肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白在暴发型肝衰竭肝组织中的表达

目的 研究肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白 (TRADD)在暴发性肝衰竭小鼠动物模型肝组织中的表达、分布及在发病机制中的作用。方法 尾静脉注射肿瘤坏死因子α(TNFα)于D 氨基半乳糖 (GalN)致敏的BALB/c小鼠 ,造成暴发性肝衰竭模型 ,用脱氧核糖核酸转移酶介导的缺口原位末端标记 (ISEL )技术、琼脂糖凝胶电泳检测肝组织DNA梯带观察肝细胞凋亡 ,Envision两步免疫组织化学方法检测TRADD蛋白在肝组织中的表达及分布。结果 对照组、GalN组和TNFα组肝细胞各时点基本没有或有少量TRADD蛋白表达 ,而GalN +TNFα组在 3 .5h时点就有明显表达 ,此时肝细胞凋亡不明显 ,6h时点TRADD蛋白表达最为明显 ,9h时点 ,肝细胞凋亡和坏死非常明显 ,而TRADD蛋白表达虽然很明显 ,但低于 6h时点。TRADD蛋白阳性率分别为 1.3 % ( 1.5h)、3 .0 % ( 3 .5h)、2 3 .4% ( 6h)和 18.6% ( 9h)。结论 TNFα介导的小鼠暴发性肝衰竭动物模型中 ,TRADD蛋白表达增加 ,TRADD蛋白表达先于肝细胞凋亡 ,TRADD蛋白表达和肝细胞凋亡在一定程度上呈正相关 ,提示TNFα通过上调TRADD蛋白表达介导肝细胞凋亡和坏死进而诱发暴发性肝衰竭。

肿瘤坏死因子Ⅰ型受体及其在细胞增殖和凋亡调节中的作用研究进展

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）及其受体（tumor necrosis factor receptor,TNFR）在机体生命活动中发挥重要作用,对TNF/TNFRs的功能和起源的研究经历了相当长的时间[1]。这个历史可以追溯到19世纪后期,当时观察到人类感染某些细菌后出现某些肿瘤的退化现象。这些结果导致肿瘤学家W Coley用命名为＂Coley＇s toxin＂的细菌提取物治疗人类癌症[2]。

