 5-8F细胞共培养,可促进淋巴管及血管内皮细胞向肿瘤相关内皮细胞(TECs)转化,转化后细胞迁移能力和成管能力增强、TEM8表达上调。

TEM7在胃癌组织和癌旁组织表达及其与患者临床病理特征的关系

目的 探讨肿瘤血管内皮标志物(TEM)7在胃癌组织和癌旁组织中表达及其与患者临床病理特征及预后的关系。方法 选取行胃癌根治术的胃癌患者122例,采用免疫组织化学染色法检测TEM7在胃癌组织和癌旁正常组织中表达,分析TEM7表达与临床病理特征及预后的关系。结果 胃癌组织中TEM7阳性表达率显著高于癌旁正常组织(χ^(2)=21.252,P<0.001)。TEM7阳性表达与肿瘤分化程度、肿瘤浸润胃壁、临床分期及淋巴结转移有关(P<0.05),与患者性别、年龄、癌变部位、肿瘤直径及术后是否辅助治疗无关(P>0.05)。生存曲线显示,TEM7阳性表达患者中位无进展生存时间显著短于TEM7阴性表达患者(Log-rankχ^(2)=8.820,P=0.003);TEM7阳性表达患者总生存时间显著短于TEM7阴性表达患者(Log-rankχ^(2)=5.506,P=0.019)。Cox比例风险回归分析显示,TEM7阳性表达是胃癌患者术后总生存期和无进展生存期的独立风险因素(HR=4.178、5.613,95%CI为1.654~10.836、1.668~17.143,均P<0.05)。结论 TEM7阳性表达与胃癌患者临床病理特征和预后密切相关,可作为评估病情进展及预后的重要分子生物学指标。

过表达miR-488-5p通过靶向TEM8降低宫颈癌C33A细胞的增殖和迁移能力

目的:探讨miR-488-5p在宫颈癌组织中的表达及对宫颈癌C33A细胞增殖和迁移能力的影响。方法:收集2017年3月至2017年9月郑州大学附属洛阳中心医院妇科全子宫切除术12例宫颈癌组织及相应的癌旁组织,qRT-PCR检测癌组织中miR-488-5p的表达。利用Lipofectamine 3000转染miR-488-5p和miR-NC至宫颈癌C33A细胞,分为实验组和对照组。流式细胞术检测两组细胞周期分布,CCK-8法检测两组细胞增殖能力,Transwell检测两组细胞迁移能力。生物信息学软件预测miR-488-5p可能的靶基因,荧光素酶活性实验验证miR-488-5p与靶基因的结合作用。qRT-PCR和Western blotting检测两组细胞中肿瘤内皮标志物8(tumor endothelial marker 8, TEM8)及下游EGFR信号通路相关蛋白的表达水平。结果:宫颈癌组织中miR-488-5p相对表达量明显低于癌旁组织(1.33±0.20 vs 3.68±0.45, P<0.01),实验组细胞中miR-488-5p相对表达量明显高于对照组(25.23±3.11 vs 1.02±0.10, P<0.01),实验组C33A细胞在G0/G1期的细胞比例明显高于对照组(P<0.01);当C33A细胞生长至96和120 h,实验组细胞增殖水平明显低于对照组(P<0.05)。同时实验组的细胞迁移细胞数明显低于对照组(P<0.01)。miR-488-5p可直接结合TEM8 mRNA并抑制其表达(P<0.01)。实验组细胞中TEM8 mRNA相对表达量明显低于对照组(0.42±0.06 vs 1.00±0.06, P<0.01)。C33A细胞转染miR-488-5p 48 h后,TEM8、p-EGFR、p-ERK、p-AKT蛋白表达明显低于对照组(P<0.01)。结论:宫颈癌组织中miR-488-5p的表达量下降,过表达miR-488-5p能够抑制宫颈癌细胞周期的进展,降低宫颈癌细胞的增殖和迁移能力,其机制可能与靶向干扰TEM8基因的表达有关。