肿瘤坏死因子受体相关蛋白1对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制

目的探讨肿瘤坏死因子受体相关蛋白1（TRAP1）对大鼠缺氧心肌细胞保护作用的机制。方法取1～3d龄SD大鼠乳鼠，分离培养心肌细胞，用于以下实验。（1）取细胞，按随机数字表法（分组方法下同）分为TRAP1组和对照组，提取细胞总蛋白。TRAP1组细胞总蛋白加入小鼠抗大鼠TRAP1单克隆一抗，对照组细胞总蛋白加入小鼠来源的同型IgG，免疫共沉淀法和蛋白质谱分析检测TRAP1可能作用的蛋白。（2）取细胞，分为常氧空白对照组、常氧＋TRAP1干扰对照组、常氧＋TRAP1干扰组、常氧＋TRAP1过表达对照组、常氧＋TRAP1过表达组，每组1孔。常氧空白对照组细胞常规培养，后4组细胞分别加入TRAP1RNA干扰空病毒载体、TRAP1RNA干扰腺病毒载体、TRAP1过表达空病毒载体、TRAP1过表达腺病毒载体。另取细胞，分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1干扰组、缺氧＋TRAP1过表达对照组、缺氧＋TRAP1过表达组，每组1孔。各缺氧组细胞同前对应的常氧组细胞处理后，缺氧6h。实时荧光定量RT—PCR检测各组细胞中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ（COXⅡ）mRNA表达。本实验重复3次。（3）取细胞，分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1过表达对照组、缺氧＋TRAP1过表达组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰对照组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰组，每组3孔。前4组细胞的处理同（2），后2组细胞分别加入COXⅡRNA干扰空病毒载体、COXⅡRNA干扰腺病毒载体转染后，再分别加入TRAP1过表达腺病毒载体。细胞计数试剂盒8及酶标仪检测细胞增殖活性，碘化丙啶和Hoechst33342染色检测细胞死亡率。另取细胞，分为常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1干扰组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达对照组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达组，每组3孔，前4组细胞的处理同（2），后2组细胞均加入TRAP1RNA干扰腺病毒载体转染后，再分别加入COXⅡ过表达空病毒载体、COXⅡ过表达腺病毒载体，同前检测细胞增殖活性和死亡率。本实验重复3次。对数据行单因素方差分析、LSD检验。结果（1）TRAP1组细胞有TRAP1表达，对照组细胞未见TRAPI表达。TRAP1可能作用的3个蛋白是角蛋白、COXⅡ和预测分子量为13×10^3的未知蛋白。（2）与常氧空白对照组比较，常氧＋TRAP1干扰对照组、常氧＋TRAP1过表达对照组细胞COXⅡmRNA表达量无明显变化（P值均大于0．05），常氧＋TRAP1干扰组细胞COXⅡmRNA表达量明显降低（P〈0．01），常氧＋TRAP1过表达组细胞COXⅡmRNA表达量明显升高（P〈0．01）。缺氧空白对照组细胞COXⅡmRNA表达量较常氧空白对照组明显降低（P〈0．01）。与缺氧空白对照组比较，缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1过表达对照组细胞COXⅡmRNA表达量无明显变化（P值均大于0．05），缺氧＋TRAP1干扰组细胞COXⅡmRNA表达量明显下降（P〈0．01），缺氧＋TRAP1过表达组细胞COXⅡmRNA表达量明显升高（P〈0．01）。（3）常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1过表达对照组、缺氧＋TRAP1过表达组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰对照组、缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰组细胞增殖活性分别为0．498±0．022、0．303±0．018、0．313±0．032、0．456±0．03l、0．448±0．034、0．335±0．026，细胞死亡率分另0为（4．7±1．5）％、（24．7±3．1）％、（26．0±2．7）％、（13．3±2．5）％、（12．7±2．1）％、（21．0±1．7）％。与常氧空白对照组比较，缺氧空白对照组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加（P值均小于0．01）。与缺氧空白对照组比较，缺氧＋TRAP1过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化（P值均大于0．05），缺氧＋TRAP1过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低（P值均小于0．01）。与缺氧＋TRAP1过表达组比较，缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化（P值均大于0．05），缺氧＋TRAP1过表达＋COXⅡ干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加（P值均小于0．01）。（4）常氧空白对照组、缺氧空白对照组、缺氧＋TRAP1干扰对照组、缺氧＋TRAP1干扰组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXII过表达对照组、缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达组细胞增殖活性分别为0．444±0．025、0．275±0．016、0．283±0．021、0．150±0．009、0．135±0．011、0．237±0．017，细胞死亡率分别为（3．7±0．6）％、（21．0±2．7）％、（20．3±3．1）％、（31．7±2．5）％、（33．3±3．2）％、（19．3±1．5）％。与缺氧空白对照组比较，缺氧＋TRAP1干扰对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化（P值均大于0．05）。与缺氧空白对照组和缺氧＋TRAP1干扰对照组比较，缺氧＋TRAP1干扰组细胞增殖活性降低、细胞死亡率增加（P值均小于0．01）。与缺氧＋TRAP1干扰组比较，缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达对照组细胞增殖活性、细胞死亡率均无明显变化（P值均大于0．05），缺氧＋TRAP1干扰＋COXⅡ过表达组细胞增殖活性升高、细胞死亡率降低（P值均小于0．01）。结论TRAP1能够正向调节COXⅡmRNA表达，COXⅡ是TRAP1保护缺氧心肌细胞的下游效应分子。

LMP1经TRADD促进鼻咽癌SP18细胞增殖

目的:探讨潜伏性膜蛋白1(LMP1)羧基末端活化区2(CTAR2)的肿瘤坏死因子受体相关死亡结构域(TRADD)在鼻咽癌SP18细胞增殖中的作用及机制。方法:首先建立表达LMP1及CTAR2突变型LMP1(LMP1^(TRADD))的SP18细胞系。其次采用细胞生长曲线、平皿集落形成实验、软琼脂集落实验和流式细胞术观察LMP1^(TRADD)对SP18细胞增殖的影响。然后选用基因芯片检测SP18-LMP1和SP18-LMP1^(TRADD)细胞间的差异表达基因。结果:细胞生长曲线、软琼脂集落和平皿集落形成实验结果均显示,SP18-LMP1细胞生长与集落形成能力均较SP18-LMP1^(TRADD)细胞强(P<0.01)。流式细胞术检测结果显示,SP18-LMP1细胞的增殖指数较SP18-LMP1^(TRADD)细胞高(P<0.01)。筛选出63个增殖相关基因,其中SP18-LMP1^(TRADD)细胞中上调的基因33个,下调的基因30个。结论:TRADD活性区是LMP1促进SP18细胞增殖的重要功能活性位点。LMP1可能通过TRADD提高细胞增殖指数,诱导SP18细胞增殖。

融合蛋白TNFR1/DED介导舌癌细胞凋亡的实验研究

目的 :构建含FADD及TNFR1基因功能结构域的融合基因TFL ,稳定转染入舌癌细胞后 ,通过体内、外实验初步观察融合蛋白TNFR1/DED在重组人肿瘤坏死因子 α(rhTNF α)作用下介导舌癌细胞凋亡的效应。方法 :反转录及重组PCR构建融合基因TFL ;鉴定融合蛋白TNFR1/DED在建系舌癌细胞T TFL中的表达 ,通过MTT法、形态学观察、DAN片段及体内抑瘤实验 ,观察融合蛋白TNFR1/DED介导舌癌细胞凋亡的效应。结果 :获得了人FADD及TNFR1基因并构建成功融合基因TFL ,转染入Tca 8113细胞后 ,能表达融合蛋白TNFR1/DED活性 ,体外实验观察到rhTNF α可有效地杀伤舌癌细胞 ,体内可明显抑制移植瘤的生长 ,且荷瘤动物内脏器官无病理性改变。结论 :融合蛋白TNFR1/DED可有效地介导舌癌细胞凋亡 ,为舌癌基因治疗研究提供实验基础。

利用酵母双杂交系统筛选TRADD的互作牛分枝杆菌蛋白

为研究牛分枝杆菌抑制肿瘤坏死因子介导的细胞凋亡来逃避宿主免疫反应的机制,本试验采用酵母双杂交系统在牛分枝杆菌中筛选可与肿瘤坏死因子受体1相关死亡域蛋白(TRADD)相互作用的蛋白。通过限制性内切酶Sau3AⅠ部分消化牛分枝杆菌基因组,回收片段随机插入pGADT7载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,构建牛分枝杆菌基因组文库。PCR扩增人tradd基因,将扩增产物克隆于pGBKT7载体上,构建重组诱饵质粒pGBKT7-tradd,转化酵母菌Y2HGold。用诱饵质粒pGBKT7-tradd对牛分枝杆菌基因组文库进行筛选,以获得与TRADD互作的阳性候选克隆;提取阳性候选克隆中的质粒,经测序和同源性比对分析,获得与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白的生物学信息。结果显示,构建的文库滴度为2×10~6 CFU,平均插入片段在1.5kb左右,文库重组率>95%。经Western blotting验证,诱饵质粒pGBKT7-tradd可在酵母菌中表达诱饵蛋白TRADD,且TRADD的表达对酵母菌无毒性,不会在酵母菌中自激活。应用酵母双杂交系统初步筛选出20个与TRADD互作的阳性克隆,经复筛、测序和BLAST对比,最终发现7个基因序列。本研究应用酵母双杂交技术成功筛选到7个与TRADD互作的牛分枝杆菌蛋白,为进一步研究牛分枝杆菌对细胞凋亡的抑制机制提供线索。

TRADD基因外显子的拼接及重组腺病毒的构建

目的构建含有人TRADD基因片段的重组腺病毒载体。方法从人肝组织中提取总RNA,逆转录得到cDNA。按照TRADD基因4个外显子的基因序列设计引物,分别扩增得到4个外显子的基因片段。对4个外显子进行基因拼接,得到全长的TRADD片段。利用AdEasy系统构建TRADD重组腺病毒,测定病毒滴度,并转染成纤维细胞。结果拼接成功939kb的TRADD基因,行PCR扩增重组腺病毒中TRADD基因,在略小于1000kb处见到明显的TRADD条带。结论构建成功的含有TRADD基因片段的重组腺病毒,可用于转染人成纤维细胞,用于检测TRADD对病理性瘢痕成纤维细胞的影响。

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的cDNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101bp,3′非编码区144bp和开放阅读框(ORF)591bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。

矽肺病患者肺泡巨噬细胞死亡受体表达及意义

目的探讨矽肺病患者肺泡巨噬细胞(AM)死亡受体(DR)的表达水平及其与肺纤维化程度的关系。方法以61例进行肺灌洗的汉族男性观察对象及矽肺病患者为观察组,以13例肺部X射线表现完全正常的汉族男性为对照组,分离、纯化及培养各研究对象的AM,检测3种DR[凋亡蛋白-1(Fas)、肿瘤坏死因子受体-1(TNFR1)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体受体-2]的表达水平,采用酶联免疫吸附试验检测AM培养上清中的可溶性DR(sDR)水平,采用免疫印迹法检测AM裂解液中3种膜结合型DR(mDR)水平,分析DR表达水平与粉尘接触各因素的关系。结果矽肺病患者膜结合型Fas(mFas)及膜结合型TNFR1(mTNFR1)的相对水平均高于对照组及观察对象(P<0.05),且随着肺部病变的加重而升高;矽肺病患者可溶性Fas(sFas)及可溶性TNFR1(sTNFR1)水平均低于观察对象(P<0.05),且sFas随着肺部病变的加重而下降。结论矽尘诱导的mFas和mTNFR1表达上调、sFas表达下调在矽肺病发病及进展中起重要作用,DR信号通路活化可能是矽肺病发病的重要机制之一。