微小RNA-664a-3p在乳腺癌组织的表达及对乳腺癌细胞生物学行为的影响

目的观察微小RNA-664a-3p(miR-664a-3p)在乳腺癌组织中的表达及其对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法提取16例乳腺癌手术标本及其癌旁组织中总RNA,使用荧光实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测miR-664a-3p在乳腺癌及其癌旁组织中的表达量,并检测miR-664a-3p在4种乳腺癌细胞株(T47D、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7)及正常乳腺上皮细胞MCF-10A中的表达。选取miR-664a-3p表达水平最低的乳腺癌细胞瞬时转染miR-664a-3p模拟物(实验组)或miR-NC(对照组)。qPCR检测转染后细胞中miR-664a-3p的表达。生物信息学软件预测miR-664a-3p的靶基因。使用荧光素酶报告基因实验检测miR-664a-3p对靶基因肿瘤内皮标志物8(TEM8)的靶向作用。qPCR和Western blot法检测TEM8及下游基因的表达。流式细胞术检测细胞周期,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测细胞增殖能力,Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果乳腺癌组织中miR-664a-3p的表达量显著低于癌旁组织(P<0.01)。乳腺癌细胞株中miR-664a-3p的表达量显著低于正常乳腺上皮细胞(P<0.05),其中T47D细胞的表达量最低(P<0.05)。实验组和对照组T47D细胞中miR-664a-3p的表达量分别为24.87±2.17和1.02±0.10(P<0.01)。miR-664a-3p可与TEM8-3'-非编码区(UTR)特异性结合(P<0.01)。与对照组比较,实验组中TEM8 mRNA及蛋白表达下调(P<0.05)。转染miR-664a-3p能够显著抑制T47D细胞周期的进展(P<0.05),降低细胞的增殖能力(P<0.01),抑制细胞的侵袭能力(P<0.01)。结论miR-664a-3p在乳腺癌组织和细胞株表达下调,过表达miR-664a-3p能够通过靶向抑制TEM8基因的表达,抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。

TEM8在卵巢癌血管生成和侵袭迁移中的分子机制研究

目的:探讨肿瘤内皮细胞标志物8(tumor endothelial marker 8,TEM8)在卵巢癌血管生成和侵袭迁移中的分子机制。方法:体内实验中,选取4~5周龄SPF级BALB/C雌性小鼠20只,按随机原则分为两组,每组10只。分别将对照组细胞与实验组细胞接种于小鼠建立人卵巢癌皮下移植瘤模型。通过游标卡尺测量模型建立后各时期的肿瘤体积,2周后处死小鼠并分离皮下卵巢癌肿瘤组织并称重。通过反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察各组组织中TEM8、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及CD34的表达水平。体外实验中,分别将处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)与转染了siRNA-TEM8的HUVEC细胞分为对照组及实验组,通过血管生成实验观察各组癌组织细胞的血管生成情况;通过Transwell试验观察各组癌组织细胞的侵袭迁移能力。结果:通过siRNA沉默TEM8后,实验组小鼠肿瘤体积及重量均小于对照组(P<0.05)。血管生成实验结果显示实验组小鼠血管生成数量明显少于对照组(P<0.05);Transwell试验显示,实验组迁移细胞数量与对照组相比较少(P<0.05);RT-PCR结果显示,实验组小鼠卵巢癌组织中TEM8、VEGF与CD34水平均明显低于对照组(P<0.05)。结论:TEM8能够促进卵巢癌血管生成,增强其侵袭迁移能力。

hTEM8-N-RFP融合蛋白真核表达载体的构建及在HEK293F细胞中表达

目的:构建人肿瘤内皮标志物8(hTEM8)胞外区(N端)与红色荧光蛋白(RFP)融合表达载体并在HEK293F细胞中表达,为进一步研究hTEM8的相互作用蛋白及其在肿瘤血管形成过程中的机制奠定实验基础。方法:以质粒pDsRed-Express-C1和重组质粒pcDNA3.1(+)-hTEM8/Fc为模板,PCR扩增RFP和hTEM8-N基因片段,先后插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP,转染HEK293F细胞,通过荧光显微镜观察融合蛋白在转染细胞中的的表达,并用G418对转染的细胞进行加压筛选,Western blot检测hTEM8-N-RFP融合蛋白在转染细胞中的表达。结果:DNA测序、酶切鉴定的结果显示,表达载体pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP构建成功,且序列正确。转染后经荧光显微镜观察到HEK293F细胞中有红色荧光,经加压筛选单克隆后,在荧光显微镜下观察到稳定表达红色荧光的细胞株,Western blot检测到融合蛋白hTEM8-N-RFP在真核细胞HEK293F中获得表达。结论:成功构建了pcDNA3.1(+)-hTEM8-N-RFP真核表达载体,并在HEK293F细胞中表达,为后期研究hTEM8的相互作用蛋白和其生理功能奠定了良好的基础。